(1.杭州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，浙江省杭州市310053；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)和微生物學(xué)系，浙江省杭州市310058)

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pneumoniae)是一種常見的革蘭氏陽性雙球菌，常寄生于正常人群鼻咽部，學(xué)齡前兒童該菌帶菌率高達(dá)50%，成人也有5%～20%帶菌率[1-2]。肺炎鏈球菌是兒科肺炎、中耳炎和鼻竇炎標(biāo)本中檢出率最高的病原菌，也是兒童社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)主要病原體，近年來還發(fā)現(xiàn)該菌可引起免疫功能低下和老年人致死性細(xì)菌性腦膜炎和膿毒血癥[2-4]。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)資料，全球每年死于肺炎鏈球菌感染的患者約200萬，僅次于結(jié)核病，中國肺炎鏈球菌感染性疾病發(fā)病率位列全球第二[5]。細(xì)菌耐藥性是人類面臨的重大醫(yī)學(xué)問題之一。目前認(rèn)為，肺炎鏈球菌株對抗生素耐藥性增強(qiáng)及其耐藥菌株日益流行，是該菌感染性疾病發(fā)病率不斷升高的根本原因[6-8]。眾所周知，β-內(nèi)酰胺類抗生素是臨床使用最為廣泛的抗生素，其次是氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。近年發(fā)現(xiàn)，15%～30%的肺炎鏈球菌菌株為多重耐藥(multiple drug resistance，MDR)菌株，也即對上述或其他3個以上不同種類抗生素耐藥[6-8]。因此，了解肺炎鏈球菌耐藥分子機(jī)制，不僅有利于臨床治療肺炎鏈球菌感染性疾病和控制耐藥菌株流行，對深入研究細(xì)菌耐藥性和發(fā)現(xiàn)藥物作用新靶點(diǎn)也有較大意義。

1 常用抗生素和常見細(xì)菌耐藥機(jī)制

臨床常用的抗生素有青霉素等β-內(nèi)酰胺類(β-lactams)、鏈霉素等氨基糖苷類(aminoglycosides)、紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類(aminoglycosides)、氟哌酸等喹諾酮類(quinolones)、多西環(huán)素等四環(huán)素類(tetracyclines)、克林霉素等林可霉素類(lincomycins)抗生素以及臨床偶用的去甲萬古霉素等萬古霉素類(vancomycins)、多粘菌素B等多粘菌素類(polymyxins)抗生素等，其中β-內(nèi)酰胺類抗生素使用最為廣泛。不同細(xì)菌對不同抗生素耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣，但主要機(jī)制如下[1,9-12]：

1.1 產(chǎn)生藥物鈍化酶

如細(xì)菌產(chǎn)生分別水解β-內(nèi)酰胺類抗生素中青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素的β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)、頭孢菌素酶(cephalosporinase)和碳青霉烯酶(carbapenemase)，可裂解β-內(nèi)酰胺類抗生素分子中的β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而產(chǎn)生對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性。

1.2 藥物結(jié)合的靶分子突變

如β-內(nèi)酰胺類抗生素結(jié)合的靶蛋白稱為青霉素結(jié)合蛋白(penicillin-binding proteins，PBPs)，若PBPs中與β-內(nèi)酰胺抗生素結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸突變，可產(chǎn)生對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性。PBPs本質(zhì)上是位于細(xì)菌表面細(xì)胞壁肽聚糖合成相關(guān)的內(nèi)肽酶(endopeptidase)、轉(zhuǎn)肽酶(transpeptidase)和羧肽酶(carboxypeptidase)，β-內(nèi)酰胺類抗生素通過其β-內(nèi)酰胺環(huán)上的羧基與決定PBPs活性絲氨酸殘基的羥基共價結(jié)合后使酶活性喪失，細(xì)胞壁合成受阻，導(dǎo)致細(xì)菌在環(huán)境低滲透壓中裂解。

1.3 藥物膜通道數(shù)量和/或功能下降

β-內(nèi)酰胺類抗生素作用位于細(xì)菌表面PBPs而不需要進(jìn)入菌體內(nèi)，其他抗生素均作用于細(xì)菌核糖體，故必須穿越細(xì)菌壁膜進(jìn)入菌體內(nèi)才能發(fā)揮作用。如細(xì)菌的氨基糖苷類抗生素OprH膜通道表達(dá)量下降和/或通行功能減弱，均可引起對氨基糖苷類抗生素的耐藥性。

