游麗娟 葸慧榮 高玉海 楊芳芳 陳克明*

1.甘肅省婦幼保健院健康管理中心，甘肅 蘭州 730050 2.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四○醫(yī)院骨研所，甘肅 蘭州 730050

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征的全身性骨骼疾病[1]。絕經(jīng)后的婦女由于雌激素缺乏往往會(huì)發(fā)生骨丟失和骨質(zhì)量下降現(xiàn)象從而引發(fā)骨折甚至死亡[2]，目前臨床上關(guān)于OP的治療主要采用西藥雙膦酸鹽、甲狀旁腺類等藥物，長期服用價(jià)格昂貴、副作用大，因此，急需尋找副作用小、療效好的中藥替代藥物從而降低用藥成本[3]。

白藜蘆醇是一種結(jié)構(gòu)類似雌激素己烯雌酚的天然多酚類化合物，廣泛存在于葡萄、花生、虎杖等植物中[4]。研究顯示，白藜蘆醇在體外與雌激素競(jìng)爭性結(jié)合雌激素受體，類似植物雌激素，發(fā)揮抗OP作用[5]。據(jù)報(bào)道，白藜蘆醇可調(diào)節(jié)血脂，具有抗血小板聚集、抗氧化、抗腫瘤等諸多生物學(xué)活性[4-5]。淫羊藿苷是中草藥淫羊藿的主要有效成分，諸多文獻(xiàn)證明，淫羊藿苷具有穩(wěn)定的抗OP作用，目前已有開發(fā)的淫羊藿總黃酮膠囊在我國上市用于治療原發(fā)性O(shè)P[6-7]。雖然也有白藜蘆醇對(duì)去卵巢大鼠發(fā)生OP影響報(bào)道，但這些文章大多發(fā)表于幾年前，其評(píng)價(jià)手段不全面，仍缺乏綜合系統(tǒng)性評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)以去卵巢大鼠為OP模型，白藜蘆醇為目標(biāo)研究藥物，淫羊藿苷為陽性對(duì)照藥物，利用骨密度、生物力學(xué)、血清生化指標(biāo)、骨形態(tài)計(jì)量檢測(cè)等方法全面綜合探討白藜蘆醇抗OP作用，以期能為中醫(yī)藥白藜蘆醇更好地運(yùn)用于臨床OP的治療提供依據(jù)。

1 主要儀器、試劑盒與藥品

LUNAR Prodigy雙能X線骨密度測(cè)量儀(GE公司，美國)，AG-IS生物力學(xué)萬能試驗(yàn)機(jī)(島津公司，日本)，SP1600硬組織切片機(jī)(LEICA公司，德國)，BX51倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本)；EPOCH酶標(biāo)儀(伯騰儀器有限公司，美國)。骨鈣素和抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒(IDS公司，丹麥，Lot分別為：AC-12F1，SB-TR102)；白藜蘆醇(純度≥98%，寶雞辰光生物公司，中國，Lot：20140207)；淫羊藿苷(純度≥98%，寶雞辰光生物公司，中國，Lot：20170125-2)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組與處理

6月齡SPF級(jí)Wistar雌性大鼠40只，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院下屬蘭獸研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(甘)2014-0006-152)。大鼠造模前按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組10只，分別為假手術(shù)組(Sham)、去卵巢組(OVX)、淫羊藿苷組(I)及白藜蘆醇組(R)。除Sham組切除卵巢體積相同脂肪外，其余各組均由背部行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)。術(shù)后及時(shí)青霉素粉末涂抹傷口并肌肉注射青霉素消炎，后連續(xù)注射青霉素3 d繼續(xù)消炎。休整1周后開始灌胃給藥。I組給藥劑量為25 mg/(kg·d)，R組給藥劑量為8.4 mg/(kg·d)，Sham組和OVX組均給予等體積蒸餾水(1 mL/200 g)，灌胃劑量依據(jù)來源于前期實(shí)驗(yàn)[8]。灌胃時(shí)間為每周一至周六早上9:00～11:00，每天灌胃1次。每2周稱1次大鼠體質(zhì)量，并根據(jù)體質(zhì)量對(duì)灌胃劑量進(jìn)行微調(diào)整。每4周檢測(cè)一次全身骨密度，待組間全身骨密度出現(xiàn)顯著性差異，禁食禁水24 h后處死所有大鼠并取材。

