張利英,張苡銘,周妮娜,盧志偉,丁 楠,華君瑞,李洋洋,周 婷,劉 穎,3*,劉永琦,4*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國甘肅蘭州730000;2.中國科學(xué)院近代物理研究所甘肅省空間輻射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國甘肅蘭州730000;3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院急診科,中國甘肅蘭州730000;4.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國甘肅蘭州730000)

國家癌癥中心2019年數(shù)據(jù)顯示,肺癌是我國發(fā)生率、死亡率最高的癌癥[1]。放療是臨床上肺癌治療比較常用且有效的方法之一[2],但是在放療的過程中,高能射線除了能夠殺死腫瘤細(xì)胞,也會給放療病人帶來一些毒副作用,導(dǎo)致微核形成、DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand break,DSB)、氧化自由基產(chǎn)生、免疫系統(tǒng)功能改變以及造血系統(tǒng)損害[3]。輻射生物學(xué)中把受照射細(xì)胞影響其周圍沒有受到輻射的細(xì)胞,使未受照射細(xì)胞也出現(xiàn)相同的損傷現(xiàn)象稱為輻射旁效應(yīng)(radiation-induced bystander effect,RIBE)[4]。多項(xiàng)研究已證明,活性氧(reactive oxygen species,ROS)、一氧化氮(nitric oxide,NO)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)等可溶性因子可介導(dǎo)RIBE 的發(fā)生,引起旁組織細(xì)胞或遠(yuǎn)端組織器官出現(xiàn)基因突變、基因組不穩(wěn)定性增加、染色體畸變和細(xì)胞凋亡等損傷[5～6]。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)ROS、NO和TGF-β1在RIBE中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。因此,研究上述因子在肺癌放療時(shí)由于RIBE而誘發(fā)的旁組織、細(xì)胞等基因組不穩(wěn)定性中的作用非常必要。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)是造血微環(huán)境的核心,易受到輻射出現(xiàn)急性損傷[8],而其結(jié)構(gòu)和功能的完整性是生理狀態(tài)尤其是應(yīng)激條件下維持造血功能穩(wěn)定和造血重建的基礎(chǔ)[9]。在肺癌放療過程中,BMMSCs會受到直接照射,或者由于可溶性因子介導(dǎo)RIBE而發(fā)生損傷,但是哪種因素占主導(dǎo)作用仍未可知。本研究擬建立直接輻照BMMSCs(即IR組)、轉(zhuǎn)移輻照A549的條件培養(yǎng)基作用于BMMSCs(即A549-medium組)、轉(zhuǎn)移輻照BMMSCs的條件培養(yǎng)基作用于BMMSCs(即BMMSCs-medium組)3種模型,觀察BMMSCs在3種模型中的基因組損傷情況,以衡量在肺癌輻照時(shí)引起B(yǎng)MMSCs旁損傷的權(quán)重因素,為BMMSCs的防護(hù)靶點(diǎn)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司,美國);熒光顯微鏡(Nikon公司,日本);BMMSCs及其專用培養(yǎng)基(ScienCell公司,美國);人A549細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心);DMEM/F-12 1∶1(1X)培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司,美國);細(xì)胞松弛素B(北京索萊寶科技有限公司);4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(Sigma公司,美國);53BP1(tumor suppressor p53 binding protein 1)兔抗、免疫熒光抗體594羊抗兔(Abcam公司,美國);人TGF-β1 ELISA Kit(北京欣博盛生物科技有限公司);人NO ELISA Kit和人ROS ELISA Kit(上海西唐生物科技有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

BMMSCs用專用培養(yǎng)基培養(yǎng),A549用DMEM/F-12 1∶1(1X)培養(yǎng)基培養(yǎng)。將細(xì)胞置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中用60 mm的培養(yǎng)皿培養(yǎng)。每2～3 d換液1次,待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%后,用0.25%胰蛋白酶消化傳代,第5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞輻照和條件培養(yǎng)液的收集

