彭啟華，王力剛，趙玉馳

(1.南華大學(xué)附屬邵陽醫(yī)院骨科， 湖南邵陽 422000； 2.南方科技大學(xué)鹽田醫(yī)院骨科，廣東深圳 518000)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨密度(bone mineral density，BMD)顯著降低和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為特征的人類常見骨代謝疾病，且隨著年齡增長發(fā)病率越明顯[1]。SOST蛋白(sclerostin)是由人類17q12-21染色體上SOST基因編碼的糖蛋白。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C(myocyte enhancer factor 2C，MEF2C)是重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。Kramer等[2]發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠MEF2C基因會導(dǎo)致SOST表達(dá)下降，從而使骨量和骨密度增加。因此，MEF2C-SOST轉(zhuǎn)錄軸的發(fā)現(xiàn)對于骨代謝疾病的治療具有重要意義。慢病毒載體以其較高感染率和穩(wěn)定基因表達(dá)已成為實(shí)驗(yàn)室常用轉(zhuǎn)基因載體[3]。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C-反義鏈1(myocyte enhancer factors 2C-antisense RNA1, MEF2C-AS1)是近年來新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，基因位于5q14.3, 編碼于MEF2C基因的反義鏈上，不僅可以調(diào)節(jié)正義轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平，還可以反饋蛋白質(zhì)和基因組水平。有研究發(fā)現(xiàn)MEF2C-AS1與股骨頸密度顯著相關(guān)[4]。

課題組前期在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)lncRNA MEF2C-AS1可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟，對機(jī)體骨量增加可能存在積極作用[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建大鼠骨質(zhì)疏松動物模型，通過體內(nèi)注射MEF2C-AS1慢病毒載體后檢測骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)變化，進(jìn)一步探討MEF2C-AS1對機(jī)體骨量的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SD雌性大鼠46只，SPF級，體重180～220 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物公司；在湖南省藥物安全評價(jià)研究及動物實(shí)驗(yàn)中心屏障環(huán)境C區(qū)飼養(yǎng)。動物使用得到動物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會批準(zhǔn)，并按照《實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南》執(zhí)行。

1.2 主要試劑和儀器

2%戊巴比妥鈉購自德國Merck公司；青霉素購自華北制藥股份有限公司；ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)免疫生物科技公司；MEF2C、b-actin(兔抗)購自武漢愛博泰克生物技術(shù)公司；慢病毒載體MEF2C-AS1及空病毒載體購自湖南贏潤生物科技有限公司； 4%多聚甲醛固定液、裂解液、Western洗滌液、轉(zhuǎn)膜液均購自武漢谷歌生物科技公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自杭州弗德生物科技有限公司；Tanon4100全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海天能公司；ME2002E型電子天平購自日本島津公司；Micro-CT儀購自德國Bruker公司；LABOSPECT003全自動血液生化分析儀購自日本日立公司；Spectra Max i3x酶標(biāo)儀購自美谷分子儀器有限公司。

1.3 動物建模

SD大鼠46只，標(biāo)準(zhǔn)飼料、分籠飼養(yǎng)，自由飲水，溫度、濕度等飼養(yǎng)環(huán)境相同，保持飼養(yǎng)室良好通風(fēng)。大鼠適應(yīng)一周后，按體重隨機(jī)分為假手組(SHAM)、去卵巢組(OVX),每組共23只。OVX組大鼠用2%戊巴比妥鈉(0.2 ml/100 g)麻醉后，取側(cè)臥位于動物實(shí)驗(yàn)手術(shù)臺上，兩側(cè)背部剪毛，蓋上洞巾，用碘酒、乙醇局部消毒術(shù)野皮膚，先逐層切開左側(cè)皮膚，分離肌肉，用鑷子輕輕提起脂肪團(tuán)，露出與子宮角緊密相連的卵巢(呈粉紅色顆粒狀)，組織鉗夾閉卵巢下輸卵管，結(jié)扎輸卵管并切除卵巢，余下組織送入腹腔，縫合肌肉和皮膚。另一側(cè)與之相同操作。SHAM組于相同部位切開皮膚、暴露卵巢，于卵巢組織周邊切除相等大小脂肪組織，切口逐層縫合。術(shù)后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素(8×104IU, 0.1 ml/只)，觀察大鼠皮膚切口、飲食和活動狀態(tài)。

1.4 動物處理及分組

術(shù)后12周，每組各隨機(jī)剖殺7只大鼠，取右側(cè)股骨行MicroCT成像檢測以驗(yàn)證模型。將假手術(shù)組剩下的16只大鼠隨機(jī)分成2組，每組各8只，分別為假手術(shù)對照組(SHAM)、假手術(shù)+MEF2C-AS1組(SHAM+MEF2C-AS1)；將去卵巢組剩下的16只大鼠隨機(jī)分成2組，每組各8只，分別為去卵巢對照組(OVX)、去卵巢+MEF2C-AS1組(OVX+MEF2C-AS1)。SHAM+MEF2C-AS1組及OVX+MEF2C-AS1組取大鼠尾靜脈注射MEF2C-AS1慢病毒載體(5×107TU，100 μl/只)，SHAM組及OVX組同樣部位注射等量空病毒載體。8周后行Western blot分析、ELISA分析和Micro-CT成像檢測。

