譚雅文，劉繁，孫詩瑤，謝萍，劉國文

(1.深圳市第二人民醫(yī)院(深圳大學第一附屬醫(yī)院)甲狀腺乳腺外科， 廣東深圳 518000；2.首都醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院細胞生物學系，北京 100069)

據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2020年全球最新癌癥負擔報告》，2020年全球乳腺癌新發(fā)病例226萬例，已經(jīng)超越肺癌成為全球發(fā)病第一的惡性腫瘤[1]。 同年，乳腺癌全球相關(guān)死亡病例約68萬例，成為全球第五的癌癥致死病因[1]。乳腺癌在分子水平上具有很強的異質(zhì)性，臨床上根據(jù)免疫組化標記的異同，將乳腺癌分為4種不同的亞型，三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer， TNBC)是其中一類特殊的分子分型，其缺乏雌激素受體、孕激素受體以及人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)的表達，大約占乳腺癌總數(shù)的16%[2]。由于TNBC缺乏以上受體的表達，其對現(xiàn)有的內(nèi)分泌藥物、靶向藥物均無效，目前其主要治療仍然依靠手術(shù)及化療，加之其在已知的乳腺癌分型中侵襲性最強，早期復發(fā)率及遠處轉(zhuǎn)移率高，故TNBC的預后很差[3-4]。

Kazusa cDNA計劃是一個旨在開展廣泛的人類 cDNAs 測序的項目，來預測未知的人類基因的編碼序列，科學家將此計劃新發(fā)現(xiàn)的基因命名為“KIAA”基因，也被稱作未知基因，到目前為止一共發(fā)現(xiàn)了兩千多個KIAA基因[5]。近年來KIAA基因的研究主要著眼于識別其編碼的蛋白質(zhì)的生理功能。KIAA0101基因，又被叫做PCNA 相關(guān)因子(PCNA associated factor，p15 PAF)， 編碼增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)蛋白[6]，該蛋白為DNA復制和DNA損傷修復過程中的必要蛋白。KIAA0101參與調(diào)控多種生物學過程，如DNA損傷修復[7]、細胞周期和細胞增殖[8]。它的異常表達已經(jīng)被證實與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，也被認為是多種惡性腫瘤的癌基因，在多種惡性腫瘤的惡性進程、預后[6]以及耐藥[9]中發(fā)揮著重要作用。有研究報道[10]，KIAA0101在乳腺癌中高表達，但是暫時沒有KIAA0101與三陰性乳腺癌的相關(guān)報道。本課題聯(lián)合使用多種數(shù)據(jù)庫分析KIAA0101在TNBC中的表達及其對該類患者預后的影響，以期為進一步研究KIAA0101在TNBC中的作用機制提供線索和思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫資料下載

在GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)中搜索人三陰性乳腺癌數(shù)據(jù)集，通過對表達譜芯片的信息進行分析，確定將來源于GSE38959和GSE27447中27例非腫瘤乳腺癌樣本和35例三陰性乳腺癌樣本數(shù)據(jù)納入本研究。

1.2 篩選差異表達基因

利用GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/) 對來自GEO的數(shù)據(jù)進行整合， 并以|log FC|>1、P<0.05為標準進行差異表達基因篩選，然后使用在線分析網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)進行韋恩分析，得到重疊的差異表達基因。

1.3 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)檢索WIF1與RERGL在TNBC癌組織中的表達情況，檢索條件為：① Cancer: Breast invasive carcinoma；② Gene：WIF1; RERGL；③ Matched Normal data：Match TCGA normal and GTEx data。在GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)中檢索PMCHL1和KIAA0101在乳腺癌組織中的表達情況， 檢索條件為：① Cancer：Breast invasive carcinoma； ② Gene：PMCHL1；KIAA0101； ③ Matched Normal data: Match TCGA normal and GTEx data。

1.4 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析

通過UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu)獲取KIAA0101基因在乳腺癌內(nèi)的表達情況，通過Expression選項中sample type、major subclasses、cancer stage和nodal metastasis status等分類預測KIAA0101在三陰性等乳腺癌中的表達情況。

1.5 免疫浸潤

在TIMER數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)中下載TCGA樣本中免疫細胞浸潤水平矩陣，將KIAA0101表達水平與檢索結(jié)果進行相關(guān)性分析，得到其與免疫細胞浸潤程度的相關(guān)性。

