何晉, 尋治銘, 謝飛, 儀楊, 劉夢(mèng)昱, 趙鵬翔

1.北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部，北京 100124;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院，北京 100020

氫氣是一種無(wú)色無(wú)味、在水中溶解度較低、并具有還原性的氣體。早在20世紀(jì)90年代就發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)腸道菌群可以通過(guò)發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生氫氣，并通過(guò)消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)排出體外[1]，但當(dāng)時(shí)認(rèn)為氫氣是一種生理惰性氣體。1975年，Dole等[2]首次在小鼠皮膚鱗癌模型中報(bào)道了高壓下(8個(gè)大氣壓)呼吸高濃度氫氣(97.5%)的抗腫瘤作用。2007年，Ohsawa等[3]首次證明了正常大氣壓下呼吸低濃度氫氣(1%～4%)對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有顯著的保護(hù)作用，并認(rèn)為這種保護(hù)作用可能是通過(guò)選擇性清除毒性自由基介導(dǎo)的。由于氫氣分子量小，可輕易穿過(guò)血腦屏障結(jié)構(gòu)[4]，除腦缺血再灌注損傷外，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)氫氣對(duì)帕金森病、阿爾茨海默病、顱腦損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有一定的改善作用[5-7]，氫氣對(duì)大鼠顱腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)具有顯著的改善作用，主要表現(xiàn)為減少神經(jīng)元的丟失，抑制損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，并促進(jìn)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化[8]。除中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病外，目前研究發(fā)現(xiàn)氫氣在心血管系統(tǒng)疾病[9-13]、免疫系統(tǒng)疾病[14-17]、呼吸系統(tǒng)疾病[18-20]、代謝性疾病[21-23]和腫瘤[24-27]等多種疾病中均表現(xiàn)出正面的改善功能。

目前臨床試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中氫氣的干預(yù)方式主要有飲用富氫水(hydrogen-rich water, HRW)、吸氫、氫沐浴、注射富氫生理鹽水或食用能促進(jìn)釋放氫氣的食物等[28]。飲用富氫水是常見(jiàn)的氫氣干預(yù)方式，很多研究都采用飲用富氫水的干預(yù)方式[29]，但是大多數(shù)研究都是在疾病狀態(tài)下進(jìn)行的，并且干預(yù)時(shí)間也相對(duì)較短。長(zhǎng)期飲用富氫水對(duì)正常機(jī)體的生理功能是否會(huì)產(chǎn)生影響尚不清楚。為獲得更多的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，本研究選用健康大鼠飲用富氫水12個(gè)月，之后由于疫情原因中止飲用富氫水6個(gè)月(僅飲用正常水)，在第18個(gè)月檢測(cè)各種生理指標(biāo)的變化，以期獲得正常機(jī)體長(zhǎng)期飲用富氫水的數(shù)據(jù)，為富氫水相關(guān)干預(yù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 富氫水

富氫水購(gòu)買(mǎi)自北京活力氫源飲品有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

20只6周齡SD雄性大鼠，體重80～100 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在清潔級(jí)動(dòng)物房中進(jìn)行飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在22～25 ℃，空氣相對(duì)濕度40%～70%，12 h/12 h明暗交替。實(shí)驗(yàn)前，動(dòng)物適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境一周，并將其隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組(CTL)和富氫水組(HRW)，每組10只，并用耳釘進(jìn)行標(biāo)號(hào)。HRW組大鼠每天上午8:00和下午5:00各飲用富氫水1 h，CTL組大鼠以同樣的時(shí)間段飲用純凈水，其余時(shí)間禁水，兩組大鼠自由飲食，共處理12個(gè)月，之后由于疫情原因中止飲用富氫水6個(gè)月(僅飲用正常水)。在第18個(gè)月，對(duì)大鼠進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3 大鼠體重和臟器重量的稱(chēng)量