1.4 菌體內(nèi)藥物外排

細(xì)菌需要將合成的蛋白等產(chǎn)物通過特定裝置排出菌體，稱為細(xì)菌的分泌系統(tǒng)(secretion systems，SS)。迄今發(fā)現(xiàn)細(xì)菌有1～7型SS(T1SS～T7SS)，其中T1SS和T2SS參與菌體內(nèi)藥物外排，如T1SS中ABC藥物外排泵。

1.5 藥物活性轉(zhuǎn)化受阻

此種耐藥機(jī)制少見。抗結(jié)核藥物異煙肼(isoniazid)進(jìn)入結(jié)核分枝桿菌后必須經(jīng)細(xì)菌katG基因表達(dá)的產(chǎn)物過氧化氫酶和過氧化物酶氧化后，才能轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸种平Y(jié)核分枝桿菌活性的中間產(chǎn)物，若katG基因表達(dá)下降，可表現(xiàn)為對異煙肼耐藥。

2 肺炎鏈球菌耐藥機(jī)制

2.1 對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥機(jī)制

β-內(nèi)酰胺類抗生素是治療肺炎鏈球菌感染的首選藥物，臨床常用青霉素類和頭孢菌素類。與金黃色葡萄球菌等絕大多數(shù)病原性球菌不同，一般公認(rèn)為肺炎鏈球菌不產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶或無β-內(nèi)酰胺酶活性[13]。在GenBank公布的肺炎鏈球菌全基因組序列中，除早年耐藥R6株有兩個產(chǎn)物注釋為金屬β-內(nèi)酰胺酶超家族蛋白(metallo-beta-lactamase superfamily protein)的基因(spr0538和spr1490)外，多重耐藥ATCC700669株和不耐藥ATCC49619株基因組中均無β-內(nèi)酰胺酶編碼基因[14-16]。

2.1.1 PBPs PBPs突變被認(rèn)為是細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制之一，突變后的PBPs與β-內(nèi)酰胺類抗生素的親和力降低，導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生[17]。PBPs可分為低相對分子質(zhì)量(low molecular weight，lmw)和高相對分子質(zhì)量(high molecular weight，hmw)兩大家族，低相對分子質(zhì)量只有PBP3，高相對分子質(zhì)量有5個PBPs，分為A類和B類，A類有PBP1a、PBP1b和PBP2a，B類有PBP2b和PBP2x。肺炎鏈球菌表達(dá)所有6個PBPs，其中PBP1a、PBP2b和PBP2x與耐藥性關(guān)系更為密切，PBPs突變可能是該菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要原因[18]。文獻(xiàn)[19]報道，肺炎鏈球菌pbp2B基因第二個保守基序SSN附近T445A突變使其對青霉素的親和力下降了65%。另有文獻(xiàn)[20]也發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌pbp2x基因活性位點(diǎn)基序S337TMK中T338G/A和M339F/L突變可降低細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的親和力。國內(nèi)文獻(xiàn)[21]報道，當(dāng)青霉素對肺炎鏈球菌株MIC>2 mg/L時,大多數(shù)菌株pbp1a和pbp2b基因發(fā)生了多位點(diǎn)突變。肺炎鏈球菌的PBPs點(diǎn)突變可產(chǎn)生累積效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)[22]。由于肺炎鏈球菌不產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，因此PBPs突變可能是該菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要機(jī)制，值得進(jìn)一步深入研究。

2.1.2 murM基因 肺炎鏈球菌murM基因產(chǎn)物為氨基酰連接酶，催化Ala-tRNAAla或Ser-tRNASer與肽聚糖合成中間產(chǎn)物Ⅱ的連接，此連接物可使細(xì)菌對青霉素、頭孢噻肟/頭孢曲松高水平耐藥，但高水平耐藥必須發(fā)生在菌株有pbp1a、pbp2b、pbp2x基因突變的基礎(chǔ)上[23]。