電離輻射(ionizing radiation,IR)由中國科學(xué)院近代物理研究所的X射線輻照裝置提供,劑量率為0.6 Gy/min(100 KeV,5 mA),輻照總劑量分別為1 Gy、2 Gy、4 Gy。輻照前吸取培養(yǎng)基剩至1 mL。

細(xì)胞接種后培養(yǎng)18～24 h,更換新鮮培養(yǎng)基,然后進(jìn)行輻照處理。繼續(xù)培養(yǎng)3 h后,收集培養(yǎng)基,10 000 r/min離心5 min,去除細(xì)胞碎片,即為條件培養(yǎng)基。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為正常BMMSCs組(Control)、直接照射BMMSCs組(IR)、A549旁效應(yīng)組(A549-medium)和BMMSCs旁效應(yīng)組(BMMSCs-medium)。Control組中的BMMSCs不接受任何處理,IR組用0 Gy、1 Gy、2 Gy、4 Gy的X射線輻射正常的BMMSCs,A549-medium 組用 0 Gy、1 Gy、2 Gy、4 Gy 的 X 射線輻照A549后轉(zhuǎn)移其條件培養(yǎng)基作用于正常的BMMSCs,BMMSCs-medium 組用 0 Gy、1 Gy、2 Gy、4 Gy的X射線輻照BMMSCs后轉(zhuǎn)移其條件培養(yǎng)基作用于正常的BMMSCs。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 克隆形成實(shí)驗(yàn)測定BMMSCs的克隆存活率

取對數(shù)生長期BMMSCs制成單細(xì)胞懸液,種于60 mm的培養(yǎng)皿中,每皿100個(gè)細(xì)胞,24 h后Control組更換為新鮮培養(yǎng)液,IR組更換為新鮮培養(yǎng)液后照射,A549-medium組和BMMSCs-medium組分別更換為A549條件培養(yǎng)基和BMMSCs條件培養(yǎng)基,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。13 d后棄培養(yǎng)液,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)快速洗3遍,甲醇固定15 min,亞甲基藍(lán)染色30 min,用清水將培養(yǎng)皿洗凈晾干。顯微鏡下計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞集落。細(xì)胞克隆存活率按如下公式計(jì)算:細(xì)胞克隆存活率=處理組克隆形成率/對照組克隆形成率。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.5.2 細(xì)胞松弛素法檢測細(xì)胞微核形成率

取對數(shù)生長期BMMSCs制成單細(xì)胞懸液1×104mL-1,接種至24孔板,貼壁后Control組更換為新鮮培養(yǎng)液,IR組更換為新鮮培養(yǎng)液后照射,A549-medium組和BMMSCs-medium組分別更換為A549條件培養(yǎng)基和BMMSCs條件培養(yǎng)基。各組細(xì)胞加入1 μL細(xì)胞松弛素B(終質(zhì)量濃度4 μg/mL)培養(yǎng)48 h,隨后PBS洗兩次,冰乙酸和甲醇(體積比1∶9)固定,通風(fēng)櫥干燥20 min,吖啶橙染料染色。最后,計(jì)算細(xì)胞微核率[10],即用熒光顯微鏡觀察1 000個(gè)雙核細(xì)胞,計(jì)數(shù)細(xì)胞微核數(shù)所占細(xì)胞總數(shù)的千分率(‰)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.5.3 免疫熒光檢測53BP1焦點(diǎn)形成水平

取無菌的12孔板,每孔加入20 mm×20 mm已滅菌蓋玻片。將BMMSCs制成2×103mL-1單細(xì)胞懸液,種入12孔板(每孔2 mL),每組設(shè)3次重復(fù)。貼壁后Control組更換為新鮮培養(yǎng)液,IR組更換為新鮮培養(yǎng)液后照射,A549-medium組和BMMSCs-medium組分別更換為A549條件培養(yǎng)基和BMMSCs條件培養(yǎng)基。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)0.5 h后收集樣品[11]。冷甲醇中固定20 min后,0.5%Triton-X 100孵育10 min;5%脫脂牛奶封閉1 h后與兔抗53BP1多克隆抗體在室溫孵育2 h,用PBST洗滌3遍后再與IgG免疫熒光二抗在室溫孵育1 h,用PBST洗滌5遍,細(xì)胞核以DAPI進(jìn)行復(fù)染并制片。熒光顯微鏡觀察并拍照,每個(gè)樣品計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞并計(jì)算平均焦點(diǎn)數(shù)目。