1.5 ELISA分析

大鼠剖殺時(shí)，行腹主動脈采血，離心后取上清液，將收集的血清樣本立即編號后放-80℃冰箱保存，用ELISA法檢測SOST蛋白水平，所有操作根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行。

1.6 Western blot分析

大鼠剖殺后取左側(cè)股骨，加入少量液氮于研缽中研磨，加入適量裂解液提取蛋白，將樣本于-80℃冰箱儲存。取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下用5%脫脂乳在TBS封閉液中封閉1 h，與相應(yīng)的一抗兔抗MEF2C抗體(1∶1 000)、兔b-actin抗體(1∶2 000)4℃孵育過夜。次日，回收一抗，洗膜后，將二抗稀釋于TBS中，常溫孵育1 h，洗滌液洗膜3次，顯影。以b-actin作為內(nèi)參照，對曝光條帶進(jìn)行蛋白定量分析。

1.7 骨組織形態(tài)學(xué)分析

大鼠剖殺后取右側(cè)股骨，仔細(xì)剔除周圍肌肉組織，放入4%多聚甲醛固定液中，分別編號后，置4℃冰箱保存以備Micro-CT成像系統(tǒng)檢測。造模12周及最后剖殺大鼠測量方法一致。測量指標(biāo)包括：皮質(zhì)骨厚度(cortical bone thickness, Ct.Th)、骨體積(bone volume, BV)、骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume/ total volume, BV/TV)、骨密度(bone mineral density, BMD)、組織密度(tissue mineral density, TMD)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular separation, Tb.Sp)、結(jié)構(gòu)造模指數(shù)(structural modeling index, SMI)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 大鼠骨質(zhì)疏松動物模型驗(yàn)證

如表1所示，OVX組骨密度、骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度、骨體積、骨體積分?jǐn)?shù)均低于SHAM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中骨密度減少36.7%；而骨小梁分離度高于SHAM組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(如圖1，P<0.05)。結(jié)構(gòu)模型指數(shù)、組織密度、皮質(zhì)骨厚度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SHAM組的骨小梁厚度變薄，數(shù)量明顯減少(見圖2)。

表1 造模12周后，SHAM組與OVX組的骨微結(jié)構(gòu)的比較

圖1 SHAM組和OVX組的骨密度和骨微結(jié)構(gòu)比較(BMD為骨密度，TMD為組織密度)

A. SHAM組 B. OVX組

12周后OVX組大鼠骨小梁厚度變薄、數(shù)量明顯減少)

2.2 MEF2C-AS1對SOST蛋白的影響

如表2所示，各組SOST蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)行兩兩間比較顯示，OVX組較SHAM組SOST蛋白相對表達(dá)量高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SHAM組與SHAM+MEF2C-AS1組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SHAM+MEF2C-AS1組與OVX+MEF2C-AS1組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。OVX+MEF2C-AS1組與OVX組比較，SOST蛋白相對表達(dá)量較去卵巢對照組減少(如圖3)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組MEP2C蛋白和SOST蛋白相對表達(dá)量比較

圖3 各組MEF2C蛋白和SOST蛋白相對表達(dá)量比較 (aa為OVX組與SHAM組比較， P<0.05； bb為OVX組

2.3 MEF2C-AS1對MEF2C蛋白的影響

如表2所示，各組MEF2C蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步行兩組間比較顯示，OVX組較SHAM組MEF2C蛋白相對表達(dá)量高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SHAM組與SHAM+MEF2C-AS1組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SHAM+MEF2C-AS1組與OVX+MEF2C-AS1組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。OVX+MEF2C-AS1組與OVX組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組MEF2C蛋白的Western blot見圖4。

圖4 各組MEF2C蛋白的Western blot

表3 各組骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較

2.4 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析

Micro-CT分析發(fā)現(xiàn)，OVX組大鼠Tb.Th、Tb.N均低于SHAM組(P<0.05)，OVX+MEF2C-AS1組大鼠Tb.Th、Tb.N均高于OVX組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果表明MEF2C-AS1可以增加骨小梁數(shù)量，增加骨小梁之間連接。同時(shí)OVX+MEF2C-AS1組大鼠BV、Tb.Th、Tb.N、BMD、BV/TV基本恢復(fù)到SHAM組水平。而四組SMI比較，OVX組較SHAM組大鼠SMI增加，骨小梁形狀從平板狀變?yōu)榘魻?，表示去卵巢對照組骨質(zhì)疏松大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)降解明顯。而用MEF2C-AS1干預(yù)后，SMI減少，骨小梁結(jié)構(gòu)改善，變成平板狀結(jié)構(gòu)，見圖5,圖6。