2.1.3 細(xì)菌感受態(tài) 細(xì)菌感受態(tài)(competence)是指細(xì)菌細(xì)胞膜通透性明顯增強(qiáng)而能從環(huán)境中攝取大分子物質(zhì)的獨(dú)特狀態(tài)。人工用化學(xué)試劑能使許多細(xì)菌處于感受態(tài)，但能自然產(chǎn)生感受態(tài)的細(xì)菌很少。肺炎鏈球菌在其高水平comC基因產(chǎn)物感受態(tài)刺激肽(competence stimulating peptide，CSP)誘導(dǎo)下自然形成感受態(tài)，comD/comE基因產(chǎn)物跨膜組氨酸激酶(histidine kinase，HK)/胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白(transcription regulation protein，TRP)二元信號系統(tǒng)(two-component signaling system，TCSS)上調(diào)CSP表達(dá)。HK抑制劑氯氰碘柳胺(closantel)作用肺炎鏈球菌后，細(xì)菌感受態(tài)缺陷，對頭孢胺噻等β-內(nèi)酰類抗生素的耐藥性顯著增強(qiáng)，此耐藥性產(chǎn)生機(jī)制與PBPs突變無關(guān)[24]。

2.1.4 CiaH/CiaR-TCSS變異 肺炎鏈球菌CiaH胞外區(qū)可感受環(huán)境中Ca2+水平變化，胞內(nèi)區(qū)具有HK活性，可磷酸化激活下游作為TRP的CiaR，CiaR活化后可調(diào)控多個靶基因轉(zhuǎn)錄，從而參與細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)菌素、維持細(xì)胞壁完整性、黏附定殖能力與毒力以及對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性。CiaH或CiaR基因敲除，可導(dǎo)致肺炎鏈球菌產(chǎn)生與PBPs突變無關(guān)的對青霉素和頭孢噻肟高耐藥性[25-26]。文獻(xiàn)[27]報道，CiaH/CiaR抑制肺炎鏈球菌形成感受態(tài)，顯著提高pbp2x突變株對細(xì)胞壁抑制劑介導(dǎo)細(xì)菌溶解的抵抗力，CiaH/CiaR失活后細(xì)菌可產(chǎn)生對抗生素耐藥性。

2.1.5 cpoA基因 肺炎鏈球菌cpoA基因產(chǎn)物為糖基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白，可調(diào)節(jié)細(xì)胞壁合成并參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，使肽聚糖缺陷菌株仍能生存，但該基因敲除后細(xì)菌只能形成低水平遲發(fā)性感受態(tài)，同時產(chǎn)生與PBPs突變無關(guān)的對哌拉西林耐藥性[27]。

2.1.6 StkP-PhpP信號偶聯(lián) 肺炎鏈球菌stkP和PhpP基因組成操縱子結(jié)構(gòu)(stkP-PhpP)，前者表達(dá)產(chǎn)物是跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，STK)，后者是PP2Cc型磷酸酶(phosphotase)，兩者組成StkP-PhpP信號偶聯(lián)(signal couple)，在細(xì)胞壁合成、細(xì)胞生長和分裂繁殖、細(xì)菌毒力等方面發(fā)揮重要作用[28]。文獻(xiàn)[29]首次報道，stkP基因與肺炎鏈球菌產(chǎn)生PBPs非依賴青霉素耐藥性密切相關(guān)。其他文獻(xiàn)[30]報道，亞致死量青霉素和頭孢噻肟可誘導(dǎo)肺炎鏈球菌表達(dá)PhpP，PhpP基因敲除后可導(dǎo)致StkP磷酸化，產(chǎn)生與PBPs突變無關(guān)的對青霉素和頭孢噻肟高耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌CiaH/CiaR-TCSS中CiaR可與3個pbps基因啟動子結(jié)合并調(diào)控其表達(dá)[26]。文獻(xiàn)[31]報道，肺炎鏈球菌CiaR也可作為StkP激酶下游TRP，與StkP組成StkP/CiaR-TCSS參與亞致死量青霉素和頭孢噻肟誘導(dǎo)的細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生。