1.6 生存分析

使用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫在線分析，檢索KIAA0101基因，得到三陰性乳腺癌患者差異表達KIAA0101的生存曲線。限定條件：總生存期(overall survival，OS)和無復發(fā)生存率(recurrence-free survival，RFS)，進行預后分析。

2 結(jié) 果

2.1 篩選差異表達基因

對GSE38959和GSE27447芯片進行韋恩分析得到25個重疊的差異表達基因，其中表達上調(diào)的基因有12個(圖1A)，下調(diào)基因有13個(圖1B)。GO功能富集分析表明這些重疊的差異基因在胞外區(qū)域、信號轉(zhuǎn)導、負向調(diào)節(jié)Wnt信號通路、正向調(diào)節(jié)脂肪細胞分化、Wnt-蛋白質(zhì)結(jié)合等方面起作用(圖1C)。差異柱狀圖分別顯示了兩個數(shù)據(jù)集中重疊的差異基因表達情況，數(shù)據(jù)集GSE38959中KIAA0101上調(diào)最顯著，數(shù)據(jù)集GSE27447中PMCHL1上調(diào)最顯著(圖1D)。

A

B

C

D

2.2 在常見腫瘤組織中的PMCHL1和KIAA0101 mRNA水平

用GEPIA數(shù)據(jù)庫對PMCHL1和KIAA0101在人體各器官腫瘤組織中的mRNA水平進行了分析，結(jié)果提示PMCHL1 mRNA在TNBC癌組織中表達升高不明顯，P值不具有統(tǒng)計學意義(圖2A)，而KIAA0101在TNBC癌組織中升高顯著，較正常組織升高明顯(P<0.05)(圖2B)。

A

B

2.3 KIAA0101 mRNA水平與TNBC進展相關(guān)

通過UALCAN數(shù)據(jù)庫，基于sample type、major subclasses、cancer stage和nodal metastasis status等分類比對了KIAA0101 mRNA在癌組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)KIAA0101 mRNA在乳腺癌組織中的含量顯著高于癌旁組織(P<0.001)(圖3A)，并且在TNBC不同亞型和不同臨床分期中KIAA0101 mRNA在癌組織中表達量也均高于癌旁組織(圖3B和3C)。此外，分析數(shù)據(jù)顯示與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(N0)相比，N1-N3期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的KIAA0101 mRNA出現(xiàn)升高(P<0.001)(圖3D)。

A

B

C

D

2.4 KIAA0101的表達量和免疫細胞浸潤數(shù)量呈正相關(guān)

使用TIMER數(shù)據(jù)庫對KIAA0101與免疫細胞浸潤聯(lián)系進行在線分析， 發(fā)現(xiàn)KIAA0101的表達情況與TNBC中B細胞(P<0.001)、中性粒細胞 (P=0.02) 浸潤均呈正相關(guān)， 并且與B細胞的相關(guān)性最強。與CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞浸潤不相關(guān)(圖4)。

圖4 KIAA0101 mRNA表達量對免疫細胞浸潤的影響

2.5 KIAA0101的表達對TNBC患者預后的影響

通過對Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫進行分析， 發(fā)現(xiàn)在TNBC中高表達KIAA0101患者的OS較低表達患者顯著縮短， 差異具有統(tǒng)計學意義(HR=2.45,P=0.0073)。此外，在TNBC樣本中，KIAA0101與患者RFS無明顯聯(lián)系，差異無統(tǒng)計學意義(HR=0.81,P=0.27)(圖5)。

A

B

3 討 論

乳腺癌作為一種嚴重威脅人類健康的疾病，發(fā)病率、死亡率正在逐年增加。2020年，全球乳腺癌新發(fā)病例高達226萬例，新增的乳腺癌相關(guān)死亡病例約68.5萬例[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計，每年中國乳腺癌新發(fā)病例和死亡人數(shù)分別約占全世界的12.2%和9.6%[11-12]。而TNBC與其他亞型乳腺癌相比，具有腫瘤組織學分級高，復發(fā)轉(zhuǎn)移率高等特點，由于其侵襲性高，很多患者在初診時臨床分期相對較晚[13]。目前，TNBC的有效治療手段非常有限，手術(shù)是其局部治療的最佳方案，而化療則是目前唯一有效的輔助治療方法。雖然乳腺癌治療手段層出不窮，但針對TNBC的治療沒有突破性進展，由于治療手段的匱乏，TNBC的總體預后仍然沒有得到改善。這就促使科研工作者不斷尋找治療TNBC的新方法，探尋與TNBC有關(guān)的差異基因表達，以尋找新的腫瘤治療靶點。