2.2 骨密度檢測(cè)

用10%水合氯醛3 mL/kg的劑量腹腔注射逐個(gè)麻醉大鼠，后放置于雙能X線骨密度儀治療床上檢測(cè)全身骨密度值；大鼠處死后，將分離的右側(cè)股骨和椎骨分別置于骨密度儀上檢測(cè)其各自離體骨密度值。

2.3 生物力學(xué)檢測(cè)

將分離的左側(cè)股骨置于AG-IS萬能試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，跨距16 mm，加載速度10 mm/min，計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄最大載荷和彈性模量的值。將分離的大鼠第5腰椎骨(L5)進(jìn)行壓縮實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)開始前將椎骨用2000目砂紙打磨成近似上下兩平面平行的圓柱體，打磨后的樣本垂直放于不銹鋼金屬平臺(tái)正中央，逐漸加載壓力，加載速度為2 mm/min，記錄最大載荷和彈性模量的值。

2.4 血清生化指標(biāo)分析

麻醉后的大鼠剝離腹主動(dòng)脈抽取血樣后在室溫下靜置30 min，然后5 000 r/min離心8 min，將上層血清分裝于100 μL小管并做好分組標(biāo)記，凍存于-80 ℃待檢測(cè)。采用骨鈣素(osteocalcin，OC)、酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)ELISA試劑盒分別檢測(cè)血清OC和TRACP-5b的OD值，按說明書制作各自標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出各自的濃度，單位分別為ng/mL和U/L。

2.5 骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析

新鮮分離的左側(cè)脛骨用4%多聚甲醛固定后4周后，每組取6只軟骨組織剝離完整的脛骨，切取帶近心干骺端1.5 cm骨組織，用樹脂包埋于直徑為2 cm高度為8 cm的玻璃瓶中。待樹脂冷卻凝固后取出包埋塊置于LEICA SP1600鋸式切片機(jī)切成約50 μm的骨片，封固，砂紙打磨，然后進(jìn)行品紅-苦味酸(van gilson，VG)染色，用IPP6.0軟件分析系統(tǒng)選擇各組圖片并導(dǎo)入軟件，并根據(jù)圖片分辨率選擇對(duì)應(yīng)標(biāo)尺，后運(yùn)用測(cè)量工具中長度、面積、顏色等選取功能分析骨小梁相關(guān)參數(shù)，包括Tb.N、Tb.Th、Tb.SP和BV/TV等，并觀察骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對(duì)大鼠體質(zhì)量及器官指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)期間大鼠正常進(jìn)水進(jìn)食，精神狀態(tài)良好。如圖1所示，隨時(shí)間變化大鼠體質(zhì)量變化不大，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。如圖2所示，各組間大鼠的肝、脾、肺、腎的器官指數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。OVX組大鼠子宮系數(shù)顯著低于Sham組(P<0.05)，I組和R組子宮系數(shù)顯著高于OVX組(P<0.05)。子宮組間差異說明大鼠切除卵巢后由于雌激素缺乏，子宮發(fā)生萎縮，子宮系數(shù)降低，而I和R組均可抑制此作用的發(fā)生。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化曲線Fig.1 The changing curve of the body weight of rats

圖2 各組大鼠主要臟器的器官指數(shù)Fig.2 The organ index of main organs in rats注：與Sham組比較，*P<0.05，**P<0.01；與OVX組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 對(duì)大鼠骨密度的影響

如表1所示，4周全身骨密度結(jié)果顯示，各組間骨密度變化不大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；8周全身骨密度結(jié)果顯示，與Sham組相比，OVX組大鼠全身骨密度值顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與OVX組相比，I組、R組全身骨密度均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。如表2所示，通過檢測(cè)椎骨和左側(cè)股骨骨密度，結(jié)果呈現(xiàn)與全身骨密度相同的趨勢(shì)(P<0.01)。R組與I組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，只是平均值略低于I組，這一結(jié)果表明R可預(yù)防骨密度丟失。

