夏天爽，丁盧穎，張嘉寶，李曉瑾，王果平，辛海量 （1. 海軍軍醫(yī)大學(xué)：a. 藥學(xué)院生藥學(xué)教研室, b. 長海醫(yī)院藥材科，上海 00433; . 新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族研究所，新疆 烏魯木齊 83000）

糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid, GC）是一種在臨床上廣泛應(yīng)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胃腸道疾病及自身免疫疾病的藥物[1]。然而，研究顯示，有超過50%的患者在長期接受GC 的治療過程中會(huì)發(fā)生骨質(zhì)疏松癥[2]。目前，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松（glucocorticoid-induced osteoporosis, GIOP）已成為病理性骨丟失的第三大常見病癥，僅次于老年性骨質(zhì)疏松癥和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。與此同時(shí)，GIOP由于其高致殘率和高發(fā)病率給社會(huì)和家庭生活造成了極大的負(fù)擔(dān)，因此，如何預(yù)防和治療GIOP 成為醫(yī)學(xué)上關(guān)注的熱點(diǎn)。

啤酒花（Humulus lupulusL.）為?？迫劜輰俣嗄晟葙|(zhì)蔓生藤本植物，其雌性帶花果穗不僅是釀造啤酒的添加原料，也是全球廣泛應(yīng)用的藥物品種，并在歐洲廣泛用于緩解更年期潮熱及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[3]。黃腐酚（xanthohumol, XN）為啤酒花中的代表性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌等活性[4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，啤酒花提取物及黃腐酚可顯著改善去卵巢小鼠的骨丟失，防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。此外，兩者還可顯著調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的活性，維持骨穩(wěn)態(tài)[5-6]。然而，目前對(duì)于啤酒花及黃腐酚抗GIOP 的作用機(jī)制尚不明確。故筆者擬以地塞米松（DEX）誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松小鼠及其損傷的成骨細(xì)胞為模型，采用Micro-CT 及體外活性檢測(cè)等方法，對(duì)啤酒花及黃腐酚抗GIOP 的作用進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 藥材及試劑

啤酒花（PJH-01），產(chǎn)地新疆，購自河北安國中藥材市場(chǎng)，經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室辛海量副教授鑒定，密封存放于干燥陰涼處。稱取啤酒花藥材粉末70 g，加入料液比為1∶15 的75%乙醇，回流提取3 次，減壓濃縮干燥成浸膏，HPLC測(cè)定得浸膏中黃腐酚含量為0.55%[5]。使用前配制成相應(yīng)濃度的提取液。

其他試劑及購買廠家：黃腐酚（純度≥98%，上海歷鼎）；地塞米松（大連美侖）；阿侖膦酸鈉（上海國藥）；I 型膠原C 端肽（CTX-I）及骨鈣素（BGP）Elisa 試劑盒（南京建成）；堿性磷酸酶（ALP）及抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）試劑盒（南京建成）；胎牛血清（Gibco，美國）；α-MEM 培養(yǎng)基等細(xì)胞培養(yǎng)試劑（天津?yàn)螅还切纬傻鞍?（BMP-2）及成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子（Runx-2）抗體（Abcam，英國）；Micro-CT（eXplore Locus SP，GE，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.2.1 整體動(dòng)物模型

3 月齡ICR 小鼠，體重（20 ± 2）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：2013001831722；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2017-0004]。小鼠飼養(yǎng)于海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物房，室溫（24 ± 0.5）℃，每日12 h 光照/12 h 黑暗，自由飲食飲水，適應(yīng)1 周后開始動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 成骨細(xì)胞

