侯碧巍,陳蘇維

(安康學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學院,中國陜西安康725000)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是次于阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的第二常見神經(jīng)退行性疾病,其病理特征主要表現(xiàn)為腦部黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元變性和路易小體形成[1]。Bonifati等[2]于2003年在患帕金森病的意大利和荷蘭家族發(fā)現(xiàn)了DJ-1基因突變型:14 000 bp缺失和L166P點突變。此后,一些獨立研究表明,DJ-1不同突變型均與先天性或零散發(fā)病型帕金森病相關(guān)[3～5]。

許多學者對帕金森病相關(guān)基因DJ-1的功能進行了探討。Hao等[6]發(fā)現(xiàn),提高果蠅DJ-1表達水平可以降低由PINK1突變引起的功能損傷,而且這個作用取決于DJ-1的氨基酸殘基C106。Thomas等[7]認為,Parkin可能作為DJ-1的下游基因保護多巴胺能神經(jīng)細胞免受因DJ-1缺失引起的損傷。也有學者提出,PINK1、Parkin和DJ-1可能形成200 kD的復合物(PPD),此PPD復合物的不同結(jié)構(gòu)域相互作用,促使未折疊或折疊錯誤的蛋白質(zhì)通過泛素蛋白酶復合體降解[8～9]。還有研究認為,DJ-1可能通過分子伴侶清除細胞內(nèi)異常累積的蛋白質(zhì)發(fā)揮保護作用[10～11]。對于DJ-1的亞細胞位置,Bonifati等[2]發(fā)現(xiàn)DJ-1定位于細胞質(zhì)和細胞核;Junn等[12]發(fā)現(xiàn)DJ-1定位于線粒體基質(zhì)和線粒體內(nèi)膜;陳蘇維[13]則表明:DJ-1在正常情況下位于胞質(zhì)內(nèi),當細胞受到氧化應激時,DJ-1蛋白完成從胞質(zhì)到線粒體的轉(zhuǎn)移。

DJ-1在人類帕金森病中的作用及其亞細胞位置爭議很多。在高等實驗動物模型中,基因型和表現(xiàn)型的相關(guān)性復雜,簡單真核模式生物盤基網(wǎng)柄菌(Dictyostelium discoideum)則簡化了基因型和表現(xiàn)型相關(guān)性的復雜性,能提供可讀性強、準確性高的基因型和表現(xiàn)型相關(guān)性[14～16]。本研究將在大腸桿菌內(nèi)對人類帕金森病相關(guān)DJ-1的盤基網(wǎng)柄菌同源蛋白質(zhì)進行原核表達和純化,制備其相應抗體,并在大腸桿菌和盤基網(wǎng)柄菌細胞內(nèi)進行抗體檢驗,為后期測定盤基網(wǎng)柄菌細胞內(nèi)DJ-1蛋白的表達水平和利用抗體標記確認DJ-1蛋白的亞細胞位置奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用菌株為E.coli M15和D.discoideum AX2,質(zhì)粒載體為pQE-30,均由澳大利亞Fisher教授實驗室提供,所用菌株基因型的相關(guān)信息見表1。

表1 實驗菌株名稱及基因型Table 1 The strain names and genotypes

T4 DNA連接酶、BamHⅠ和HindⅢ等限制性內(nèi)切酶均購自美國Promega公司;Taq聚合酶、Alexa-FluorR-AP、anti-rabbit fluorescein、anti-His HRP 和 PureLinkTMHiPure Plasmid Maxiprep Kit均購自美國Invitrogen公司;HL-5培養(yǎng)基購自美國Formedium公司;蛋白酶抑制劑(25×,cocktail tablet)和Laemmli(1×)均購自美國 Roche公司;增強化學熒光(enhanced chemifluorescence,ECF)購自瑞典Amersham公司;其他常見試劑購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成

參照盤基網(wǎng)柄菌DJ-1基因序列,利用Pri-mer 6.0軟件設(shè)計上、下游引物擴增DJ-1基因片段(DAM,去除終止密碼子的DJ-1基因)。引物由墨爾本Geneworks公司合成,具體信息見表2。

表2 擴增盤基網(wǎng)柄菌DJ-1片段的引物序列Table 2 Primer sequences for amplification of DJ-1 fragment