1.5.4 ELISA法檢測旁效應(yīng)組培養(yǎng)上清中TGF-β1、ROS和NO的水平

取對數(shù)生長期BMMSCs和A549,分別制成1×104mL-1的單細(xì)胞懸液,種于35 mm的培養(yǎng)皿中,24 h貼壁后更換新鮮培養(yǎng)基,2 Gy X射線照射,各組細(xì)胞分別培養(yǎng) 0.5 h、2 h、6 h、8 h,在對應(yīng)的不同時(shí)間點(diǎn)收集樣品[11],按照ELISA試劑盒說明書步驟進(jìn)行目標(biāo)因子的檢測。

1.5.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同劑量X射線對直接輻照組和旁效應(yīng)組細(xì)胞克隆存活率的影響

圖1和表1表示不同處理組細(xì)胞的克隆存活率水平。從結(jié)果可知,IR組細(xì)胞、旁效應(yīng)組(A549-medium組和BMMSCs-medium組)細(xì)胞的克隆存活率均隨著輻照劑量的增加而降低;與0 Gy IR組相比較,1 Gy、2 Gy及4 Gy輻照劑量下各組細(xì)胞的克隆存活率均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。此外,在同一輻照劑量下,IR組細(xì)胞的克隆存活率均顯著低于旁效應(yīng)組(P＜0.05);A549-medium組細(xì)胞的克隆存活率較BMMSCs-medium組偏低,且輻照劑量在2 Gy和4 Gy時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖1 不同處理組細(xì)胞的克隆存活率統(tǒng)計(jì)分析圖*:P＜0.05,**:P＜0.01 vs.空白對照組(0 Gy IR);▲:P＜0.05 vs.IR組(同一輻照劑量);#:P＜0.05 vs.A549-medium組(同一輻照劑量)。Fig.1 The cell clone formation rates in different groups treated with various radiation doses*:P＜0.05,**:P＜0.01,compared with control group(0 Gy IR);▲:P＜0.05,compared with IR group(at the same dose);#:P＜0.05,compared with A549-medium group(at the same dose).

表1 不同處理組細(xì)胞的克隆存活率Table 1 The cell clone formation rates in different treatment groups

2.2 不同劑量X射線對直接輻照組和旁效應(yīng)組細(xì)胞微核形成率的影響

圖2、圖3分別表示不同處理組細(xì)胞微核形成率的顯微觀察結(jié)果和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:各組細(xì)胞微核率呈現(xiàn)輻照劑量依賴性增大;與0 Gy IR組相比較,旁效應(yīng)組(A549-medium組和 BMMSCs-medium 組)在 1 Gy、2 Gy及 4 Gy輻照劑量下的微核數(shù)均增多,且在2 Gy和4 Gy時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);4 Gy直接照射時(shí),細(xì)胞微核率最大。此外,在同一輻照劑量下,IR組較旁效應(yīng)組(A549-medium組和BMMSCs-medium組)的微核率高,并在輻照劑量為2 Gy和4 Gy時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在同一輻照劑量的旁效應(yīng)組中,A549-medium組的微核率較BMMSCsmedium組高,并在輻照劑量為2 Gy和4 Gy時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖2 不同處理組在2 Gy輻照劑量時(shí)對細(xì)胞微核形成影響的顯微觀察圖(40×)經(jīng)吖啶橙染色的細(xì)胞微核結(jié)果,黃色箭頭指示細(xì)胞在進(jìn)行有絲分裂時(shí)形成的微小的核結(jié)構(gòu)樣物質(zhì)。A:Control組;B:IR組;C:A549-medium組;D:BMMSCs-medium組。Fig.2 Micronucleus formation in cells treated with 2 Gy dose in different groups(40×)The cells were stained with acridine orange.The yellow arrows indicate the tiny nuclear structure-like substance formed in cells during mitosis.A:Control group;B:IR group;C:A549-mediumgroup;D:BMMSCs-medium group.