圖5 各組骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較(aa為SHAM組與OVX組比較，P<0.05；bb為OVX組與OVX+MEF2C-AS1組比較，P<0.05)

A. SHAM組

B. OVX組

C. SHAM+MEF2C-AS1

D. OVX+MEF2C-AS1

3 討 論

去除大鼠雙側(cè)卵巢為復(fù)制骨質(zhì)疏松動物模型的常用方法。但對于鼠齡、品種、時(shí)間并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，有文獻(xiàn)報(bào)道6月齡雌性大鼠最為合適，造模時(shí)間持續(xù)6周～6月不等[6]。但國內(nèi)多數(shù)認(rèn)為3～6月齡雌性大鼠骨骼生長最活躍，造模持續(xù)時(shí)間3～4月多見[7]。大鼠去勢以腹側(cè)和背側(cè)皮膚切口進(jìn)行。然而，近年來對比研究發(fā)現(xiàn)腹部切口由于胃腸道容易受影響，且腹部與籠摩擦，易傷口感染或裂開，術(shù)后24 h大鼠死亡率高，而背側(cè)切口，因不需要縫合肌肉、操作簡便、創(chuàng)傷小、手術(shù)時(shí)間短、愈合快、傷口感染率低、造模安全系數(shù)高等優(yōu)勢而被推薦[6，8]。

本實(shí)驗(yàn)選用5月齡SD大鼠，并采用背側(cè)雙切口去卵巢。術(shù)后12周，發(fā)現(xiàn)OVX組骨密度(BMD)、骨體積(BV)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)較SHAM組下降，骨小梁分離度明顯升高，且BMD減少約36.7%，研究表明去卵巢后BMD減少10%～20%表示造模成功[9]。因此，本研究首次證實(shí)5月齡SD大鼠通過切除雙側(cè)卵巢，造模12周也能成功復(fù)制骨質(zhì)疏松模型。并通過骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，骨小梁對雌激素變化反應(yīng)比皮質(zhì)骨要快。研究表明女性在圍絕經(jīng)期前、后幾年骨量丟失最快，并以松質(zhì)骨為主，約占松質(zhì)骨丟失的20%～30%，這個(gè)過程稱為快速骨丟失階段，一般持續(xù)5～10年[10]。有趣的是，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)OVX對骨小梁和皮質(zhì)骨之間變化矛盾結(jié)果，發(fā)現(xiàn)股骨松質(zhì)骨骨小梁結(jié)構(gòu)和BMD減少，而組織密度和皮質(zhì)骨厚度卻增加。有研究同樣也發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果，Rocabado等[11]通過去卵巢觀察股骨骨組織形態(tài)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)端松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨變化不一致。分析可能與兩種不同雌激素受體(ERα和ERβ)差異性表達(dá)有關(guān)[12]。

反義長鏈非編碼RNA(anti-sense lncRNAs)是一種內(nèi)源性RNA(endo-siRNA)， 通過與正義鏈相同的轉(zhuǎn)錄因子競爭結(jié)合來調(diào)控正義鏈的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并在參與反義轉(zhuǎn)錄過程中導(dǎo)致RNA polⅡ停滯，介導(dǎo)附件染色質(zhì)的組蛋白和DNA甲基化，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄基因沉默作用[13]。因此，反義lncRNA參與的復(fù)雜生物學(xué)過程使學(xué)界對疾病發(fā)展和治療有了新的認(rèn)識：即反義lncRNA可以通過堿基互補(bǔ)配對方式與正義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合，提示如果某正義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為某病致病基因產(chǎn)物，則可以利用該反義lncRNA通過抑制該疾病的致病基因功能，從而發(fā)揮治療作用。在NCBI Blast比對中發(fā)現(xiàn)，MEF2C-AS1與MEF2C存在反向互補(bǔ)配對堿基序列[4]， 提示lncRNA MEF2C-AS1可通過調(diào)控MEF2C基因發(fā)揮重要作用。