2.2 對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機(jī)制

由于肺炎鏈球菌對青霉素等β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥率不斷升高，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素成為臨床上治療肺炎鏈球菌感染性疾病常用藥物之一，但其廣泛使用導(dǎo)致許多國家和地區(qū)逐漸出現(xiàn)了大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥肺炎鏈球菌菌株并開始流行。根據(jù)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥表型差異可將肺炎鏈球菌分為M型和MLSB型。M型菌株具有mefA/E基因，對14元環(huán)(如紅霉素等)和15元環(huán)(如阿齊霉素等)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素低水平耐藥，但對16元環(huán)(如麥迪霉素、螺旋霉素等)大環(huán)內(nèi)酯類以及林可霉素類抗生素敏感。MLSB型菌株同時具有mefA/E和ermB基因，對大環(huán)內(nèi)酯類和林可霉素類抗生素均耐藥。肺炎鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機(jī)制主要是ermB基因產(chǎn)物甲基化酶對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素結(jié)合核糖體的位點(diǎn)進(jìn)行甲基化修飾和mefA/E基因產(chǎn)物組成的藥物主動外排泵外排功能增強(qiáng)，少數(shù)菌株可因核糖體突變對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥[32-35]。

2.2.1 核糖體甲基化酶修飾 ermB基因產(chǎn)物是核糖體甲基化酶。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)為肺炎鏈球菌核糖體的50S亞基23S rRNA 2 058位腺嘌呤殘基，核糖體可使該腺嘌呤殘基二甲基化，導(dǎo)致大環(huán)內(nèi)酯類抗生素結(jié)合核糖體的能力以及親和力顯著下降。例如，僅有ermB基因的肺炎鏈球菌菌株，即可表現(xiàn)為對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素高水平耐藥(如紅霉素MIC>64 mg/L)，但僅有mefA基因的肺炎鏈球菌菌株對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素低水平耐藥(如紅霉素MIC為1～32 mg/L)。

2.2.2 藥物主動外排增強(qiáng) 由mef基因和mel基因編碼的主動外排泵介導(dǎo)。不同細(xì)菌mef基因有mefA、mefE和同源物mefI，但序列同源性均高達(dá)90%以上，可利用質(zhì)子流驅(qū)動將大環(huán)內(nèi)酯類抗生素從菌體內(nèi)胞中排出。mel基因又稱為msrD基因，與金黃色葡萄球菌mrsA基因同源，編碼ABC藥物外排泵ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可將大環(huán)內(nèi)酯類抗生素從核糖體中置換出來并轉(zhuǎn)移至mef外排泵進(jìn)行外排。肺炎鏈球菌mefE基因產(chǎn)物為405個氨基酸組成的外排泵蛋白，與mel基因產(chǎn)物一起作為雙組分外排泵運(yùn)行，共同介導(dǎo)細(xì)菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性。

2.2.3 核糖體突變 近年發(fā)現(xiàn)少數(shù)肺炎鏈球菌菌株核糖體突變也可導(dǎo)致對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥，如核糖體23S rRNA突變和/或核糖體蛋白L4和L22編碼基因突變。

2.3 對喹諾酮類抗生素的耐藥機(jī)制

喹諾酮類抗生素由人工合成，故一些研究將其稱為抗菌藥物而非抗生素，臨床上主要用于治療泌尿生殖道系、呼吸道和腹部感染。喹諾酮類抗生素通過抑制細(xì)菌DNA合成來達(dá)到抗菌效果，通常有兩個藥物作用靶點(diǎn)：參與DNA復(fù)制的DNA回旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ。對大多數(shù)革蘭氏陽性菌，環(huán)丙沙星等喹諾酮類抗生素主要抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ、其次是DNA回旋酶，對革蘭氏陰性菌則相反。由于對青霉素等β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的肺炎鏈球菌菌株流行，臨床治療兒童肺炎鏈球菌感染性疾病時使用氟喹諾酮類抗生素的情況也日趨增多。肺炎鏈球菌對氟喹諾酮類抗生素主要有兩個耐藥機(jī)制：DNA回旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ中喹諾酮類耐藥決定區(qū)域(quinolone resistance-determining region，QRDR)變異以及藥物外排泵作用增強(qiáng)[36-37]。

