鄭信詩，尚鵬祥，李景遠，丁新倫，吳祖建，張潔

福建農(nóng)林大學植物保護學院植物病毒研究所/閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點實驗室/福建省植物病毒學重點實驗室，福州 350002

0 引言

【研究意義】雙生病毒科（Geminiviridae）病毒是一類植物單鏈環(huán)狀 DNA病毒，世界上的熱帶、亞熱帶等地區(qū)均有分布，為典型的雙聯(lián)體顆粒形態(tài)，大小約22 nm×38 nm[1-2]。雙生病毒的寄主范圍廣闊，能夠侵染多種單子葉及雙子葉植物，由煙粉虱、葉蟬等昆蟲介體以持久性方式進行傳播，對世界各地的農(nóng)作物造成重大經(jīng)濟損失[3-5]。菜豆金黃花葉病毒屬（Begomovirus）是雙生病毒科最大的屬，從基因結(jié)構(gòu)上分成了單組分begomovirus與雙組分begomovirus[1]。木爾坦棉花曲葉病毒（cotton leaf curl Multan virus，CLCuMuV）是單組分 begomovirus，基因組僅含DNA-A，伴隨一個β衛(wèi)星分子（betasatellite）[6-7]。自2006年在我國發(fā)現(xiàn)由CLCuMuV侵染引起的朱槿曲葉病以來[7]，該病毒已經(jīng)在我國江蘇、福建、海南、廣西、廣東等省（自治區(qū)）多個地區(qū)發(fā)生，可侵染棉花、黃秋葵、扶桑及垂花懸鈴花等多種寄主植物[8-13]。CLCuMuV可以隨昆蟲介體煙粉虱及帶病苗木傳播，對我國的棉花產(chǎn)區(qū)造成潛在威脅[7,12]?！厩叭搜芯窟M展】CLCuMuV基因組的DNA-A大約2.7—2.8 kb，含6個ORF，2個在病毒鏈方向，編碼V1和V2蛋白，4個在互補鏈方向，編碼C1、C2、C3和C4蛋白[6-13]。CLCuMuV伴隨的β衛(wèi)星分子，僅編碼一個βC1蛋白，β衛(wèi)星依賴DNA-A組分進行復制[11-12,14-16]。雙生病毒C4編碼11.3 kD蛋白，是一個癥狀決定因子，可編碼復制或轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，影響植物正常細胞發(fā)育，引起葉脈腫大等癥狀，也具有沉默抑制子活性[17-20]。2018年，ISMAYIL等發(fā)現(xiàn)CLCuMuV C4通過抑制S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）活性來抑制轉(zhuǎn)錄水平基因沉默（TGS）和轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默（PTGS），從而增強植物中CLCuMuV的侵染[21]?！颈狙芯壳腥朦c】通過對NCBI登錄的多個CLCuMuV分離物的序列進行分析，發(fā)現(xiàn)不同CLCuMuV C4開放閱讀框附近可編碼不同大小的ORF，而NCBI數(shù)據(jù)庫登錄的C4蛋白大小也不盡相同，甚至利用NCBI ORF Finder在線分析軟件在部分CLCuMuV分離物中找不到目前公認的最小ORF，鑒于此，本研究對CLCuMuV的多個假定的“C4 ORF”編碼的蛋白進行分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分析C4附近不同ORF對病毒致病性的影響，為C4開放閱讀框的確切定位提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于 2018—2019年在福建農(nóng)林大學植物病毒研究所完成。

1.1 材料及主要試劑

CLCuMuV感病植株總DNA（CLCuMuV DNA-A的序列登錄號為 JX861210，DNA-β序列登錄號為JX861211）、PVX 載體、pDONR221載體、pEarleyGate-101載體、pBINPLUS載體、農(nóng)桿菌（Agrobacterium）GV3101 感受態(tài)、大腸桿菌（Escherichiacoli）Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)、YFP-C4-S載體、DNA-β侵染性克隆重組質(zhì)粒農(nóng)桿菌、CLCuMuV C4蛋白多克隆抗體、本氏煙（Nicotianabenthamiana）種子均由本實驗室保存。