取自新生24 h Wistar 大鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案及樣品收集

將56 只大鼠按體重以隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分為7 組（n=8）：空白對(duì)照組（CON），DEX 模型組（MOD,2.5 mg/kg），阿侖膦酸鈉陽性對(duì)照組（ALN, 1 mg/kg），啤酒花提取物低劑量組（HLE-L, 1 g/kg），啤酒花提取物高劑量組（HLE-H, 3 g/kg），黃腐酚低劑量組（XN-L, 30 mg/kg），黃腐酚高劑量組（XN-H, 90 mg/kg）。除空白組外，所有組別小鼠腹腔注射DEX 注射液，空白對(duì)照組小鼠注射同體積的生理鹽水，每周3 次；與此同時(shí)，予相應(yīng)藥物灌胃，空白對(duì)照組和模型組小鼠灌胃相同體積生理鹽水。每周灌胃給藥6 次，連續(xù)給藥12 周。每周稱量體重，按體重0.1 ml/10 g 調(diào)整給藥體積。末次給藥后，小鼠禁食、不禁水過夜，摘除眼球取血，靜置離心取血清，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中用于生化指標(biāo)檢測(cè)，剝離小鼠后肢右側(cè)股骨用于Mirco-CT 測(cè)定。

1.4 Micro-CT 檢測(cè)

取組織固定液中的小鼠右側(cè)股骨，剔除其表面附著的結(jié)締組織，用高分辨率Micro-CT 對(duì)股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行掃描。計(jì)算骨密度（BMD）、骨表面積/骨體積（BS/BV）、相對(duì)骨體積（BV/TV）、骨小梁數(shù)目（Tb.N.）及骨小梁分離度（Tb.Sp.）。

1.5 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

按照試劑盒說明書步驟，對(duì)小鼠血清中ALP、TRAP 及CTX-I 水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 原代成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)

采用二次消化法從新生大鼠顱蓋骨分離得到原代成骨細(xì)胞[7]，用含10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，取3～4 代成骨細(xì)胞進(jìn)行增殖、分化以及Western blot 分析。

1.7 成骨細(xì)胞增殖及堿性磷酸酶檢測(cè)

取3～4 代成骨細(xì)胞計(jì)算其數(shù)目，配制成細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml 細(xì)胞懸液接種于96 孔板。24 h后分別更換為含藥培養(yǎng)液（DEX: 10 μmol/L；HLE:100、20 μg/ml；XN: 5、1 μmol/L），除空白組外均給予DEX 損傷。給藥48 h 后采用MTT 法檢測(cè)成骨細(xì)胞的增殖情況。

取3～4 代成骨細(xì)胞計(jì)算其數(shù)目，配制成細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml 細(xì)胞懸液接種于24 孔板。24 h后分別更換為含藥培養(yǎng)液（給藥濃度同上）。培養(yǎng)過程中每3 d 更換1 次含藥培養(yǎng)液。第8 天裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，于4 ℃、13 800×g離心5 min。用對(duì)硝基苯磷酸二鈉法測(cè)定細(xì)胞 ALP 活性[8]。

1.8 成骨細(xì)胞骨形成相關(guān)蛋白檢測(cè)

將3～4 代的成骨細(xì)胞裂解，提取細(xì)胞總蛋白，根據(jù)BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。采用ELISA 試劑盒對(duì)成骨細(xì)胞BGP 含量進(jìn)行檢測(cè)，采用Western blot 技術(shù)[9]對(duì)BMP-2 及Runx-2 水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 啤酒花及黃腐酚顯著改善DEX 小鼠骨組織形態(tài)并減緩骨丟失

模型組小鼠股骨的骨組織形態(tài)與空白組相比，出現(xiàn)明顯空洞，見圖1；藥物治療后，HLE 及XN 顯著改善DEX 小鼠的骨組織形態(tài)及骨微結(jié)構(gòu)，防止骨質(zhì)空洞。

模型組小鼠BMD、BS/TV、BV/TV 及Tb.N.水平較空白組顯著降低，Tb.Sp.水平顯著升高（圖2）。藥物治療后，HLE 及XN 顯著逆轉(zhuǎn)了DEX 小鼠BMD 及骨小梁參數(shù)的異常，防治骨質(zhì)疏松。

2.2 啤酒花及黃腐酚顯著改善DEX 小鼠血清骨生化指標(biāo)異常

小鼠注射DEX 后，其血清ALP 水平顯著降低，TRAP 及CTX-I 水平顯著升高。藥物治療后，HLE 及XN 可顯著提高小鼠血清ALP 水平，并降低TRAP 及CTX-I 的高表達(dá)，調(diào)節(jié)骨代謝，且藥物高劑量組治療效果更佳（圖3）。

