向禮波,何 敏,鄭 恒*

(1.湖北省農業(yè)科學院植保土肥研究所,中國湖北武漢430000;2.西藏大學理學院,中國西藏拉薩850000)

蝎子是地球上最古老的節(jié)肢動物之一,在中國,蝎子通常指東亞鉗蝎(Buthus martensii Karsch),屬節(jié)肢動物門、蛛形綱、蝎目、鉗蝎科、正鉗蝎屬。研究表明東亞鉗蝎腸道微生物種類豐富,群落復雜,對東亞鉗蝎消化和抵御外來菌群入侵具有重要作用[1]。

與東亞鉗蝎不同,西藏琵蝎(Scorpiops tibetanus)屬蝎目、真蝎科、西藏琵蝎屬,分布在中國西藏,是中國特有種,且生活在生態(tài)環(huán)境惡劣的青藏高原,因而對其展開研究具有重要科學價值。目前關于西藏琵蝎的研究較少,其腸道微生物的研究尚未見報道。本研究采用Illumina技術對西藏琵蝎腸道細菌進行高通量測序,利用生物信息學等方法對其腸道細菌多樣性、群落結構及16S rRNA功能進行研究,目的在于了解西藏琵蝎腸道細菌群落組成、多樣性及16S rRNA功能,并探討其腸道特有細菌的功能,以期為西藏琵蝎腸道細菌的功能探索和進一步開發(fā)利用及其適應青藏高原特殊生態(tài)環(huán)境的機制研究等提供參考。

1 材料與方法

1.1 西藏琵蝎采集及腸道提取

實驗采用的西藏琵蝎來源于西藏自治區(qū)拉薩市奪底鄉(xiāng),生境如圖1所示,按照文獻[2]鑒定為西藏琵蝎(Scorpiops tibetanus),形態(tài)如圖2所示。

圖1 西藏琵蝎生境圖Fig.1 S.tibetanus habitat

圖2 西藏琵蝎形態(tài)圖Fig.2 S.tibetanus morphology

參照文獻[1]的方法,取3只成年西藏琵蝎置于超凈工作臺,先敲擊頭部致其死亡,隨后75%乙醇浸泡5 min,無菌水沖洗3次,再用解剖刀進行解剖,用鑷子取出腸道組織,放入-80℃冰箱保存,以備后續(xù)實驗使用。

1.2 西藏琵蝎腸道總DNA提取、PCR擴增及測序

采用QIAamp DNA試劑盒(QIAGEN公司,德國)提取西藏琵蝎腸道總DNA,隨后取適量樣品進行基因組DNA檢測,濃度和純度檢測采用NanoDrop ND-2000分光光度計,完整性檢測采用1%瓊脂糖凝膠電泳(5 V/cm,20 min),濃度符合要求后進行PCR實驗。本研究主要對西藏琵蝎腸道細菌16S rRNA中V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增,通用引物338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG和806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成。反應體系(20 μL):5× buffer 4 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,正向引物(5 μmol/L)0.8 μL,反向引物(5 μmol/L)0.8 μL,聚合酶 0.4 μL,BSA 0.2 μL,模板 DNA 10 ng,加ddH2O至20 μL。PCR擴增條件:95℃3 min;95℃30 s,56℃30 s,72℃45 s,27個循環(huán);72℃10 min,10℃停止實驗。擴增成功后,樣本送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司,在Illumina HiSeq 2500平臺上進行高通量測序。

1.3 西藏琵蝎腸道細菌多樣性分析

為保證分析質量,用Flash 1.2.11軟件對原始序列進行拼接,采用Qiime 1.9.1軟件進行序列去重過濾,得到高質量序列。基于97%相似度,利用Uparse 7.0.1090軟件在Silva數據庫(https://www.arb-silva.de/)進行操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)物種分類學分析和聚類分析,分別在門(phylum)、目(order)、屬(genus)3 個分類學水平上分析物種組成[3]。

1.4 西藏琵蝎腸道細菌16S rRNA功能預測

基于eggNOG(evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups,http://eggnog.embl.de/)數據庫,使用PICRUSt 1.1.0軟件(http://picrust.github.io/picrust/)對西藏琵蝎腸道細菌COG(cluster of orthologous group)功能基因家族、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代謝通路及MetaCyc通路進行注釋[4～5]。