同源重組酶試劑盒（ClonExpressTMUltra One Step Cloning Kit）和高保真酶試劑盒（PhantaTMSuper-Fidelity DNA Polymerase）均購自南京諾唯贊生物科技有限公司，Gateway LR/BP Clonase II Enzyme Mix試劑盒購自Invitrogen公司。

本研究所用到的引物序列見表1。

1.2 載體構(gòu)建

1.2.1 PVX載體構(gòu)建 以實驗室保存CLCuMuV感病植株總DNA為模板，根據(jù)NCBI登錄的CLCuMuV DNA-A序列設計CLCuMuV C4 L、M、S的ORF特異性擴增引物（表1）。PCR反應條件為95℃預變性5 min，95℃變性 30 s，50℃退火 35 s，72℃延伸 30 s，30個循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸5 min。將反應產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，目的條帶經(jīng)由 DNA凝膠純化試劑盒回收純化。通過同源重組的方法，將回收純化的片段與線性化PVX載體（SmaI 37℃ 酶切70 min）進行連接。熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌后利用引物PVX-F/PVX-R（表1）篩選陽性克隆，即獲得最終植物表達載體 PVX-C4-L、PVX-C4-M、PVX-C4-S。測序結(jié)果正確的提取質(zhì)粒電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，PCR檢測陽性克隆。

1.2.2 亞細胞定位載體構(gòu)建 利用設計的特異性引物（表 1）對所需片段進行 PCR擴增并回收。利用Gateway系統(tǒng)BP反應構(gòu)建中間載體，將回收的片段與pDONR221載體重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。利用引物M13-F/M13-R（表1）篩選陽性克隆并進行測序驗證，然后提取質(zhì)粒，MluI酶切中間載體并回收大片段，通過LR反應將其構(gòu)建至終載體pEarleyGate-101并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，利用引物Gateway-F/Gateway-R（表1）鑒定陽性克隆，即獲得最終植物表達載體YFP-C4-L。將終載體用電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，PCR檢測陽性克隆。

1.2.3 侵染性克隆載體構(gòu)建 根據(jù) CLCuMuV基因組的序列，設計引物CLCuMuV-R-F/R與CLCuMuVL-F/R（表1）分別擴增其全長基因組和缺失基因組，延伸時間為170 s，擴增得到均為2 700 bp左右條帶，PCR產(chǎn)物進行回收純化；將pBINPLUS空載用限制性內(nèi)切酶Hind III和SmaI線性化，通過同源重組，將回收純化的目的條帶與回收純化的線性化pBINPLUS克隆載體連接，獲得重組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)到大腸桿菌中，利用引物pBIN-F/pBIN-R（表1）進行陽性克隆檢測，測序結(jié)果正確的克隆進行質(zhì)粒提取，即為侵染性克隆重組質(zhì)粒CLCuMuV。將終載體用電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，PCR檢測陽性克隆。

1.2.4 侵染性克隆突變載體構(gòu)建 獲得的重組質(zhì)粒CLCuMuV為模板，用限制性內(nèi)切酶BamH I和SmaI將未缺失基因組切下，PCR產(chǎn)物回收純化后作為模板，利用引物C4L-i2o-R-pBIN-F/CLCuMuV-R-R、C4L-i2o-R-pBIN-R/CLCuMuV-R-F、C4S-G2O-R-pBIN-F/CLCuMuVR-R、C4S-G2O-L-pBIN-R/CLCuMuV-R-F（表 1）分別擴增片段并回收，回收片段命名為C4-L-1、C4-L-2、C4-S-1、C4-S-2；利用引物 CLCuMuV-R-R/CLCuMuVR-F（表 1）將 C4-L-1和 C4-L-2、C4-S-1和 C4-S-2分別進行同源重組，構(gòu)建C4-ΔL和C4-ΔS的突變片段，將PCR產(chǎn)物回收純化；用限制性內(nèi)切酶BamH I和SmaI對CLCuMuV侵染性克隆載體進行酶切，將其回收純化；通過同源重組，使用兩組引物 CLCuMuVRBamH1-pBIN-F/C4L-i2o-R-pBIN-R、CLCuMuVRBamH1-pBIN-F/C4S-G2O-L-pBIN-R 分別將 C4-ΔL和 C4-ΔS與線性化的 CLCuMuV侵染性克隆載體連接；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)到大腸桿菌中，利用引物 pBIN-F/pBIN-R（表1）進行陽性克隆檢測，測序結(jié)果正確的克隆進行質(zhì)粒提取，即為突變體侵染性克隆重組質(zhì)粒CLCuMuV-ΔL、CLCuMuV-ΔS。其中 CLCuMuV-ΔL和CLCuMuV-ΔS分別將C4-L和C4-S ORF第2位氨基酸突變?yōu)榻K止密碼子。將終載體用電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，PCR檢測陽性克隆。