圖3 不同處理組細(xì)胞微核形成率的統(tǒng)計(jì)分析圖*:P＜0.05,**:P＜0.01 vs.空白對照組(0 Gy IR);▲:P＜0.05,▲▲:P＜0.01 vs.IR組(同一輻照劑量);#:P＜0.05 vs.A549-medium組(同一輻照劑量)。Fig.3 The rates of micronucleus formation in cells treated with various radiation doses in different groups*:P＜0.05,**:P＜0.01,compared with control group(0 Gy IR);▲:P＜0.05,▲▲:P＜0.01,compared with IR group(at the same dose);#:P＜0.05,compared with A549-medium group(at the same dose).

2.3 不同劑量X射線對直接輻照組和旁效應(yīng)組細(xì)胞DSB損傷的影響

圖4表示不同劑量、不同處理組細(xì)胞53BP1焦點(diǎn)數(shù)目的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果,圖5表示2 Gy X射線照射0.5 h后各組細(xì)胞53BP1焦點(diǎn)的免疫熒光分析結(jié)果。從結(jié)果可知,各組細(xì)胞的53BP1焦點(diǎn)數(shù)呈現(xiàn)輻照劑量依賴性增大;在同一輻照劑量下,IR組比旁效應(yīng)組(A549-medium組和BMMSCs-medium組)細(xì)胞的53BP1焦點(diǎn)數(shù)高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在同一輻照劑量的旁效應(yīng)組中,A549-medium組的53BP1焦點(diǎn)數(shù)較BMMSCs-medium組高,并在輻照劑量為2 Gy和4 Gy時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖4 不同處理組細(xì)胞的53BP1焦點(diǎn)數(shù)目*:P＜0.05,**:P＜0.01 vs.空白對照組(0 Gy IR);▲:P＜0.05,▲▲:P＜0.01 vs.IR 組(同一輻照劑量);#:P＜0.05 vs.A549-medium組(同一輻照劑量)。Fig.4 53BP1 foci detection in different treatment groups*:P＜0.05,**:P＜0.01,compared with control group(0 Gy IR);▲:P＜0.05,▲▲:P＜0.01,compared with IR group(at the same dose);#:P＜0.05,compared with A549-medium group(at the same dose).

圖5 2 Gy輻照0.5 h時(shí)不同處理組細(xì)胞53BP1焦點(diǎn)水平的免疫熒光圖(60×)(A)DAPI染色細(xì)胞核(藍(lán)色);(B)免疫熒光染色53BP1(紅色);(C)DAPI染色細(xì)胞核和免疫熒光染色53BP1的合成圖(merger)。標(biāo)尺:50 μm。Fig.5 53BP1 foci detection by fluorescence microscope after 2 Gy radiation for 0.5 h(60×)(A)Nuclei stained by DAPI(blue);(B)53BP1 stained by immunofluorescence(red);(C)Images merged by corresponding(A)and(B).Scale bar:50 μm.