MEF2C是骨代謝中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。甲狀旁腺激素對SOST表達(dá)的抑制是由MEF2C介導(dǎo)的[14]，而SOST基因編碼的SOST蛋白是成骨細(xì)胞骨形成的抑制劑。因此，可通過抑制SOST基因表達(dá)來刺激成骨細(xì)胞分化，從而達(dá)到促進(jìn)骨合成作用。課題組在前期體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過MEF2C-AS1過表達(dá)或沉默表達(dá)及進(jìn)一步行拯救實(shí)驗(yàn)來檢測MEF2C和SOST基因及蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)MEF2C-AS1組的MEF2C和SOST表達(dá)水平低于對照組，而沉默MEF2C-AS1表達(dá)組高于對照組；然而在拯救實(shí)驗(yàn)(同時(shí)過表達(dá)MEF2C-AS1和MEF2C基因)中檢測到原本受抑制的SOST表達(dá)有所恢復(fù)。因此，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MEF2C-AS1通過抑制MEF2C基因，從而抑制SOST基因和蛋白表達(dá)；并且在過表達(dá)MEF2C-AS1中檢測成骨分化早期標(biāo)志物堿性磷酸酶活性明顯升高，表明能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟[5],提示對促進(jìn)機(jī)體骨量增加有積極作用。

本實(shí)驗(yàn)在前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，首先復(fù)制骨質(zhì)疏松大鼠模型，通過注射MEF2C-AS1慢病毒載體后，用Western blot分析發(fā)現(xiàn)OVX+MEF2C-AS1組MEF2C蛋白相對表達(dá)水平較OVX組降低，這與前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[5],進(jìn)一步證實(shí)在體內(nèi)MEF2C-AS1對MEF2C表達(dá)同樣有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步通過ELISA分析，發(fā)現(xiàn)OVX+MEF2C-AS1組SOST蛋白表達(dá)水平較OVX組明顯降低。結(jié)合前期促進(jìn)成骨細(xì)胞活化結(jié)論[5]，表明在大鼠體內(nèi)，MEF2C-AS1通過下調(diào)MEF2C表達(dá)，抑制SOST基因編碼SOST蛋白表達(dá)，從而對成骨細(xì)胞分化起積極作用。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)OVX組SOST蛋白較SHAM組升高，表明去卵巢誘導(dǎo)雌激素缺乏使SOST蛋白表達(dá)增加。

本實(shí)驗(yàn)還做了骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析，以驗(yàn)證MEF2C-AS1是否有促進(jìn)骨形成作用，發(fā)現(xiàn)OVX+MEF2C-AS1組大鼠BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、BMD均高于去卵巢對照組，且BV、Tb.Th、Tb.N、BMD、BV/TV恢復(fù)假手術(shù)對照組水平，表明MEF2C-AS1可促進(jìn)骨形成、增加骨體積、改善骨小梁為主的骨微結(jié)構(gòu)，從而增加骨密度。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還意外發(fā)現(xiàn)，與空載體對照組比較，SHAM+MEF2C-AS1組和OVX+MEF2C-AS1組骨密度都有所升高，表明MEF2C-AS1可能對正常大鼠骨丟失有積極保護(hù)作用，但結(jié)果差異不明顯，分析可能與干預(yù)時(shí)間短或不除外正常大鼠卵巢分泌雌激素與基因之間相互影響有關(guān)，仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

SOST蛋白由骨細(xì)胞分泌,競爭性結(jié)合LRP5/6抑制成骨細(xì)胞中Wnt/b-catenin途徑，從而抑制成骨細(xì)胞分化[15]。Romosozumab是SOST蛋白單抗隆抗體，研究表明其既能抑制SOST蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，從而促進(jìn)骨形成，又能在一定程度上減少骨吸收[16]。本研究通過lncRNA MEF2C-AS1抑制SOST蛋白表達(dá)，可能促進(jìn)Wnt/b-catenin信號通路表達(dá)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、成熟發(fā)揮成骨作用。因此，本研究從抑制SOST蛋白表達(dá)的LncRAN方向?yàn)楣谴x疾病中促骨形成提供新的治療靶點(diǎn)。

隨著研究的深入，骨質(zhì)疏松癥被認(rèn)為是復(fù)雜性、多基因疾病。在全基因組關(guān)聯(lián)研究中發(fā)現(xiàn)SOST中多個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)和MEF2C rs1366594基因與OP及BMD之間的關(guān)聯(lián)[4,17]。有研究發(fā)現(xiàn)MEF2C-AS1基因上多個(gè)lncRNA SNP位點(diǎn)與股骨頸BMD顯著相關(guān)[4]，提示LncRNA MEF2C-AS1/MEF2C/SOST通路在人類骨代謝疾病中的重要性。本研究首次在體內(nèi)證實(shí)lncRNA MEF2C-AS1通過下調(diào)MEF2C和SOST蛋白表達(dá)，來改善去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)，促進(jìn)骨形成、增加骨體積和骨密度。因此，通過研究骨損傷與人類年齡相關(guān)骨代謝疾病的基因改變，可為以骨丟失為主疾病的合成代謝治療提供潛在基因治療靶點(diǎn)。但本實(shí)驗(yàn)中未明確MEF2C-AS1在體內(nèi)對成骨細(xì)胞的成骨能力的影響，通過何種信號途徑來增加骨量的問題也仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。