2.3.1 QRDR變異 DNA回旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ均為兩個亞基組成的異源四聚體。DNA回旋酶兩個亞基分別由gyrA和gyrB基因編碼，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ兩個亞基分別由parC和parE基因編碼，任一亞基突變均有可能對氟喹諾酮類抗生素產(chǎn)生耐藥性。gyrA和parC基因中一段核苷酸序列與喹諾酮類耐藥密切相關(guān)，稱為QRDR，gyrA或parC基因QRDR突變均導(dǎo)致肺炎鏈球菌對喹諾酮類抗生素低水平耐藥，gyrA和parC基因QRDR均突變時，可產(chǎn)生對氟喹諾酮類抗生素高水平耐藥性。

2.3.2 藥物主動外排增強(qiáng) 肺炎鏈球菌主動外排喹諾酮類抗生素是耐藥的重要機(jī)制，但主要引起低水平耐藥。有研究發(fā)現(xiàn)，25個醫(yī)療中心分離的205株喹諾酮類抗生素耐藥肺炎鏈球菌中68%無QRDR突變，但外排泵抑制劑利血平作用后，這些耐藥菌株對喹諾酮類抗生素敏感[38]。

3 肺炎鏈球菌血清型與耐藥性關(guān)系

根據(jù)莢膜多糖及其抗原性差異，肺炎鏈球菌可分為不同血清型[39]。近年有研究報道，不同血清型肺炎鏈球菌菌株對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性特異性差異較大，致病性也有所不同[40]。研究發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌19A、19F、35B、6A、6B、23A、9V、15A和14血清型顯示出較高的青霉素耐藥率，19A、6A、19F、6B、15A、9V和14血清型顯示出較高的紅霉素耐藥性水平[6]。在中國兒童中流行的肺炎鏈球菌血清型主要有19F、19A、14、6A/B和23F，其中19F其次是19A血清型對多種抗生素的耐藥率高于所有其他血清型[5,41]。

4 小結(jié)和展望

肺炎鏈球菌是常見病原性革蘭氏陽性雙球菌，臨床上通常采用β-內(nèi)酰胺類抗生素治療。由于近年來β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥肺炎鏈球菌菌株日趨流行，臨床上也采用其他抗生素治療肺炎鏈球菌感染性疾病，其中以大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類抗生素較為常用。肺炎鏈球菌耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣。迄今未發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌能產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，該菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥主要是PBPs突變，其次是與PBPs突變無關(guān)的介導(dǎo)細(xì)菌感受態(tài)的ComD/ComE-TCSS以及調(diào)控細(xì)胞壁合成或完整性的CiaH/CiaR-TCSS和StkP-PhpP信號偶聯(lián)相關(guān)基因突變，其耐藥機(jī)制迄今未完全明了。肺炎鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥機(jī)制主要是ErmB甲基化酶對藥物作用的核糖體靶點(diǎn)甲基化修飾和MefA/E藥物外排泵功能增強(qiáng)。肺炎鏈球菌對喹諾酮類抗生素的耐藥機(jī)制是DNA回旋酶和/或拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ中QRDR變異和藥物外排作用增強(qiáng)。肺炎鏈球菌血清型與耐藥性也有一定關(guān)系，其中19F和19A血清型不僅常在臨床病人中檢出，同時對多種抗生素有較高耐藥率，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。此外，耐藥是細(xì)菌與抗菌藥物相互作用的結(jié)果。因此，研究并闡明細(xì)菌感知環(huán)境中抗菌藥物并進(jìn)行適應(yīng)性應(yīng)答與耐藥機(jī)制直接相關(guān)，如β-內(nèi)酰胺類抗生素誘導(dǎo)其受體分子PBPs結(jié)合抗生素位點(diǎn)或基序(motif)突變使其與抗生素結(jié)合能力下降甚至消失，通過細(xì)菌二元信號傳導(dǎo)系統(tǒng)感知環(huán)境中氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類以及喹諾酮類等作用于細(xì)菌核糖體的抗生素分子后下調(diào)其入胞膜通道表達(dá)或降低抗生素通透率，通過細(xì)菌二元信號傳導(dǎo)系統(tǒng)感知菌體內(nèi)抗生素并激活細(xì)菌分泌系統(tǒng)外排抗生素的作用與機(jī)制，將使人們對細(xì)菌耐藥的本質(zhì)有更為深入的了解，也可為新型抗生素研發(fā)提供思路和依據(jù)。