1.2.2 DAM片段的PCR擴增、限制性酶切和連接

以盤基網(wǎng)柄菌總基因組DNA為模板,利用1.2.1設(shè)計的引物對盤基網(wǎng)柄菌DJ-1片段進行擴增,采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物DAM。利用引物中已設(shè)計其序列位點的限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ對DAM及pQE-30質(zhì)粒進行酶切,酶切后的DAM和pQE-30質(zhì)粒在16℃進行過夜連接,形成連接產(chǎn)物pPROF696。

1.2.3 大腸桿菌轉(zhuǎn)化株的獲取、篩選及目的片段酶切鑒定

將100 μL電轉(zhuǎn)感受態(tài)E.coli M15細胞與15 μL pPROF696混合,利用電穿孔法進行重組載體轉(zhuǎn)化,采用藍-白斑篩選法獲取大腸桿菌E.coli M15轉(zhuǎn)化株。利用堿裂解法提取重組原核表達載體pPROF696,并對其進行酶切鑒定。

1.2.4 盤基網(wǎng)柄菌DJ-1的生物信息學分析

利用ExPASy Compute pI/Mw tool(https://web.expasy.org/compute_pi/)估算盤基網(wǎng)柄菌DJ-1的相對分子質(zhì)量;利用ExPASy ProtParam軟件(https://web.expasy.org/protparam/)分析DJ-1的理化性質(zhì);利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)軟件分別預測DJ-1蛋白的二級結(jié)構(gòu)和立體空間結(jié)構(gòu)。

1.2.5 盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白的誘導表達及溶解性分析

將1.2.3獲取的含pPROF696的大腸桿菌轉(zhuǎn)化株置于含卡那霉素(25 μg/mL)和阿莫西林(100 μg/mL)的Luria Broth培養(yǎng)液中大量培養(yǎng)。加入1 mmol/L異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)誘導3 h,使DJ-1蛋白大量表達,然后4℃4 000 r/min離心10 min獲得轉(zhuǎn)化株。在200 mL轉(zhuǎn)化株細胞液中加入含蛋白酶抑制劑(1×)的溶菌酶(1 mg/mL)進行裂解,再加入MgCl2(0.1 mol/L)和DNaseⅠ (0.1 mg/mL)降解DNA。4℃12 200 r/min離心10 min后,收集上清液和沉淀。在收集的20 μL上清液和沉淀(加入裂解緩沖液處理)中加入 5 μL SDS-PAGE 緩沖液(5×),95 ℃處理10 min使其變性,-20℃降溫1 min,離心后再利用12%SDS聚丙烯酰胺凝膠對蛋白質(zhì)進行分離(200 V,40 min)?？捡R斯亮藍染色凝膠1.5 h后,利用Trans-Blot TurboTMblotting設(shè)備將分離的DJ-1蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。雙蒸水多次洗滌PVDF膜后,利用抗體(anti-His HRP,1∶1 000)對DJ-1蛋白進行免疫檢測。

1.2.6 盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白的純化

將500 μL Ni-NTA樹脂懸浮液用12 200 r/min離心30 s,再用10 mmol/L咪唑緩沖液洗滌。將洗滌后的Ni-NTA樹脂懸浮液加入1.2.5提取的含盤基網(wǎng)柄菌DJ-1粗蛋白的上清液,振蕩處理使蛋白質(zhì)-樹脂結(jié)合30 min。將結(jié)合后的混合液加入含PD-10過濾器的過濾柱,利用20 mmol/L咪唑緩沖液洗滌過濾柱3次后,利用250 mmol/L咪唑洗滌液從過濾柱上洗脫盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白。