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)兩組大鼠進(jìn)行活體稱(chēng)重。在做完其他活體指標(biāo)檢測(cè)后，最后將其統(tǒng)一麻醉處死，迅速剖開(kāi)腹腔和胸腔，取出心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和腦組織，生理鹽水清洗臟器表面并用濾紙吸干液體，立即稱(chēng)量。

1.4 代謝籠實(shí)驗(yàn)收集實(shí)驗(yàn)大鼠的飲水量、進(jìn)食量、排尿量和排便量

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一天上午8:00點(diǎn)，將兩組大鼠放入代謝籠中，分別在食槽內(nèi)和飲水瓶?jī)?nèi)加入飼料50 g和飲用水200 mL。次日上午8:00取出代謝籠下方的抽屜，收集糞網(wǎng)上的糞便放天平上稱(chēng)量，即為排便量; 收集尿盒內(nèi)的尿液用量筒稱(chēng)量，即為排尿量。并測(cè)量大鼠的進(jìn)食量和飲水量，進(jìn)食量=50-剩余飼料量(g)，飲水量=200-剩余水量(mL)。

1.5 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠的心臟功能

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一天，應(yīng)用彩色多普勒超聲心動(dòng)圖對(duì)兩組大鼠進(jìn)行心臟超聲學(xué)檢查。將大鼠仰臥位固定，異氟烷持續(xù)性吸入麻醉，胸部脫毛處理，將探頭置于大鼠左胸前，以胸骨旁左室長(zhǎng)軸和乳頭肌水平短軸切面，調(diào)整好角度測(cè)定心率(heart rate, HR)、左心室射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction, EF)、左心室質(zhì)量(left ventricular mass, LV Mass)、左心室軸縮短率(left ventricular fractional shortening, FS)、左心室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume, LVEDV)、左心室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume, LVESV)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension, LVEDD)、左心室收縮末內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension, LVESD)等心臟功能評(píng)價(jià)指標(biāo)。連續(xù)測(cè)3次，結(jié)果取平均值。

1.6 血液常規(guī)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1血液采集實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一天晚上8:00開(kāi)始，所有大鼠禁食，不禁水。次日采用3%異氟烷對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，避免動(dòng)物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。從大鼠尾靜脈采血，其中約1 mL置于含促凝劑的促凝管中，用于血清生化指標(biāo)的檢測(cè)；1 mL置于EDTA·K2抗凝管中，用于血液常規(guī)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.6.2血液常規(guī)指標(biāo)的檢測(cè)使用全自動(dòng)血液生理分析儀測(cè)定大鼠血液常規(guī)指標(biāo)，嚴(yán)格遵守儀器使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。測(cè)定指標(biāo)包括白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白濃度(HGB)、血紅蛋白平均含量(MCHGB)、血紅蛋白平均濃度(MCHC)、血小板濃度(PLT)、中性粒細(xì)胞數(shù)(neutrophils)、嗜酸性粒細(xì)胞(eosnophils)、嗜堿性粒細(xì)胞(basophils)、淋巴細(xì)胞(lymphocytes)、平均紅細(xì)胞體積(MCVU)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、紅細(xì)胞分布寬度(RDW-SD)等。

1.6.3血清生化指標(biāo)的檢測(cè)促凝管中的血液樣品在室溫靜置30 min后，以3 000 r·min-1離心10 min，收集上層血清樣品，并采用西門(mén)子2 400全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清生化指標(biāo)，包括空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、甘油三脂(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)、總膽汁酸(total bile acid, TBA)、尿酸(uric acid, UA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic pyruvic transaminase, GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxalacetic transaminase, GOT)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、肌酸激酶(creatine kinase, CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB, CK-MB)、α-羥丁酸脫氫酶(α-hydroxybutyrate, α-HBDH)等，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照儀器使用說(shuō)明進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行非配對(duì)t-test統(tǒng)計(jì)分析，各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)值以Mean±SEM表示，以P<0.05判定為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 富氫水對(duì)大鼠體重和臟器重量的影響