2 結果

2.1 西藏琵蝎腸道總DNA提取及高通量測序結果

西藏琵蝎腸道總DNA 3個樣本的質量濃度分別為 2.3 ng/μL、1.6 ng/μL 和 2.3 ng/μL,OD260/280分別為1.96、1.95和1.88,OD260/230均為0.01,均符合PCR實驗要求。通過高通量測序共得到121 890條原始序列,質控后得到106 686條高質量序列,平均每個樣本35 562條。在97%相似水平下注釋得到的OTU數量為883,共得到32個門,72個綱,173個目,281個科,479個屬。香農(Shannon)稀釋曲線均趨于平緩,說明該研究的測序數據合理,大多數的細菌包含在文庫中,基本能反映西藏琵蝎腸道樣本中細菌的組成,可以在門、目、屬上進行多樣性分析。

2.2 西藏琵蝎腸道菌群門水平上的多樣性

對樣品檢測到的所有OTU序列進行聚類注釋后得到32個門,其中相對豐度≥0.1%的門有12個,優(yōu)勢門為厚壁菌門(Firmicutes,57.82%)和變形桿菌門(Proteobacteria,28.25%),其后依次為放線菌門(Actinobacteria,4.60%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,4.36%)、綠彎菌門(Chloroflexi,2.26%)等,具體見圖3。

圖3 西藏琵蝎腸道細菌門水平的群落結構Fig.3 Community structure of S.tibetanus intestinal bacteria at the phylum level

2.3 西藏琵蝎腸道菌群目水平上的多樣性

對樣品檢測到的所有OTU序列進行聚類注釋后得到173個目,其中相對豐度≥0.1%的目有49個,優(yōu)勢目主要為芽孢桿菌目(Bacillales,55.19%),其次為腸桿菌目(Enterobacteriales,8.70%),具體見圖4。

圖4 西藏琵蝎腸道細菌目水平的群落結構Fig.4 Community structure of S.tibetanus intestinal bacteria at the order level

2.4 西藏琵蝎腸道菌群屬水平上的多樣性

對樣品檢測到的所有OTU序列進行聚類注釋后得到479個屬,其中相對豐度≥0.1%的屬有66個。短芽孢桿菌屬(Brevibacillus,24.63%)和解硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus,22.91%)為優(yōu)勢屬,屬于厚壁菌門,其后依次為類芽胞桿菌屬(Paenibacillus,7.13%)、腸桿菌科未知屬(unclassified Enterobacteriaceae,4.77%)、伯克霍爾德氏菌屬(Paraburkholderia,3.83%)、土桿菌屬(Geobacter,3.80%)、拉烏爾菌屬(Raoultella,3.67%)、青枯菌屬(Ralstonia,2.01%)、氣單胞菌屬(Aeromonas,1.45%)和鹽單胞菌屬(Halomonas,1.08%)等,具體見圖5。

圖5 西藏琵蝎腸道細菌屬水平的群落結構Fig.5 Community structure of S.tibetanus intestinal bacteria at the genus level

2.5 西藏琵蝎腸道細菌16S rRNA功能預測結果

從eggNOG數據庫獲得對應的COG家族基因信息,共比對到24個類別(圖6),主要的COG功能包括:氨基酸轉運和代謝(amino acid transport and metabolism),占9.02%;轉錄(transcription),占7.02%;無機離子轉運和代謝(inorganic ion transport and metabolism),占6.34%;碳水化合物的運輸和新陳代謝(carbohydrate transport and metabolism),占6.27%;細胞壁/膜/包膜生物發(fā)生(cell wall/membrane/envelope biogenesis),占6.17%;信號轉導機制(signal transduction mechanisms),占6.16%;復制、重組和修復(replication,recombination and repair),占5.80%;翻譯、核糖體結構和生物發(fā)生(translation,ribosomal structure and biogenesis),占5.38%;輔酶轉運和代謝(coenzyme transport and metabolism),占4.06%;蛋白質周轉、翻譯后修飾和分子伴侶(protein turnover,posttranslational modification,chaperones),占3.79%;脂質運輸和代謝(lipid transport and metabolism),占3.75%,共計11類功能基因家族,占比 63.76%。此外,未知功能(function unknown)和一般功能基因(general function prediction only)的比例分別為9.60%和8.26%。以上信息提示,未知功能基因豐度占比最大,說明西藏琵蝎腸道細菌具有十分豐富的潛在功能基因。

圖6 西藏琵蝎腸道細菌COG功能基因家族預測分析橫坐標代表COG二級功能編號,縱坐標代表功能豐度。Fig.6 Prediction and analysis of COG functional gene family of enterobacteria in S.TibetanusAbscissa represents COG secondary function number,and ordinate represents function abundance.