表1 本研究中所用引物序列Table 1 Primers used in this study

1.3 農(nóng)桿菌介導的植物接種

將新鮮培養(yǎng)的陽性克隆農(nóng)桿菌菌液離心去除上清后，加入新鮮配置的煙草浸潤緩沖液（10 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1MES pH 5.7、200 μmol·L-1AS），調(diào)整其OD600≈1.0，室溫下靜置3—4 h后接種長至5—6片葉的本氏煙。接種后的植株培養(yǎng)于26℃、14 h光照/10 h黑暗的光照培養(yǎng)箱。侵染性克隆接種試驗中需將重組質(zhì)粒農(nóng)桿菌分別與 DNA-β重組質(zhì)粒農(nóng)桿菌等比例混合接種本氏煙。

1.4 激光共聚焦顯微鏡觀察

浸潤48 h后，剪取浸潤區(qū)葉片讓其葉背朝上放置在載玻片上，滴上清水后蓋上蓋玻片，要注意避免產(chǎn)生氣泡，在激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP5 Ⅱ）下觀察并拍照。

1.5 蛋白檢測

取0.3 g接種后的新葉葉片組織，液氮研磨后加900 μL 蛋白抽提液（50 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0、150 mmol·L-1NaCl、0.2% Tween-20、2%β-巰基乙醇、蛋白酶抑制劑1片/10 mL），離心后吸上清液至新的2 mL EP管，-20℃保存。取 10 μL總蛋白與 2.5 μL蛋白Loading混勻，100℃水浴鍋內(nèi)煮15—20 min，12 000×g離心5 min后置于12% SDS-PAEG電泳，同時電泳兩塊膠。將一塊凝膠泡在考馬斯亮藍染色液中置于水平搖床染色1—2 h，染色結(jié)束后加水煮膠進行脫色。將另外一塊凝膠通過電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印到 PVDF膜上。Western blot檢測方法參考文獻[22]進行。其中一抗使用1∶1 000稀釋的CLCuMuV C4蛋白多克隆抗體，二抗使用1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG。最后將PVDF膜置于檢測反應液中避光孵育1 min，于自動化學發(fā)光凝膠成像分析儀（Amershm Imager600）中曝光10 s顯色。

1.6 DNA檢測

植物總DNA的提取采用 CTAB法[23]。Southern blot檢測采用 Roche DIG High Prime Lab/Detection Kit，詳細步驟參見其說明書。

2 結(jié)果

2.1 CLCuMuV“C4 ORF”編碼蛋白的致病性

2.1.1 PVX表達載體的構(gòu)建 通過序列分析，對CLCuMuV C4開放閱讀框附近的3個ORF（圖1-A）分別設計了引物，其中片段之間重復序列完全一致，也即起始密碼子均位于同一個大的開放閱讀框，并且共用同一個終止密碼子。PCR結(jié)果顯示分別擴增到C4-L（567 bp）、C4-M（546 bp）和C4-S（303 bp）的片段（圖1-B）。利用同源重組將該3個目的片段與 PVX線性化處理后的載體連接，獲得重組載體PVX-C4-L、PVX-C4-M與PVX-C4-S。

