孫 睿，付 麗，雷 雨 （. 北京碧生源藥業(yè)有限公司，北京，0433；. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海，0040）

藤茶即顯齒蛇葡萄Ampelopsis grossedentata(Hand.-Mazz.) W. T. Wang，是葡萄科蛇葡萄屬的一種野生木質(zhì)落葉藤本植物，俗稱藤茶、白茶等。其產(chǎn)地主要分布于湖南、湖北、云南、貴州、廣東、廣西、福建等地[1]。我國壯族和瑤族百姓，以及產(chǎn)地居民將其幼嫩莖葉經(jīng)揉制、干燥制成保健茶，用于感冒、發(fā)熱、咽喉腫痛、瘡癤等癥，至今已有數(shù)百年的歷史[2-3]。二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）為藤茶中主要的二氫黃酮醇類化合物，既往研究證實(shí)二氫楊梅素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、解酒保肝、抗病原微生物及調(diào)血脂等多方面的藥理作用[4-5]。牛蒡子（Fructus arctii）又名大力子、鼠粘子、惡實(shí)等，為菊科二年生草本植物牛蒡（Arctium lappaL.）的干燥成熟果實(shí)。具有疏散風(fēng)熱、宣肺祛痰、利咽透疹和解毒消腫的功效[6-7]。筆者通過研究藤茶不同產(chǎn)地、部位、加工工藝的二氫楊梅素含量，進(jìn)一步完善藤茶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。評價(jià)優(yōu)選藤茶與牛蒡子配伍的清咽功效，為進(jìn)一步開發(fā)清咽功能保健食品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材與試劑

藤茶植物原料于2018 年6～8 月采自湖南、湖北、福建、貴州不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)，所有采集的原植物均經(jīng)藥學(xué)高級工程師雷雨博士鑒定為葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata）的莖葉部位。不同植株采收間隔不小于300 m，單株不同采收方式及部位分為人工采收（芽尖、嫩葉、粗老葉、茶梗）、機(jī)器采收；藤茶（批號：20180620，貴州江口梵凈山云峰野生植物開發(fā)有限公司）；牛蒡子（批號：171101，安國市深豪藥業(yè)有限公司）；藤茶牛蒡子濃縮液：取采收地為貴州江口縣的芽尖部位優(yōu)選藤茶及牛蒡子的復(fù)配樣品105.0 g（藤茶63.0 g，牛蒡子42.0 g），常壓、溫度80 ℃，提取2 次，每次各用1 050 ml無菌水浸泡30 min，將提取液合并濃縮至70 ml，以下簡稱“復(fù)配樣品”；二氫楊梅素對照品（99.57 %，MMST-18031501，中國科學(xué)院成都生物研究所成都曼思特生物科技有限公司）；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher Chemical）；純水（MLMP-1-20T，四川優(yōu)普超純科技有限公司優(yōu)普系列超純水器）；磷酸（90 %，BCBD9465，F(xiàn)luka）；乙醚（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司）；碘伏（山東利爾康牌醫(yī)療科技股份有限公司）。

1.2 儀器

安捷倫高效液相色譜儀（Agilent 1 290，DAD檢測器）；超聲波儀器（上海睿祺電子設(shè)備有限公司）；QHAMS 型精密十萬分之一天平；FW100 型高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；XRYLS-25A 型電動耳腫打孔器（上海欣軟信息科技有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；微量加樣器（Hamilton）。

1.3 動物

SPF 級SD 大鼠，雄性，體重（185 ± 15）g，10 周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司 [許可證號：SCXK（京）2019-0008]。SPF 級BALB/c 小鼠，雄性，體重（20 ± 2）g，6 周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司 [許可證號：SCXK（京）2019-0008]。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品功能檢測中心SPF 級動物室 [許可證號：SYXK（京）2017-0038]。分籠飼養(yǎng)，控制室溫（25 ± 2）℃，自由攝食、飲水。維持飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司 [許可證號：SCXK（京）2019-0008] 生產(chǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；甲醇-0.05 %磷酸水溶液（30∶70）為流動相；流動相流速：1 ml/min；檢測波長291 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μl；運(yùn)行時(shí)間20 min；理論塔板數(shù)按二氫楊梅素計(jì)算不低于3 000。二氫楊梅素保留時(shí)間為8.37 min，如圖1 所示獲得樣品色譜圖。

圖1 二氫楊梅素對照品（A）及貴州江口梵凈山藤茶樣品（B）的HPLC 圖

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱定二氫楊梅素對照品12.72 mg，置于10 ml 容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，制得1.272 mg/ml 儲備液。

2.2.2 供試品溶液的制備

樣品拆袋，混合均勻，粉碎。精密稱定樣品約0.05 g 于100 ml 容量瓶中，加70 %乙醇，超聲提取30 min。取出后冷卻至室溫，加入70 %乙醇定容至刻度，搖勻，靜置。經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾后，供液相色譜分析用。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察

采用逐級稀釋法，量取適量二氫楊梅素儲備液，至于10 ml 容量瓶中，加70 %乙醇定容，制得濃度分別為0.019 9、0.039 8、0.079 5、0.159、0.318 mg/ml。以進(jìn)樣濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），固定進(jìn)樣量為10 μl，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y= 165 202X+ 482.04（r=0.999），表明二氫楊梅素對照品在0.019 9～0.318 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 儀器精密度考察