1.2.7 盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白抗體的制備和純化

利用12%SDS聚丙烯酰胺凝膠對1.2.6純化的盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白進行電泳,提取分離的DJ-1蛋白共345.6 μg,由IMVS(Institute of Medical and Veterinary Science)公司利用兔子分4個劑量共8周進行抗體制備。所得抗體用E.coli M15細胞中提取的盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白進行純化。具體純化過程如下:采用12%SDS聚丙烯酰胺凝膠對盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白進行電泳(200 V,40 min),轉(zhuǎn)移至PVDF膜后用0.22%Ponceau S染色劑染色5 min,再利用5%醋酸脫色5 min,雙蒸水洗滌兩次,各5 min。將染成紅色的蛋白質(zhì)條帶切下來,并用3%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)4℃過夜培育。培育后的蛋白質(zhì)條帶用0.1%BSA 4℃洗滌6～8次,加入所得盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白抗體(1∶500),在4℃條件下進行過夜振蕩培育。用0.1%BSA洗滌蛋白質(zhì)條帶3次,再用0.1%BSA和0.1%NP40混合液洗滌兩次,隨后利用150 μL 0.2 mol/L glycine-HCl(pH 2.5)洗脫所結(jié)合的抗體1 min,然后在抗體中加入含5%BSA的75 μL中和溶液(pH 9.0)進行中和。純化后的抗體用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)(1×)于4℃條件下洗滌3次,加入0.1%NaN3防腐劑后置于-20℃貯存。

1.2.8 盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白抗體的檢驗

在E.coli M15中檢驗所制備的盤基網(wǎng)柄菌DJ-1抗體時,利用1.2.5的步驟進行細胞裂解并收集上清液,再將分離的DJ-1蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。在盤基網(wǎng)柄菌菌株(野生株AX2和含DJ-1過表達載體的盤基網(wǎng)柄菌轉(zhuǎn)化株)中,待細胞生長至密度為 1×106～2×106mL-1,收集大約 5×106個細胞,2 500 r/min離心 2 min,添加 15 μL 1× Laemmli緩沖液后在冰上裂解10 min;加入1 μL蛋白酶抑制劑(25×),將樣品煮沸10 min后置于冰上迅速冷卻;對15 μL粗制蛋白質(zhì)樣品進行12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(200 V,40 min);利用Trans-Blot TurboTMblotting設(shè)備將DJ-1蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。將上述從E.coli M15和盤基網(wǎng)柄菌菌株中獲得的含DJ-1蛋白的PVDF膜在室溫條件下用TBS沖洗兩次,每次10 min,然后用5%脫脂牛奶室溫振蕩培育1 h。用TBST(TBS-Tween/Triton)緩沖液沖洗PVDF膜兩次,隨后用TBS沖洗1次,然后加入上述純化的盤基網(wǎng)柄菌DJ-1抗體(用TBS溶解的5%脫脂牛奶稀釋到1∶500),4℃過夜振蕩培育。PVDF膜用TBST洗滌兩次后用TBS洗滌1次,再加入第二抗體(anti-rabbit fluorescein,1∶5 000),黑暗中室溫振蕩培育1 h。按照上述方法洗滌PVDF膜,加入第三抗體(anti-fluorescein-AP Fab fragment,1∶2 500),室溫培育1 h。洗滌PVDF膜,在膜上按24 μL/cm2加入ECF,室溫放置5～10 min。用Whatman 3 MM過濾紙濾干PVDF膜,利用Storm 860TMFluoroimager進行掃描和記錄。

2 結(jié)果

2.1 pPROF696重組載體的構(gòu)建與酶切鑒定

利用BamHⅠ和HindⅢ限制性酶切位點將PCR擴增的DAM片段插入pQE-30質(zhì)粒,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定和進一步純化后,形成重組載體pPROF696。對pPROF696重組載體進行酶切鑒定,確認擴增目的片段的大小和連接方向正確(圖1)。

圖1 pPROF696重組載體的構(gòu)建和酶切鑒定圖中的DAM片段為除去終止密碼子的DJ-1基因,全長615 bp。pPROF696重組載體含1個ATG起始密碼子、6聚組胺酸標簽(由pQE-30質(zhì)粒提供)、DAM片段和1個終止密碼子。酶切鑒定結(jié)果中,泳道1是1 kb DNA標記;泳道2是利用BamHⅠ和HindⅢ對pPROF696重組載體進行限制性酶切后的結(jié)果。Fig.1 Generation and restriction endonuclease digestion of pPROF696DAM in Fig.1 refers to the 615 bp full length DJ-1 without the stop codon.The pPROF696 construct contains an ATG start codon followed by a hexahistidine tag(provided by the vector),the DAM fragment and a stop codon.On the electrophoresis gel,lane 1 shows 1 kb DNA marker,and lane 2 shows the fragments of the construct pPROF696 digested with restriction enzymes BamHⅠand HindⅢ.