2.1.2 PVX介導的3個蛋白在本氏煙表達對本氏煙癥狀影響比較 重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后分別接種本氏煙，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種17 d后PVX-C4-L、PVX-C4-M與PVX-C4-S接種的植株略高于PVX空載接種對照，葉片卷曲，并且葉柄有伸長的現(xiàn)象，其癥狀嚴重程度由強至弱依次為 PVX-C4-S、PVX-C4-L、PVX-C4-M，接種25 d后PVX-C4-S葉片卷曲癥狀更加明顯，值得注意的是PVX-C4-S葉片多為上卷，而PVX-C4-L和PVX-C4-M葉片下卷（圖2-A），測量葉柄長后發(fā)現(xiàn)，PVX-C4-S、PVX-C4-L接種組的長度明顯長于 PVX-C4-M及對照組（P＜0.01）（圖2-B）。結(jié)果表明C4-S ORF編碼的蛋白致病性最強，C4-L ORF次之，而C4-M ORF編碼蛋白的致病性非常弱。

2.1.3 PVX介導 C4蛋白在本氏煙植株中表達的檢測 為驗證C4蛋白在PVX異源載體中的表達，提取接種25 d后煙草新葉總蛋白進行Western blot檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PVX-C4-L與PVX-C4-S接種的煙草葉片中均檢測到 C4蛋白的表達，遺憾的是雖然經(jīng)過多次重復，PVX-C4-M 沒有檢測到特異蛋白的積累（圖2-C）。

2.2 CLCuMuV“C4 ORF”編碼蛋白的亞細胞定位

為分析C4-L和C4-S的亞細胞定位情況，將重組表達載體YFP-C4-L和YFP-C4-S分別利用農(nóng)桿菌介導的植物接種法浸潤本氏煙葉片，48 h后，剪取本氏煙葉片表皮細胞于激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)YFP-C4-L主要定位在葉綠體，YFP-C4-S則是定位在細胞膜或細胞質(zhì)周邊，并且在細胞膜上可以觀察到點狀聚集體結(jié)構(gòu)（圖3）。

2.3 CLCuMuV及其突變體侵染性克隆接種

2.3.1 CLCuMuV及其突變體侵染性克隆接種本氏煙 為分析不同“C4 ORF”對病毒誘導寄主癥狀的影響，將 CLCuMuV、CLCuMuV-ΔL、CLCuMuV-ΔS分別與DNA-β侵染性克隆等比例混合接種本氏煙，以未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種本氏煙為陰性對照（Mock）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種7 d后CLCuMuV、CLCuMuV-ΔL接種的植株新葉即有向下卷曲的現(xiàn)象（圖片未示出）；接種14 d和21 d后，葉片出現(xiàn)明顯的皺縮并且增生、葉柄和莖稈扭曲，植株的高度明顯矮于Mock和CLCuMuV-ΔS，CLCuMuV-ΔS與Mock相同，沒有出現(xiàn)癥狀（圖4-A）。結(jié)果說明病毒對寄主癥狀的誘導過程中，C4-L不是必需，C4-S起到重要作用。

2.3.2 接種本氏煙植株的病毒DNA檢測 為檢測病毒基因組在接種煙草葉片中的復制積累情況，利用CLCuMuV的CP基因設計探針，對接種21 d后提取的葉片總 DNA進行 Southern blot檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CLCuMuV、CLCuMuV-ΔL接種的煙草葉片中均能檢測到病毒DNA-A的積累，而CLCuMuV-ΔS以及Mock沒有檢測到病毒DNA-A的積累（圖4-B）。同時，利用DNA-β組分設計探針，對接種21 d后提取的葉片總DNA進行Southern blot檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CLCuMuV、CLCuMuV-ΔL接種的煙草葉片中均能檢測到病毒 DNA-β的積累，而 CLCuMuV-ΔS以及Mock均未檢測到病毒DNA-β的積累（圖4-C）。結(jié)果說明病毒對寄主癥狀的誘導與病毒基因組的積累成正比。