在KEGG數據庫注釋到300條代謝通路信息,其中在pathway level 1注釋到6大類代謝活動,分別為:新陳代謝(metabolism),占47.94%;環(huán)境信息處理(environmental information processing),占15.89%;遺傳信息處理(genetic information processing),占15.84%;細胞過程(cellular processes),占4.26%;人類疾病(human diseases),占0.85%;生物體系統(tǒng)(organismal systems),占0.72%。未分類(unclassified)和未注釋(none)的占比分別為 14.32%、0.17%。此外,MetaCyc通路共注釋到414條通路信息,前3類通路依次為PWY-3781有氧呼吸aerobic respiration I(cytochrome c)、PWY0-1586 肽聚糖合成peptidoglycan maturation(meso-diaminopimelate containing)和PWY-7111丙酮酸發(fā)酵產異丁醇pyruvate fermentation to isobutanol(engineered)。

3 討論

本文首次采用高通量測序技術及生物信息學等方法對西藏琵蝎腸道細菌多樣性進行研究,結果表明西藏琵蝎腸道細菌十分豐富,群落結構復雜,這可能與西藏琵蝎適應性強、食性雜有關。文中的數據分析結果顯示,在西藏琵蝎腸道細菌中厚壁菌門和變形桿菌門為優(yōu)勢類群,與已有報道中其他動物腸道菌優(yōu)勢類群[6～9]一致;優(yōu)勢目為芽孢桿菌目(占比55.19%),與Wang等[10]對蝦腸道菌的研究一致;優(yōu)勢屬為短芽孢桿菌屬(占比24.63%)和解硫胺素芽孢桿菌屬(占比22.91%),這是該兩個屬首次被報道為腸道優(yōu)勢屬的研究。王保軍等[1]研究表明,東亞鉗蝎腸道細菌的優(yōu)勢屬為假單胞菌屬(Pseudomonas)和不動桿菌屬(Acinetobacter),與本文中西藏琵蝎腸道細菌的優(yōu)勢屬存在較大差異,這可能和蝎的種類、食性及生境有關;此外,腸桿菌科未知屬、氣單胞菌屬及青枯菌屬為兩者共有屬,其中腸桿菌屬為腸道正常菌群,而氣單胞菌屬及青枯菌屬的作用尚不清楚,有待進一步研究。

由于高通量測序片段較短,為16S rRNA的V3～V4可變區(qū),因此本文只對優(yōu)勢種進行了注釋和統(tǒng)計。結果顯示,優(yōu)勢種為波茨坦短芽孢桿菌(Brevibacillus borstelensis)和解硫胺素芽孢桿菌(A-neurinibacillus aneurinilyticus),以上兩株細菌均為首次在動物腸道中發(fā)現。已有研究報道,波茨坦短芽孢桿菌可降解甲酚、苯酚及纖維素[11～12];解硫胺素芽孢桿菌可產生生物表面活性劑[13],可降解聚乳酸[14],對鉛、鋅具有較高的耐受性[15],由此推測它們可能是西藏琵蝎腸道中的特有優(yōu)勢種,具體功能值得進一步研究。

了解動物腸道細菌的功能對動物生理生態(tài)的研究以及腸道細菌資源的開發(fā)利用具有重要意義,本研究對西藏琵蝎腸道細菌16S rRNA功能的預測結果顯示,西藏琵蝎腸道細菌功能基因豐富,包含豐富的初級代謝和次級代謝通路,這為今后西藏琵蝎腸道細菌在宿主代謝、免疫以及維持自身動態(tài)平衡等方面的研究提供了參考依據。COG功能基因家族預測分析和KEGG代謝通路分析表明,西藏琵蝎腸道細菌的相關功能以新陳代謝為主,同時環(huán)境信息處理和遺傳信息處理的功能基因占比較大,這為西藏琵蝎腸道細菌發(fā)揮自身功能提供了可能。此外,在MetaCyc通路中有氧呼吸排第一,表明西藏琵蝎腸道細菌中好氧菌和兼性厭氧菌占比較大;丙酮酸發(fā)酵產異丁醇排第三,這個通路尚未在動物腸道中發(fā)現,其作用和機理有待進一步研究。

該研究對西藏琵蝎3個樣本進行合并分析,與單個樣本相比,優(yōu)勢門、目、屬及種仍是基本一致的,因此該研究滿足一般統(tǒng)計方法的最低樣本數量要求。為了能更好地反映西藏琵蝎腸道細菌多樣性,接下來將結合多樣性數據對西藏琵蝎腸道細菌進行可培養(yǎng)研究,并進行抗菌、降解生物質等活性的研究。總之,該研究為西藏琵蝎腸道菌相關研究提供了一定的參考,也為西藏琵蝎及青藏高原其他節(jié)肢動物的研究提供了新思路。