(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬株洲醫(yī)院腫瘤科，湖南省株洲市412000)

肝癌是中國常見的惡性腫瘤之一，居中國癌癥發(fā)病率的第五位[1]，手術(shù)是其主要治療手段，但大部分病人發(fā)現(xiàn)時已為腫瘤中晚期，喪失了手術(shù)機會。即使進(jìn)行了手術(shù)切除、原位肝移植和射頻消融術(shù)，由于肝癌的高侵襲性和復(fù)發(fā)率，其預(yù)后仍不理想[2]。近年來研究表明，二甲雙胍除降糖作用外，還具有抗腫瘤作用[3]。苯乙雙胍同為雙胍類衍生化合物，結(jié)構(gòu)上不同于二甲雙胍[4]，抗腫瘤活性也不同于二甲雙胍。苯乙雙胍無需任何轉(zhuǎn)運蛋白即可通過細(xì)胞膜[5]。因此，苯乙雙胍比二甲雙胍有更好的組織生物利用度，其抗腫瘤作用是二甲雙胍的50倍[6]，且苯乙雙胍具有直接抗腫瘤作用[7]，也可增強化療、放療[8]或者靶向治療[9]的療效。目前關(guān)于苯乙雙胍在肝癌中作用的報道少見，本文就苯乙雙胍對肝癌細(xì)胞增殖、集落形成、侵襲能力的影響，以及其分子機制進(jìn)行研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

苯乙雙胍(中國阿拉丁試劑公司)；p-AMPK兔抗人單克隆抗體(美國CST公司)；p-mTOR兔抗人單克隆抗體(美國CST公司)；β-actin兔抗人單克隆抗體(美國CST公司)；LipofectamineTM2000脂質(zhì)體(上海碧云天生物科技公司)；siRNA-AMPK(廣州銳博生物科技有限公司)；倒置熒光顯微鏡-DMI3000B(德國Leica公司)；全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)-4600(上海天能科技有限公司)；多功能酶標(biāo)儀-Synergy HTX(美國BioTeK公司)；人肝癌細(xì)胞株Hep-G2由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院贈予；人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721由湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院贈予。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SMMC-7721、Hep-G2細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清和1%雙抗的完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱控制在37 ℃、5% CO2、100%濕度的環(huán)境下，3～4天傳代1次。由于苯乙雙胍在兩個細(xì)胞系的敏感度不同，故選擇不同的濃度進(jìn)行后續(xù)實驗[10]。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

由于Hep-G2對苯乙雙胍更加敏感，因此選擇Hep-G2進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗。Veiga等[5]研究苯乙雙胍作用于肝癌也同樣選擇的是Hep-G2細(xì)胞。取3×105個對數(shù)生長期的Hep-G2細(xì)胞接種在6孔板中，培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)染，利用脂質(zhì)體2000將無義siRNA及AMPK siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，依據(jù)轉(zhuǎn)染siRNA不同分siAMPK組(轉(zhuǎn)染AMPK siRNA)及siCtrl組(轉(zhuǎn)染無義siRNA)，轉(zhuǎn)染5 h后更換為完全培養(yǎng)基，siAMPK序列：5′-AATTACTTCTGGTGCAGCATAGCGG-3′,siCtrl序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.4 MTT細(xì)胞增殖實驗

取8×103個對數(shù)生長期的SMMC-7721、Hep-G2、siRNA Hep-G2以及siAMPK Hep-G2細(xì)胞接種在96孔板中，置于培養(yǎng)箱中24 h后，用不同濃度的苯乙雙胍(0、200、400、600、800、1 000、1 200 μmol/L處理SMCC-7721細(xì)胞，0、40、80、160、320、640 μmol/L處理Hep-G2細(xì)胞)處理72 h，然后吸出培養(yǎng)基，PBS輕柔清洗2遍，每孔中加入50 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)5 h后向每個孔中添加150 μL二甲基亞砜，避光震蕩15 min，酶標(biāo)儀檢測每孔在490 nm波長處的光密度(OD值)。細(xì)胞相對活力=實驗組OD值/對照組OD值，使用Prism軟件繪制MTT曲線。

1.5 克隆實驗

取8×103個對數(shù)生長期的SMMC-7721、Hep-G2細(xì)胞接種在24孔板的每孔中，置于培養(yǎng)箱中24 h，用不同濃度的苯乙雙胍(SMMC-7721細(xì)胞為0、10、20 μmol/L，Hep-G2細(xì)胞為0、25、50 μmol/L)處理5～7天，當(dāng)對照組細(xì)胞(苯乙雙胍濃度為0 μmol/L)生長至70%～80%時，取出24孔板，棄去完全培養(yǎng)液，用PBS輕柔清洗2遍，加10%福爾馬林固定3 h，每孔加1 mL 0.1%結(jié)晶紫浸染1 h，浸染后用礦泉水緩慢輕柔清洗，倒置在紙上干燥，放入酶標(biāo)儀中，選擇波長為550 nm進(jìn)行定量，使用Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.6 侵襲實驗