2.3.3 接種本氏煙植株的C4蛋白檢測 為檢測病毒C4蛋白在接種煙草葉片中的表達情況，提取接種14 d葉片總蛋白，以C4蛋白多克隆抗體為一抗進行Western blot檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CLCuMuV和CLCuMuV-ΔL接種的煙草葉片中檢測到了 C4蛋白，且蛋白積累量基本一致，而CLCuMuV-ΔS以及Mock沒有檢測到C4蛋白的積累。值得注意的是，CLCuMuV接種的煙草蛋白檢測條帶跟CLCuMuV-ΔL十分一致，即C4蛋白抗體未能夠在CLCuMuV接種的煙草中檢測到C4-L蛋白的表達（圖 4-D）。結(jié)果說明病毒在侵染寄主過程中或許并不編碼C4-L蛋白。

3 討論

利用MEGA軟件對國內(nèi)外50多種CLCuMuV分離物的全基因組進行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)印度、巴基斯坦、泰國、菲律賓等地的分離物親緣關(guān)系較近，聚類為一個大分支，而所有來自中國的分離物聚類為一個大分支。值得注意的是，通過編碼 ORF序列分析，發(fā)現(xiàn)來自中國的CLCuMuV C4 ORF均為567 nt，國外絕大部分為303 nt以及個別546 nt，而NCBI登錄的C4蛋白的大小也不盡相同。本研究利用PVX異源表達載體發(fā)現(xiàn)PVX-C4-L和PVX-C4-S具有較強致病性，PVX-C4-M的致病性可忽略不計。更進一步利用侵染性克隆接種試驗發(fā)現(xiàn)C4-S ORF對病毒的侵染不可或缺。然而Southern blot在CLCuMuV-ΔS突變體上檢測不到病毒DNA-A和DNA-β組分，推測可能的原因之一是 C4-S ORF的缺失使病毒基因組DNA-A的復制受到了影響，而β衛(wèi)星需要依賴DNA-A組分進行復制[12,14-16,24-25]，所以β衛(wèi)星的復制也受到了影響；再者也可能是C4-S ORF的缺失影響病毒的運動，導致病毒無法正常運動而不能進行系統(tǒng)侵染，這與已報道的C4蛋白參與病毒的運動[26-28]一致。

亞細胞定位被認為與蛋白質(zhì)所發(fā)揮的功能有關(guān)，亞細胞定位的信息將有助于推斷蛋白質(zhì)功能，進而研究其作用機制。番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）C4定位在細胞周邊并與胞間連絲互作[28]，在病毒運動中介導細胞間的轉(zhuǎn)運。同樣，云南番茄曲葉病毒（tomato leaf curl Yunnan virus，TLCYnV）C4蛋白也被證實定位在細胞膜，通過增強CyclinD1.1的穩(wěn)定性，抑制NbSKη介導的磷酸化而誘導細胞分裂[29]。甘薯卷葉病毒（sweet potato leaf curl virus，SPLCV）的 C4蛋白主要與質(zhì)膜中的 AtBIN2相互作用，激活 AtBES1/AtBZR1成分，從而使它們可以進入細胞核并激活BR反應基因的轉(zhuǎn)錄[30]。這些說明 C4蛋白的膜定位與其功能的發(fā)揮存在密切的聯(lián)系。本研究結(jié)合之前的研究[31]發(fā)現(xiàn)YFP-C4-S蛋白主要定位在細胞膜上或細胞質(zhì)周邊，并且在細胞膜上可以觀察到點狀聚集體結(jié)構(gòu)，推測其與胞間連絲相關(guān)，與前人的研究結(jié)果一致。而YFP-C4-L主要定位在葉綠體，結(jié)合病毒侵染寄主后 C4蛋白的 Western blot檢測結(jié)果，或許暗示了其不作為CLCuMuV致病ORF而存在。

4 結(jié)論

CLCuMuV的3個假定的“C4 ORF”編碼蛋白中，C4-S對CLCuMuV的侵染必不可少，而C4-L和C4-M對CLCuMuV的侵染不是必需。