2.4 旁效應(yīng)組條件培養(yǎng)液中不同時(shí)間點(diǎn)ROS、NO和TGF-β1的表達(dá)水平

為探究輻射旁效應(yīng)中可能發(fā)揮作用的物質(zhì)及分子,本研究進(jìn)一步用ELISA法檢測了2 Gy輻照下A549和BMMSCs條件培養(yǎng)液中ROS、NO和TGF-β1的表達(dá)水平。從圖6可知,在旁效應(yīng)組的A549和 BMMSCs條件培養(yǎng)液中,TGF-β1、ROS和NO的相對表達(dá)水平均升高,其中,TGF-β1的水平隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加;ROS的水平在2 h達(dá)到最高峰,之后迅速降低;NO的水平則在0.5 h達(dá)到最高峰,之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長緩慢降低。此外,與BMMSCs-medium組相比,A549-medium組條件培養(yǎng)液中TGF-β1和ROS的表達(dá)水平在6 h、8 h顯著升高(P＜0.05),NO的表達(dá)水平在2 h、6 h、8 h 時(shí)顯著升高(P＜0.05)。

3 討論

放療是肺癌的主要治療手段之一,尤其是對于早期非小細(xì)胞肺癌,放射治療效果顯著。但困擾臨床的主要問題之一就是在肺癌放療過程中所產(chǎn)生的副作用,即肺癌輻照過程會引起非輻照部位的損傷效應(yīng),并且臨床上的輻射副作用從某種程度上可以用生物醫(yī)學(xué)上的RIBE來解釋。RIBE在生物學(xué)上主要表現(xiàn)為細(xì)胞生長受抑、細(xì)胞凋亡、基因突變、基因組不穩(wěn)定性增加、染色體畸變甚至形成二次癌癥等[6,8]。53BP1是DSB中的重要調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)。在輻射誘發(fā)的DSB中,53BP1被迅速招募至DSB處并聚集形成熒光顯微鏡下清晰可見的焦點(diǎn),是輻射致DSB損傷的重要標(biāo)志之一。微核是細(xì)胞在進(jìn)行有絲分裂時(shí)所形成的微小的核結(jié)構(gòu)樣物質(zhì)。已有多項(xiàng)研究表明,輻射時(shí)細(xì)胞微核增多、DSB升高,造成輻射細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性增加,并且會誘導(dǎo)細(xì)胞生長受抑、克隆水平降低[7,11]。因此,本研究用53BP1所形成的焦點(diǎn)數(shù)、細(xì)胞微核率和細(xì)胞克隆存活水平來評估輻射損傷所致細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性的水平。

BMMSCs具有自我更新、多向分化以及免疫調(diào)節(jié)等功能,是肺癌微環(huán)境中重要間質(zhì)成分之一[12],具有良好的靶向趨向能力。BMMSCs具有向肺損傷、肺癌組織歸巢遷移的能力[13],通過定植分化為Ⅰ型和Ⅱ型肺上皮細(xì)胞等正常細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)和建立較強(qiáng)的抗氧化防御系統(tǒng),維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[14]。但由于RIBE的存在,機(jī)體在進(jìn)行肺癌放療時(shí),旁BMMSCs易受到損傷,出現(xiàn)生長受抑和基因組損傷,甚至分化為腫瘤干細(xì)胞,使機(jī)體形成二次腫瘤的可能性大大增加。在肺癌放療過程中,BMMSCs往往會受到比較復(fù)雜的照射作用,會接收到直接照射,也會因可溶性因子介導(dǎo)RIBE發(fā)生損傷,其中哪一種因素占主導(dǎo)作用仍未可知。為驗(yàn)證肺癌輻射時(shí)BMMSCs損傷的權(quán)重情況,本研究采用直接照射法、轉(zhuǎn)移A549輻照培養(yǎng)基法、轉(zhuǎn)移BMMSCs輻照培養(yǎng)基法分別作用于BMMSCs,以模擬肺癌放療過程中BMMSCs可能接受到的復(fù)雜情況。結(jié)果顯示,直接照射BMMSCs時(shí),BMMSCs的生長減慢(圖1和表1),微核和53BP1焦點(diǎn)增多(圖2～5),說明直接輻射組BMMSCs的增殖和基因組不穩(wěn)定性均出現(xiàn)異常;同時(shí),旁效應(yīng)組中也出現(xiàn)了上述表現(xiàn),但是不同種類的條件培養(yǎng)基作用后損傷程度不同,其中輻照A549所獲得的條件培養(yǎng)基對BMMSCs的影響要強(qiáng)于輻照BMMSCs所獲得的條件培養(yǎng)基對BMMSCs的影響(圖 1～5)。