使用侵襲實驗檢測細(xì)胞侵襲能力[11]。取對數(shù)生長期的4×104個SMMC-7721細(xì)胞、8×104個Hep-G2、siRNA Hep-G2以及siAMPK Hep-G2細(xì)胞分別混勻在無血清的培養(yǎng)基中，同時加入不同濃度的苯乙雙胍(SMMC-7721細(xì)胞為0、100、200 μmol/L，Hep-G2細(xì)胞為0、50、100 μmol/L)，接種在小室上室，在24孔板下室加入500 μL完全培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將小室上培養(yǎng)液丟棄，用10%多聚甲醛固定3 h，0.1%結(jié)晶紫染色5 h。用鑷子將小室放在清水中輕輕洗滌，去除表面結(jié)晶紫，用棉簽輕輕拭去上室的細(xì)胞。在顯微鏡下采集圖片并計數(shù)細(xì)胞穿膜數(shù)。相對侵襲能力=實驗組穿膜細(xì)胞數(shù)/對照組穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.7 Western blot法

使用不同濃度苯乙雙胍(0、100、200、400 μmol/L處理SMMC-7721細(xì)胞，0、50、100、200 μmol/L處理Hep-G2細(xì)胞)處理細(xì)胞24 h后收板。向每個孔中加200 μL蛋白裂解液裂解細(xì)胞，放置在100 ℃的水浴鍋中加熱10 min，取出備用。隨后制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、剪膜、封閉，在4 ℃孵育一抗14～16 h，洗條帶1 h，室溫下孵育二抗1 h，使用TANON機器拍攝，用Image J軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值(蛋白相對表達(dá)水平=實驗組灰度值/對照組灰度值)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染效果鑒定及對AMPK表達(dá)影響

結(jié)果顯示siCtrl組和siAMPK組AMPK蛋白相對表達(dá)量分別是0.94±0.08和0.15±0.07，siAMPK組細(xì)胞幾乎無AMPK蛋白表達(dá)(P<0.05；圖1)。成功轉(zhuǎn)染Hep-G2細(xì)胞株。

圖1 沉默AMPK后的AMPK蛋白表達(dá)

2.2 SMCC-7721和Hep-G2細(xì)胞增殖實驗結(jié)果

與苯乙雙胍濃度為0 μmol/L相比，SMMC-7721、Hep-G2細(xì)胞活力隨苯乙雙胍濃度增高而下降(圖2)。與siAMPK組相比，siCtrl組對苯乙雙胍的抑制作用更為敏感(P<0.05；圖3)。

圖2 細(xì)胞增殖實驗結(jié)果a為P<0.05，與同細(xì)胞苯乙雙胍0 μmol/L比較。

圖3 沉默AMPK對Hep-G2細(xì)胞增殖的影響a為P<0.05，與siCtrl組比較。

2.3 SMCC-7721和Hep-G2細(xì)胞克隆實驗結(jié)果

不同濃度的苯乙雙胍處理Hep-G2和SMMC-7721細(xì)胞后，與苯乙雙胍0 μmol/L組比較，苯乙雙胍處理后細(xì)胞的集落形成能力明顯下降(P<0.05；圖4)。

圖4 SMMC-7721和Hep-G2細(xì)胞克隆實驗結(jié)果1、2、3、4、5、6分別為0、10、20、0、25、50 μmol/L的苯乙雙胍組。a為P<0.05，與同細(xì)胞苯乙雙胍0 μmol/L組比較。

2.4 SMCC-7721和Hep-G2細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果

與0 μmol/L組比較，苯乙雙胍處理組細(xì)胞的侵襲能力明顯下降，但相同濃度苯乙雙胍(100 μmol/L)處理兩個細(xì)胞系，Hep-G2侵襲能力下降更為明顯(圖5)。

圖5 SMMC-7721和Hep-G2細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果(結(jié)晶紫染色，100×)1、2、3、4、5、6分別為0、100、200、0、50、100 μmol/L的苯乙雙胍組，a為P<0.05，與同細(xì)胞苯乙雙胍0 μmol/L組比較。

60 μmol/L苯乙雙胍處理Hep-G2細(xì)胞以及沉默AMPK的Hep-G2細(xì)胞，如圖6所示。苯乙雙胍處理的siCtrl組與未予以苯乙雙胍處理的siCtrl組相比，侵襲能力下降。苯乙雙胍處理的siCtrl組與苯乙雙胍處理的siAMPK組相比，siAMPK使Hep-G2細(xì)胞的侵襲能力較siCtrl組更強，沉默AMPK后，使苯乙雙胍抗侵襲能力下降，但并非完全消失，而是使苯乙雙胍抗侵襲能力減弱(P<0.05)。

圖6 沉默AMPK對Hep-G2細(xì)胞侵襲的影響(結(jié)晶紫染色，100×)a為P<0.05，與siCtrl組比較。苯乙雙胍濃度為60 μmol/L。

2.5 SMCC-7721和Hep-G2細(xì)胞p-AMPK、p-mTOR蛋白表達(dá)情況

與0 μmol/L組比較，苯乙雙胍處理后的肝癌細(xì)胞，p-AMPK表達(dá)量增加，p-mTOR表達(dá)量下降。苯乙雙胍處理后蛋白表達(dá)水平與0 μmol/L組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；圖7)。