為了探究長(zhǎng)期飲用富氫水對(duì)大鼠體重和臟器重量的影響，分別對(duì)兩組大鼠做了體重稱(chēng)量和各臟器的稱(chēng)量。如圖1所示，和CTL相比，HRW組大鼠腦組織重量顯著升高(P<0.05)，而大鼠體重和其他臟器重量，包括心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟均無(wú)顯著性變化(P>0.05)。

注：*—富氫水組(HRW)和對(duì)照組(CTL)間的差異在P<0.05 水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 富氫水對(duì)大鼠飲水進(jìn)食和排泄量的影響

為了探究長(zhǎng)期飲用富氫水對(duì)大鼠飲食進(jìn)水和排泄量的影響，代謝籠法測(cè)定大鼠進(jìn)食量、飲水量、排尿量和排便量。如圖2所示，HRW組較CTL組各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖2 富氫水對(duì)大鼠飲水進(jìn)食和排泄量的影響

2.3 富氫水對(duì)大鼠心臟功能的影響

為了探究長(zhǎng)期飲用富氫水對(duì)大鼠心臟功能是否有顯著性影響，應(yīng)用多普勒超聲技術(shù)對(duì)大鼠做心臟彩超。如圖3所示，與CTL組相比，HRW組大鼠的心率(HR)、射血分?jǐn)?shù)(EF)、左心室軸縮短率(FS)、左心室質(zhì)量(LV Mass)、左心室舒張末期容積(LVEDV)、左心室收縮末期容積(LVESV)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)和左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

圖3 富氫水對(duì)大鼠心臟功能的影響

2.4 富氫水對(duì)大鼠血液常規(guī)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)的影響

為了進(jìn)一步探究長(zhǎng)期飲用富氫水對(duì)大鼠血液指標(biāo)的影響，我們對(duì)兩組大鼠進(jìn)行了血液常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)和血液生化指標(biāo)檢測(cè)。血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果如表1所示，與CTL組相比，HRW組大鼠的各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如表2所示，與CTL組相比，HRW組大鼠血清甘油三酯(TG)水平顯著升高(P<0.05)，而其他生化指標(biāo)較CTL組無(wú)顯著性變化(P>0.05)。

表1 富氫水對(duì)大鼠血液常規(guī)指標(biāo)的影響

表2 富氫水對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響

3 討論

迄今為止，關(guān)于氫氣生物學(xué)效應(yīng)的科研論文已發(fā)表超過(guò)1 400篇，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)證據(jù)均表明氫氣對(duì)各種疾病有預(yù)防、治療或保護(hù)作用，因此氫氣被普遍認(rèn)為具有很好的臨床應(yīng)用前景。目前使用氫氣的安全性也被廣泛認(rèn)可，其原因主要在于以下幾方面：一是由于氫氣與體內(nèi)自由基等物質(zhì)反應(yīng)后生成水，并不會(huì)生成其他有害副產(chǎn)物；另一個(gè)重要證據(jù)來(lái)自于潛水醫(yī)學(xué)研究，氫氣很早就用于人類(lèi)潛水作業(yè)，實(shí)踐證明持續(xù)暴露于20個(gè)大氣壓的氫氣分壓環(huán)境下并不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生任何毒性效應(yīng)。由于這種氫氣劑量已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)常壓下氫氣的使用劑量，這就有力地支持了常壓下使用氫氣的安全性；此外，目前關(guān)于氫氣的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中也均無(wú)氫氣毒副作用的報(bào)道。然而以上這些證據(jù)并不能說(shuō)明氫氣干預(yù)就一定沒(méi)有副作用，尤其是長(zhǎng)期氫氣干預(yù)是否會(huì)對(duì)機(jī)體生理功能產(chǎn)生影響還需要更多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)的數(shù)據(jù)支持。