2.2 盤基網(wǎng)柄菌DJ-1的生物信息學分析

測序結(jié)果顯示:盤基網(wǎng)柄菌DJ-1基因全長618 bp,不含內(nèi)含子,共編碼205個氨基酸。分析DJ-1蛋白肽鏈主平面結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),其包含80個α-螺旋、15個β-轉(zhuǎn)角、68個無規(guī)卷曲和42個延伸鏈(圖2)。理化性質(zhì)分析顯示:DJ-1蛋白的分子式為C1020H1616N268O311S8,相對分子質(zhì)量為22.87 kD,總疏水性平均值為-0.124,表明盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白能溶于極性和非極性溶劑。此外,盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白的空間結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示了其肽鏈主平面結(jié)構(gòu)(圖3A)及其活躍且保守的催化位點C117(圖 3B)。

圖2 盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白的氨基酸組成及肽平面結(jié)構(gòu)h:α-螺旋;t:β-轉(zhuǎn)角;c:無規(guī)卷曲;e:延伸鏈。Fig.2 The amino acid composition and peptide structure of D.discoideum DJ-1 proteinh:α-helix;t:β-turn;c:Random coil;e:Elongation strand.

圖3 盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白的空間模型(A)盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白的空間結(jié)構(gòu)。h、t、c和e分別表示α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲和延伸鏈;(B)盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白的空間結(jié)構(gòu)局域圖。Fig.3 The tertiary structure of D.discoideum DJ-1 protein(A)The tertiary structure of D.discoideum DJ-1 protein.The letters h,t,c and e refer to α-helix,β-turn,random coil and elongation strand,respectively;(B)The local tertiary structure of D.discoideum DJ-1 protein.

2.3 盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白的原核表達及溶解性

大量培養(yǎng)含pPROF696的大腸桿菌轉(zhuǎn)化株,并加入IPTG誘導DJ-1蛋白表達。對轉(zhuǎn)化株細胞誘導產(chǎn)生的盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白進行裂解提取、上清液和沉淀收集、SDS-PAGE分析、考馬斯亮藍染色、Western-blot和抗體檢測后發(fā)現(xiàn):盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白主要出現(xiàn)在轉(zhuǎn)化株細胞裂解液離心后的上清液中,沉淀中僅出現(xiàn)少量蛋白質(zhì)(圖4)。因此推測,盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白屬于可溶性蛋白質(zhì),其相對分子質(zhì)量介于19～26 kD之間,與利用ExPASy Compute pI/MW tool估算的理論相對分子質(zhì)量(22.87 kD)一致(圖 4)。

圖4 盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白的原核表達1:提前染色的蛋白質(zhì)標記物;2:來自轉(zhuǎn)化株細胞裂解液離心沉淀的盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白;3:來自轉(zhuǎn)化株細胞裂解液離心上清液的盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白。Fig.4 The expression of D.discoideum DJ-1 in E.coli1:Pre-stained protein marker;2:D.discoideum DJ-1 protein from the insoluble fraction of the transformant cell lysate;3:D.discoideum DJ-1 protein from the soluble fraction of the transformant cell lysate.

2.4 盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白的純化

利用His標簽的純化樹脂(QIAexpressionistTM)對盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白進行純化。pQE-30質(zhì)粒中含有插入的6聚組胺酸序列,通過Ni-NTA樹脂中的6聚組胺酸抗體,與6聚組胺酸相連的DJ-1蛋白可以從樹脂上進行洗脫和純化。將純化的DJ-1蛋白進行12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western-blot后發(fā)現(xiàn):DJ-1蛋白純化效果較好,與預期大小相符(圖5)。

圖5 盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白的純化1:提前染色的蛋白質(zhì)標記物;2～4:純化的DJ-1蛋白。Fig.5 Batch purification of D.discoideum DJ-11:Pre-stained protein marker;2～4:The purified D.discoideum DJ-1 protein.