為進(jìn)一步探討其機(jī)制,對A549條件培養(yǎng)基和BMMSCs條件培養(yǎng)基中的可溶性分子TGF-β1、ROS以及NO進(jìn)行了研究。目前,在轉(zhuǎn)移輻射條件培養(yǎng)基模型中,已有多種旁效應(yīng)信號因子被確認(rèn),如白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-1、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、TGF-β、ROS和NO等[15]。其中,TGF-β作為旁損傷效應(yīng)的關(guān)鍵因子,能夠顯著抑制細(xì)胞的增殖[15];NO在旁效應(yīng)中起到了先鋒的作用,被稱為旁損傷的罪魁禍?zhǔn)譡16];ROS也可作為旁損傷的終點(diǎn)指標(biāo),并在引起基因組不穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用[17]。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)ROS、NO和TGF-β1在RIBE中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。本實(shí)驗(yàn)中,我們選取ROS、NO和TGF-β1為考察指標(biāo),分別檢測其在不同時(shí)間點(diǎn)條件培養(yǎng)液中的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),3種因子在照射后的條件培養(yǎng)液中的表達(dá)水平均比非照射條件培養(yǎng)液高,且TGF-β1的水平隨著輻照時(shí)間的延長不斷增加,而ROS和NO的水平分別在2 h和0.5 h達(dá)到最高峰;此外,3種因子在A549條件培養(yǎng)液中的水平基本要高于BMMSCs條件培養(yǎng)液中的水平(圖6)。有研究表明,輻射后的細(xì)胞所分泌的TGF-β1參與旁效應(yīng),誘導(dǎo)NADPH氧化酶的活化,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加;同時(shí),TGF-β1、IL-8也可以激活絲裂原激活的蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)通路,使旁效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS[18～19]。另外,Shao等[20]的研究證實(shí)NO的下游產(chǎn)物是由輻射誘導(dǎo)TGF-β1產(chǎn)生的,且NO與TGF-β1兩種信號分子相互依存。當(dāng)部分靶細(xì)胞受到照射時(shí),NO及其下游產(chǎn)物TGF-β1由靶細(xì)胞釋放,一旦TGF-β1與未照射細(xì)胞相互作用,即可通過依賴Ca2+的途徑誘導(dǎo)胞內(nèi)第二旁效應(yīng)信號NO生成,并進(jìn)一步誘導(dǎo)鄰近細(xì)胞微核形成。綜上所述,3種細(xì)胞因子可能是誘發(fā)RIBE的關(guān)鍵因子,且TGF-β作為旁效應(yīng)最關(guān)鍵的細(xì)胞因子之一,其水平的升高可以引起ROS和NO的生成,從而介導(dǎo)RIBE的發(fā)生。

圖6 旁效應(yīng)組條件培養(yǎng)液中不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1、ROS和NO的表達(dá)水平分析*:P＜0.05 vs.BMMSCs-medium 組(2 Gy)。Fig.6 The relative concentrations of TGF-β1,ROS and NO in conditioned mediums at different time points*:P＜0.05,compared with BMMSCs-medium group(at 2 Gy dose).

總的來講,本研究顯示輻射可致BMMSCs的增殖和基因組不穩(wěn)定性均受到影響;這種損傷能夠通過條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)未照射細(xì)胞產(chǎn)生相似的損傷效應(yīng),其中輻照A549所獲得的條件培養(yǎng)基對BMMSCs的影響要強(qiáng)于輻照BMMSCs所獲得的條件培養(yǎng)基對BMMSCs的影響;ROS、TGF-β1和NO等分泌型因子可能是轉(zhuǎn)移輻射損傷、誘導(dǎo)RIBE的關(guān)鍵分子。