為了研究長(zhǎng)期飲用富氫水的安全性，本研究以SD大鼠為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)的時(shí)間跨度從大鼠6周齡開(kāi)始一直到大鼠19.5個(gè)月齡，其中飲用富氫水時(shí)間12個(gè)月，然后飲用正常水6個(gè)月，換算成人的年齡相當(dāng)于從10歲開(kāi)始飲用富氫水到35歲，此后飲用正常水到50歲時(shí)檢測(cè)各項(xiàng)生理指標(biāo)的變化。在我們前期的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，飲用富氫水6個(gè)月對(duì)大鼠體重、GLU、UA、ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、AST(門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)均無(wú)顯著性影響[30]，這些指標(biāo)在本研究中也無(wú)顯著性變化。然而在臟器重量指標(biāo)中我們發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期飲用富氫水后的大鼠腦組織重量有所增加，考慮到本研究的實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，而隨著大鼠年齡的增加，其大腦會(huì)逐漸萎縮，重量減輕，因此該結(jié)果提示富氫水可能在防護(hù)腦組織萎縮方面發(fā)揮積極作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期飲用富氫水可使血清TG水平升高，這與前期研究結(jié)果一致，前期研究發(fā)現(xiàn)從富氫水干預(yù)4個(gè)月開(kāi)始TG水平就有上升趨勢(shì)，該結(jié)果提示飲用富氫水對(duì)血清TG水平的影響需要一定時(shí)間，同時(shí)對(duì)TG的影響即使在富氫水干預(yù)終止后也會(huì)持續(xù)很久。前期研究中還發(fā)現(xiàn)飲用富氫水后膽固醇水平下降，表現(xiàn)為T(mén)C、LDL-C(低密度脂蛋白)和HDL-C(高密度脂蛋白)在飲用富氫水2個(gè)月后均有所下降，但是在本研究中發(fā)現(xiàn)這些指標(biāo)與對(duì)照均無(wú)顯著性差異，提示富氫水對(duì)膽固醇的影響會(huì)隨著富氫水干預(yù)的終止而消失。結(jié)合兩項(xiàng)研究來(lái)看，富氫水對(duì)TBA的影響可能在干預(yù)的早期(從第2周到第2個(gè)月)出現(xiàn)，從飲用富氫水第4個(gè)月開(kāi)始，TBA水平與對(duì)照組已無(wú)顯著性差異。此外，前期研究還發(fā)現(xiàn)，富氫水干預(yù)后心肌酶活性的變化最為迅速，從飲用富氫水第2周開(kāi)始直到第6個(gè)月，LDH、α-HBDH、CK和CK-MB活性均有所下降，而本研究中這些酶的活性與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異。該結(jié)果提示，雖然飲用富氫水很快會(huì)對(duì)心肌酶活性產(chǎn)生影響，但是這種影響會(huì)隨著富氫水干預(yù)的終止而消失。

需要指出的是，本研究最初擬評(píng)估長(zhǎng)期飲用富氫水對(duì)大鼠生理指標(biāo)的影響，但是由于2020年新冠疫情影響，富氫水一共干預(yù)了12個(gè)月，大鼠在后6個(gè)月飲用正常水。雖然疫情對(duì)本研究結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定影響，但是通過(guò)與前期研究結(jié)果進(jìn)行比較，我們可以更加深入地評(píng)估富氫水對(duì)大鼠正常生理指標(biāo)的影響，尤其是可以評(píng)估富氫水對(duì)生理指標(biāo)影響的持久性。綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)富氫水干預(yù)后長(zhǎng)期影響效果的觀察發(fā)現(xiàn)：①長(zhǎng)期飲用富氫水對(duì)血常規(guī)/血糖/肝功能無(wú)顯著影響；②血清甘油三酯水平顯著升高，而膽固醇、膽汁酸和尿酸水平無(wú)顯著變化；③對(duì)心臟功能無(wú)顯著影響；④腦組織重量有升高；⑤對(duì)體重、飲食進(jìn)水和排泄量無(wú)顯著影響。本研究一方面具有一定的基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值，同時(shí)對(duì)未來(lái)的氫氣臨床研究有一定的參考意義。