圖7 SMMC-7721/Hep-G2細(xì)胞p-AMPK、p-mTOR蛋白表達(dá)情況A為Western blot實驗結(jié)果；B、C為蛋白表達(dá)柱狀圖。a為P<0.05，與同細(xì)胞苯乙雙胍0 μmol/L組比較。

3 討 論

肝癌是癌中之王，惡性程度十分高，發(fā)現(xiàn)時往往處于晚期，失去了手術(shù)的機會，放療和化療有效率偏低，預(yù)后極差，因此尋找治療肝癌新藥物至關(guān)重要。苯乙雙胍作為降糖效果優(yōu)于二甲雙胍的雙胍類降糖藥，因其乳酸毒性而逐漸退出臨床應(yīng)用[12]。與二甲雙胍相比，苯乙雙胍具有更好的抗癌活性[13]。然而，迄今為止，很少有研究探討苯乙雙胍的抗腫瘤活性。苯乙雙胍能抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物I[7]，降低三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)合成，一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)/ATP比率增高，最終誘導(dǎo)AMPK激活，進(jìn)而抑制其下游信號通路蛋白mTOR[14]，抑制肝癌細(xì)胞的生長、增殖和侵襲[15]。AMPK作為一種細(xì)胞內(nèi)能量傳感器，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)代謝活動[16]。Appleyard等[17]研究表明，AMPK是雙胍類藥物作用的一個關(guān)鍵靶點，AMPK在肝臟中被激活。由此可知，苯乙雙胍具有抗腫瘤活性，但很少有研究報道苯乙雙胍與肝癌的關(guān)系。

本實驗結(jié)果表明，苯乙雙胍可以抑制SMMC-7721和Hep-G2肝癌細(xì)胞的活力、集落形成和侵襲能力，且隨著苯乙雙胍的濃度增大，肝癌細(xì)胞的活力、集落形成能力以及侵襲能力越低，其中可見Hep-G2細(xì)胞系較SMMC-7721細(xì)胞系對苯乙雙胍更為敏感。肝癌的特點就是極易發(fā)生肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致無法手術(shù)，治療效果欠佳[18]，本實驗使用侵襲實驗檢測肝癌細(xì)胞SMMC-7721和Hep-G2侵襲能力，發(fā)現(xiàn)苯乙雙胍對兩種細(xì)胞系的侵襲能力皆起到抑制作用，從而可能抑制肝癌的轉(zhuǎn)移。AMPK和mTOR是腫瘤代謝中的重要靶點，Sabharwal等[19]發(fā)現(xiàn)苯乙雙胍可誘導(dǎo)線粒體功能障礙和分裂，可使代謝向糖酵解轉(zhuǎn)變，從而使肝癌細(xì)胞更容易受到mTOR抑制劑的影響，其研究得知苯乙雙胍與mTOR抑制劑協(xié)同激活A(yù)MPK，增加ROS的生成和細(xì)胞死亡，從而共同抑制肝癌細(xì)胞的生長和增殖。本實驗結(jié)果也表明苯乙雙胍作用于SMMC-7721和Hep-G2肝癌細(xì)胞，可激活A(yù)MPK，并抑制其下游通路蛋白mTOR，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。為進(jìn)一步探索是否通過AMPK發(fā)揮作用，選擇對苯乙雙胍更為敏感的Hep-G2細(xì)胞，進(jìn)行AMPK沉默。結(jié)果表明，siAMPK組細(xì)胞增殖能力較siCtrl組明顯增高，苯乙雙胍作用于siAMPK組仍可以抑制細(xì)胞的增殖，但相較于siCtrl組抑制減弱。與MTT實驗結(jié)果相似，侵襲實驗也證實siAMPK組對苯乙雙胍敏感度較siCtrl組降低，其遷移細(xì)胞數(shù)較siCtrl明顯增多。由此，進(jìn)一步證實苯乙雙胍通過激活A(yù)MPK發(fā)揮作用，但沉默AMPK之后并不能完全抑制苯乙雙胍抗腫瘤作用，表明苯乙雙胍可能通過其他機制共同發(fā)揮抗腫瘤作用，例如通過作用于腫瘤干細(xì)胞[16,20]、抑制免疫[21]以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]等。除此之外，苯乙雙胍還可以與各種靶向藥物聯(lián)合應(yīng)用作用于腫瘤細(xì)胞[23-24]，增加靶向藥物的作用，延緩靶向藥物耐受時間，從而抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和進(jìn)展。這可為腫瘤提供一種新的治療方式。

綜上所述，苯乙雙胍抑制SMMC-7721和Hep-G2肝癌細(xì)胞的生長、增殖以及侵襲能力，其機制可能與激活A(yù)MPK，抑制mTOR有關(guān)。本實驗結(jié)果為苯乙雙胍未來應(yīng)用于臨床治療肝癌提供理論基礎(chǔ)，但未與臨床化療、放療以及靶向藥物聯(lián)合，未來就其與藥物協(xié)同作用的機制尚有待進(jìn)一步研究，苯乙雙胍有望成為肝癌治療的一種新的藥物。