表1 各組大鼠全身骨密度檢測(cè)結(jié)果

表 2 各組大鼠離體骨密度檢測(cè)結(jié)果

3.3 對(duì)大鼠生物力學(xué)的影響

如表3、4所示，OVX組與Sham組相比，大鼠股骨、椎骨的最大載荷和彈性模量均顯著降低(P<0.01)；I、R組與OVX組相比，股骨、椎骨的最大載荷、彈性模量均顯著增加(P<0.01)。I與R相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果表明去卵巢后大鼠的生物力學(xué)性能下降，而I和R組都能抑制這一下降趨勢(shì)。R組與I組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，平均值略低于I組，說明R也可增加去勢(shì)大鼠生物力學(xué)性能。

表 3 各組大鼠股骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 實(shí)驗(yàn)大鼠椎骨壓縮試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The compression test results of the vertebrae

3.4 對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響

如表5所示，OVX組與Sham組相比，血清中OC含量降低而TRACP-5b含量增加(P<0.01)；I、R組與OVX組相比，OC含量均顯著增加而TRACP-5b含量均顯著下降(P<0.01)。這一結(jié)果表明I、R組都可通過促進(jìn)骨形成抑制骨吸收來預(yù)防切除卵巢引起的骨丟失。I和R組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，只是平均值略低于I組，說明R也可改變骨形成和骨吸收相關(guān)的分子機(jī)制。

表5 大鼠血清中OC、TRACP-5b含量

3.5 對(duì)大鼠骨形態(tài)計(jì)量學(xué)的影響

如圖3所示，OVX組與Sham組相比，骨小梁數(shù)量和致密性明顯降低，且骨小梁分離度明顯變寬；I組、R組與OVX組相比，骨小梁數(shù)量、網(wǎng)狀交聯(lián)度明顯增加，骨小梁分離度明顯減小，連續(xù)性好。I與R肉眼識(shí)別無明顯差別。這一結(jié)果表明，I、R藥物均可通過提高骨組織密度而增加骨質(zhì)量。如表6所示，OVX與Sham組相比，其骨小梁數(shù)量和面積百分比明顯降低而骨小梁分離度明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；I組和R組與OVX相比，其其骨小梁數(shù)量和面積百分比明顯升高而骨小梁分離度明顯降低，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。R與I相比，各指標(biāo)相差不大，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 不同干預(yù)組大鼠脛骨近心干骺端骨組織形態(tài)學(xué)比較(40×)Fig.3 Morphological comparison of proximal tibial metaphysis among different intervention groups (40×)

表6 各組大鼠脛骨近心干骺端組織計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)比較Table 6 Histomorphometric indices in the proximal tibia metaphysis of rats

4 討論

OP作為一種老年性疾病，絕經(jīng)后婦女是主要分布人群常常會(huì)因骨質(zhì)量嚴(yán)重下降喪失生活自理能力甚至縮短壽命，這給國家及家庭財(cái)力、人力造成了巨大的負(fù)擔(dān)[9]。雌激素被認(rèn)為是治療絕經(jīng)后OP最有效的藥物。但使用雌激素后會(huì)引起一系列副作用，如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、心血管等疾病的發(fā)生等[10]。淫羊藿苷作為陽性對(duì)照藥物，其來源于中草藥淫羊藿，以其為主要成分開發(fā)的淫羊藿苷總黃酮膠囊早已在我國南方上市，但其原料藥物的稀缺目前仍不能在全國普及。尋找能代替雌激素的更多中草藥以此降低用藥成本及副作用無疑會(huì)給廣大OP患者帶來福音。OVX大鼠模型很好地模擬了絕經(jīng)后婦女的OP模型，是OP研究的經(jīng)典動(dòng)物模型，目前最為常用。

根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)，卵巢摘除后的大鼠其進(jìn)食量會(huì)明顯增加，本研究統(tǒng)一進(jìn)行了飲食的控制，排除飲食對(duì)其骨密度的影響，根據(jù)體質(zhì)量結(jié)果顯示，各組間體質(zhì)量無顯著性差異。但卵巢摘除后，正常情況下由于雌激素缺乏造成子宮萎縮，如OVX子宮系數(shù)所示，與Sham組具有顯著差異。當(dāng)藥物治療后，發(fā)揮了類雌激素的作用，其萎縮程度得到大量緩解，如I組和R組所示，與OVX相比，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本實(shí)驗(yàn)中OVX組8周后全身及離體骨密度、生物力學(xué)性能均顯著低于假手術(shù)組。這表明卵巢摘除后機(jī)體不能產(chǎn)生雌激素從而導(dǎo)致其骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度明顯下降，骨流失嚴(yán)重。血清生化指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其骨形成降低而骨吸收增加，進(jìn)一步從分子水平進(jìn)行了佐證。骨形態(tài)計(jì)量學(xué)的觀察和靜態(tài)參數(shù)的測(cè)量分析，確證了OP模型的成立。