2.3 啤酒花及黃腐酚顯著提高DEX 損傷成骨細(xì)胞的活性并促進(jìn)骨形成

如圖4A-B 所示，DEX 損傷成骨細(xì)胞后，其增殖能力及ALP 活性顯著降低。藥物治療后，HLE 及XN 可顯著促進(jìn)DEX 損傷成骨細(xì)胞的增殖，提高ALP 活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。

在骨形成相關(guān)蛋白的表達(dá)方面，HLE 及XN 可顯著促進(jìn)DEX 損傷成骨細(xì)胞中BGP 及BMP-2 的表達(dá)，XN 還可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞Runx-2 的表達(dá)（圖4C-E），促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成。

圖1 小鼠股骨Micro-CT 掃描圖

圖2 小鼠股骨骨密度（A）及骨小梁參數(shù)（B-E）（n =8，±s）

圖3 小鼠血清生化指標(biāo)（n =8，±s）

圖4 成骨細(xì)胞的增殖（A）、分化（B）水平及骨形成相關(guān)蛋白（C-E）的表達(dá)（n =4，±s）

3 討論

DEX 作為臨床上常用的一種合成糖皮質(zhì)激素，在抗炎抗免疫反應(yīng)方面均具有良好的療效。與其他糖皮質(zhì)激素類似，長期使用DEX 會(huì)引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，尤其是對(duì)骨骼的影響，可大大增加骨質(zhì)疏松及生理性骨折的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[10]。本研究中，小鼠注射DEX 后，其股骨的骨微結(jié)構(gòu)顯著破壞，骨質(zhì)明顯空洞，骨密度及骨小梁參數(shù)顯著降低，且血清骨生化指標(biāo)異常，提示小鼠處于典型的骨質(zhì)疏松狀態(tài)。藥物治療后，啤酒花提取物及黃腐酚均可顯著改善GIOP 小鼠的骨微結(jié)構(gòu)破壞，增強(qiáng)骨密度，改善骨小梁參數(shù)，防治骨質(zhì)疏松。ALP 和TRAP 分別為評(píng)價(jià)骨形成與骨吸收的常用指標(biāo)，而CTX-I 為成熟膠原降解的標(biāo)志物，其活性水平與骨密度呈顯著的負(fù)相關(guān)[11]。本研究中，啤酒花提取物及黃腐酚可顯著提高ALP 含量，抑制TRAP 及CTX-I 的高表達(dá)，表明兩者可通過調(diào)節(jié)骨代謝的平衡防治骨丟失。

在GIOP 細(xì)胞層面的發(fā)病機(jī)制中，GC 對(duì)成骨細(xì)胞的影響占主導(dǎo)地位[12]。在成骨細(xì)胞活性檢測(cè)中，MTT 值及ALP 活性分別代表成骨細(xì)胞的增殖及分化水平。其中，ALP 合成于骨基質(zhì)成熟階段，利于骨基質(zhì)礦化[13]。本研究中，DEX 損傷成骨細(xì)胞后，其MTT 值及ALP 活性均顯著下降，表示糖皮質(zhì)激素抑制了成骨細(xì)胞的增殖及分化。藥物治療后，啤酒花提取物及黃腐酚可顯著提高損傷成骨細(xì)胞的MTT 值及ALP 活性，有效促進(jìn)了細(xì)胞的增殖與分化，提高成骨細(xì)胞活性。BGP、BMP-2 及Runx-2 均為典型的骨形成相關(guān)蛋白，其中BGP 是由非增殖期的成骨細(xì)胞特異合成并分泌的非膠原蛋白[14]，BMP-2 是參與成骨細(xì)胞分化階段的主要蛋白[15]，而Runx-2 是早期成骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)因子，三者在骨骼形態(tài)發(fā)生階段均起著關(guān)鍵作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，啤酒花提取物及黃腐酚可顯著促進(jìn)DEX 損傷成骨細(xì)胞中BGP、BMP-2 及Runx-2 的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了其可通過促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨形成對(duì)抗GIOP。以上研究為深入探討啤酒花及其活性成分黃腐酚抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制以及相關(guān)藥物的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。