2.5 盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白的抗體檢驗

為了檢測從兔子血清中提取和制備的盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白多克隆抗體是否有效,先利用親和純化法對其純化,然后分別在E.coli M15和盤基網(wǎng)柄菌菌株內(nèi)進行檢驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn):所制備的抗體能夠清晰地檢測到含pPROF696的E.coli M15和含DJ-1過表達載體的盤基網(wǎng)柄菌菌株內(nèi)的DJ-1蛋白,也能夠檢測到盤基網(wǎng)柄菌野生菌株(AX2)內(nèi)的DJ-1蛋白,但條帶較淺(圖6)。

圖6 盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白抗體檢驗1:蛋白質(zhì)標記物;2:盤基網(wǎng)柄菌野生菌株AX2;3～4:無IPTG誘導和IPTG誘導的含pPROF696的E.coli M15;5～6:隨機抽取的含DJ-1過表達載體的兩株盤基網(wǎng)柄菌轉(zhuǎn)化株。Fig.6 Verification of antibodies against D.discoideum DJ-11:Protein marker;2:The crude DJ-1 protein from D.discoideum AX2;3～4:Non-induced and IPTG-induced DJ-1 protein from E.coli M15 containing the construct pPROF696;5～6:The DJ-1 protein from two randomly chosen D.discoideum transformants containing DJ-1 overexpression construct.

3 討論與結(jié)論

帕金森病主要由腦部黑質(zhì)區(qū)的多巴胺能神經(jīng)細胞受損或退化引起,研究表明氧化應激損傷、異常蛋白質(zhì)累積和線粒體功能紊亂可能是導致帕金森病的重要機制[17～18]。目前,已發(fā)現(xiàn)有8個基因(蛋白質(zhì))與帕金森病相關(guān)[19],其中DJ-1基因位于位點PARK7,被發(fā)現(xiàn)在帕金森病的發(fā)生中起細胞保護作用,其缺失或突變能誘發(fā)帕金森病相關(guān)癥狀,主要功能包括調(diào)節(jié)基因表達、保證線粒體完整性、誘導蛋白質(zhì)再折疊和降低神經(jīng)元的氧化應激[20～21]。DJ-1對細胞的保護可能通過分子伴侶誘導的自噬作用清除細胞內(nèi)異常累積的α突觸核蛋白完成[22],而突變的DJ-1本身卻被線粒體蛋白酶HtrA2清除[23]。但也有研究認為,在變性條件下DJ-1會像α突觸核蛋白一樣在細胞內(nèi)異常累積,造成細胞損傷[24]。

本文的生物信息學分析和實驗研究均證明盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白屬于可溶性蛋白質(zhì)(圖4),而前期研究發(fā)現(xiàn),盤基網(wǎng)柄菌DJ-1通過內(nèi)吞作用完成對細胞的保護作用[25]。此外,本研究結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)化株相比,AX2菌株內(nèi)的DJ-1表達水平相對較低(圖6),提示抗體的靈敏度在AX2菌株檢驗時可能需要通過提高濃度達到(從1∶500提高到1∶300)。文中盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白抗體的成功制備,可用以驗證綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)標記的盤基網(wǎng)柄菌轉(zhuǎn)化株中DJ-1:GFP融合蛋白的表達,也可以測定DJ-1敲除、抑制和過表達后盤基網(wǎng)柄菌細胞內(nèi)DJ-1蛋白的表達水平,并與相對應的表現(xiàn)型建立相關(guān)性,從而確立高等實驗動物難以構(gòu)建的基因型-表現(xiàn)型關(guān)系,探索DJ-1缺失或突變與線粒體功能缺失、異常蛋白質(zhì)累積及帕金森病致病機理之間的聯(lián)系和作用機理。

總的來講,本研究利用除去終止密碼子的盤基網(wǎng)柄菌DJ-1基因成功構(gòu)建了其原核表達載體pPROF696,并利用E.coli M15菌株高效表達了盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白,進行了抗體制備;經(jīng)檢驗,含pPROF696的E.coli M15轉(zhuǎn)化株和盤基網(wǎng)柄菌轉(zhuǎn)化株內(nèi)的DJ-1表達水平都能夠很好地利用所制備抗體進行檢測和標定。