KIAA0101含有一個保守的PCNA結(jié)合基，與CDK抑制劑p21競爭結(jié)合 PCNA[9]。有研究證明，KIAA0101可以與BRCA1結(jié)合，從而影響中心體的數(shù)量[10]。此外，KIAA0101的轉(zhuǎn)錄變體1可以抑制p53激活，從而阻止使用阿霉素誘導的細胞凋亡[14-15]。還有研究證明KIAA0101 的過表達，可以激活 PI3K/AKT/mTOR 通路，抑制腫瘤細胞凋亡、自噬，從而導致順鉑類藥物的耐藥[9]。KIAA0101在多種性腫瘤中表達升高， 如胃癌[16]、 乳腺癌[10]、 食管癌[17]、肝癌[18]，并可能與癌癥患者的預后相關(guān)[6]。

本研究通過使用GEO、GEPIA、UALCAN、TIMER和 Kaplan-Meier Plotter 等數(shù)據(jù)庫挖掘KIAA0101基因表達的相關(guān)數(shù)據(jù)，探尋其在三陰性乳腺癌中的表達、免疫細胞浸潤及與預后的關(guān)系。

研究發(fā)現(xiàn)，癌變組織的SORT1水平顯著高于非癌變組織，SORT1 mRNA水平在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中會出現(xiàn)升高，并且發(fā)現(xiàn)在所有三陰性乳腺癌的亞型中均出現(xiàn)升高，尤其是TNBC-LAR亞型中升高最為顯著。在人蛋白數(shù)據(jù)庫(Human Protein Atlas， HPA)(https://www.proteinatlas.org)內(nèi)檢索關(guān)鍵字“KIAA0101”， 選擇 “Pathology” 模塊， 并未找到KIAA0101抗體在三陰性乳腺癌中蛋白免疫組化結(jié)果。但Kais[10]和Wang[19]等研究發(fā)現(xiàn)，KIAA0101在乳腺癌中高表達，那么在接下來的研究中，可利用臨床病理樣本，從蛋白表達水平上分析 KIAA0101與TNBC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

其后，使用TIMER數(shù)據(jù)庫對KIAA0101與免疫細胞浸潤之間的關(guān)系進行在線分析，發(fā)現(xiàn)KIAA0101的表達與B細胞、中性粒細胞浸潤呈正相關(guān)，表達量增加，在B細胞中尤為明顯，這可能為尋找TNBC免疫治療新靶點提供一個新思路。

最后通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫進行預后分析，發(fā)現(xiàn)高表達KIAA0101會對患者總生存期產(chǎn)生不良影響，即從轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)KIAA0101的表達會TNBC患者帶來不良的預后，由此進一步證明KIAA0101基因可能有促進TNBC進展的作用。然而，這些實驗結(jié)果均來自芯片檢測結(jié)果，相關(guān)結(jié)論尚有待后續(xù)驗證。

同時， 關(guān)于KIAA0101如何與其他分子發(fā)生相互作用來影響TNBC的發(fā)展需要進一步的研究； KIAA0101在TNBC中的轉(zhuǎn)化應(yīng)用也需要更多的實驗數(shù)據(jù)來支撐。為了進一步明確KIAA0101與TNBC之間的關(guān)系，接下來將利用臨床樣本，從蛋白表達水平上分析其與TNBC的關(guān)系，并分析其與患者預后的關(guān)系。

綜上，KIAA0101在三陰性乳腺癌組織中表達升高，且與其臨床分期呈正相關(guān)；另外，它還影響患者的生存預后，與免疫細胞浸潤密切相關(guān)，在一定程度上提示了KIAA0101作為三陰性乳腺癌潛在治療靶點的可能，也為進一步研究KIAA0101基因與三陰性乳腺癌的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，希望為三陰性乳腺癌的治療提供一定的理論依據(jù)，并開拓新的治療思路。