骨密度是骨質(zhì)量檢測(cè)的黃金指標(biāo)，通過骨密度檢測(cè)可以直觀判定骨質(zhì)量的好壞[11]。骨密度結(jié)果顯示，藥物灌胃8周后I組和R組其全身骨密度、離體股骨和椎骨骨密度也有顯著增加，說明I和R均可以預(yù)防因卵巢切除而引起的骨丟失作用。I組作為陽性對(duì)照平均值略微高于R組，但幾乎無區(qū)別，說明R也能預(yù)防OP模型大鼠的骨密度的丟失，從而增加骨質(zhì)量。骨的微結(jié)構(gòu)和幾何形態(tài)決定骨的力學(xué)性能，不受大小和形狀的影響，它反映了骨的韌性和強(qiáng)度[12]。骨生物力學(xué)結(jié)果顯示，R組股骨和椎骨最大載荷均顯著高于OVX組，也再一次驗(yàn)證了此藥物對(duì)增加OVX大鼠骨強(qiáng)度的顯著影響。血清生化指標(biāo)反映的是骨代謝的本質(zhì)，是骨形成和骨吸收的直觀反映，能客觀地評(píng)價(jià)骨轉(zhuǎn)換率[13]。血清骨代謝生化指標(biāo)較模型組而言，骨形成因子骨鈣素活性水平顯著提高，骨吸收因子抗酒石酸酸性磷酸酶活性水平顯著下降，表明R可通過增加OVX大鼠骨骨形成的活性且抑制破骨細(xì)胞的活性從而抑制了骨質(zhì)的流失。骨形態(tài)計(jì)量學(xué)是評(píng)價(jià)骨組織微結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)，反映機(jī)體組織形態(tài)學(xué)的變化情況。本實(shí)驗(yàn)通過品紅-苦味酸染色客觀反映了各組間骨組織形態(tài)學(xué)的變化。結(jié)果顯示，OVX組由于卵巢切除，其骨小梁數(shù)量和致密度較Sham組顯著降低，而藥物治療后的R組骨小梁數(shù)量明顯增加，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)致密，說明藥物對(duì)其骨量有顯著增加的影響。通過骨形態(tài)計(jì)量學(xué)靜態(tài)參數(shù)的分析比較，R組大鼠較OVX組在Tb.N、Tb.SP以及BV/TV數(shù)值上均有明顯增加的結(jié)果，再次驗(yàn)證了R可通過改善骨組織、增加骨密度從而提高骨質(zhì)量。數(shù)據(jù)中Tb.Th只是平均值有增加，但統(tǒng)計(jì)結(jié)果無意義，也有增加的趨勢(shì)?？赡苁且?yàn)槠溆盟帟r(shí)間并未達(dá)到較為理想的效果。各項(xiàng)指標(biāo)I組和R組相比，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明R可作為中藥替代藥物治療骨質(zhì)疏松，且其作用效果不次于公認(rèn)骨質(zhì)疏松治療藥物淫羊藿苷。

綜上所述，R可通過提高大鼠骨密度、改變生物力學(xué)性能，增加骨形成的同時(shí)降低骨吸收，增加骨組織致密結(jié)構(gòu)來抑制切卵巢大鼠的骨量流失。但仍有諸多問題需進(jìn)一步研究，比如延長R用藥是否效果更為理想還是作用效果消失？R藥物作用的具體分子機(jī)制是什么？R藥物的毒理實(shí)驗(yàn)等還有待進(jìn)一步研究。但該研究結(jié)果為OP治療尋找替代中藥提供了理論依據(jù)，從而為更多更好的中藥治療OP研究和臨床推廣奠定基礎(chǔ)。