精密吸取二氫楊梅素系列對照品溶液0.079 5 mg/ml，按規(guī)定色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，每次進(jìn)樣10 μl，記錄二氫楊梅素的峰面積值，重復(fù)6 次進(jìn)樣峰面積的RSD 為0.60 %，表明該方法的儀器精密度良好。

2.3.3 方法重復(fù)性考察

稱取同一樣品6 份，按照“2.2.2”項(xiàng)制備供試品溶液進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，二氫楊梅素平均含量為14.23%，RSD 為1.24 %，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.3.4 方法穩(wěn)定性考察

取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)行測定，二氫楊梅素峰面積RSD 為1.41 %，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)基本穩(wěn)定，該方法穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率考察

按9 份樣品中二氫楊梅素含量的1.2 倍，1.0 倍，0.8 倍，分別準(zhǔn)確加入二氫楊梅素對照品。按照“2.2.2”供試品制備方法制備供試液，HPLC 進(jìn)樣檢測，計(jì)算加樣回收率。該樣品二氫楊梅素的加樣回收率在95.04 %～100.4 %之間，平均回收率為97.53 %，RSD 為2.00 %，表明本方法的準(zhǔn)確度良好，具體結(jié)果見表1。

綜上，方法學(xué)考察結(jié)果表明本研究建立的提取和分析方法能夠滿足藤茶中二氫楊梅素定量分析的要求。

2.4 數(shù)據(jù)處理

2.5 樣品含量測定

供試品溶液進(jìn)樣10 μl，通過回歸方程計(jì)算不同采收點(diǎn)藤茶芽尖部位的二氫楊梅素含量。結(jié)果17 批樣品中二氫楊梅素含量介于18.60 %～37.69 %之間，含量較高的采樣點(diǎn)在湖南省八大公山、貴州省江口縣、貴州省羅場鄉(xiāng)，較低的采樣點(diǎn)多為湖北及福建一帶。具體見表2。

表1 藤茶中二氫楊梅素加樣回收率的試樣結(jié)果（n =9）

表2 不同采收點(diǎn)芽尖部位藤茶中二氫楊梅素的含量（ ±s， n =6）

表2 不同采收點(diǎn)芽尖部位藤茶中二氫楊梅素的含量（ ±s， n =6）

采樣點(diǎn) 含量（%） 不同地區(qū)含量（%）湖北恩施 20.80±1.2 24.33±8.1湖北來鳳1 18.60±1.1湖北來鳳2 33.60±1.0福建將樂1 30.30±0.6 29.47±1.2福建將樂2 28.63±0.9湖南八大公 37.69±0.5 31.66±5.0湖南張家界1 33.67±0.3湖南張家界2 29.83±0.9湖南張家界3 30.39±1.2湖南張家界4 30.43±0.6湖南武陵山1 22.83±0.5湖南武陵山2 36.81±0.8貴州江口1 35.50±0.6 32.26±2.9貴州江口2 31.40±0.8貴州江口3 30.60±0.7貴州羅場1 35.11±1.0貴州羅場2 28.69±0.5

相對于湖南省張家界各采收點(diǎn)差異范圍（29.83 %～33.67 %），貴州省江口縣（30.60 %～35.50 %）、貴州省羅場鄉(xiāng)（28.69 %～35.11 %）、湖北省來鳳縣（18.60 %～33.60 %）、湖南省武陵山地區(qū)（22.83 %～36.81 %），藤茶芽尖部位中DMY 含量出現(xiàn)較大浮動。貴州省總體采收藤茶芽尖含量水平最高，其次為湖南省。

2.5.1 不同采收部位及加工方式樣品含量測定

自然曬干法指將新鮮采集的樣品攤開，于陽光下曬至全干；自然陰干法指新鮮采集的樣品攤開，于陰涼干燥通風(fēng)處晾至全干。選擇總體含量較高且含量趨于平穩(wěn)的貴州省江口縣2 號采收地樣品，利用人工采收手法收集同一植株的芽尖、嫩葉、粗老葉及茶梗樣品，同時(shí)利用機(jī)器采收同一植株樣本。而后利用不同干燥方式進(jìn)行加工處理，含測結(jié)果如表3 所示。

表3 同一采收地點(diǎn)不同部位及加工方式二氫楊梅素含量（ ±s ，n =6）

表3 同一采收地點(diǎn)不同部位及加工方式二氫楊梅素含量（ ±s ，n =6）

注：1.采收地點(diǎn)為貴州省江口縣2號點(diǎn)。2.芽尖部位用自然曬干加工方式其二氫楊梅素含量最高，平均含量為35.85 %。

采收部位 自然曬干含量（%） 自然陰干含量（%）芽尖 35.85±0.4 32.22±0.8嫩葉 26.22±0.5 28.32±0.6粗老葉 15.84±0.5 16.02±0.5茶梗 15.32±0.2 15.47±0.2機(jī)器采收 20.40±1.0 20.77±0.9

2.6 樣品清咽功效考察

2.6.1 對受試動物一般狀態(tài)和體重的影響

受試動物精神狀態(tài)、行為活動、攝食攝水等均未見明顯異常。給予復(fù)配樣品前后，各劑量組大鼠、小鼠的體重與空白對照組比較均無顯著性差異。

2.6.2 大鼠棉球植入致炎模型

大鼠低、中、高劑量組分別給予0.38、0.75、2.25 g/kg 復(fù)配樣品原藥材折算濃縮液灌胃，同時(shí)設(shè)空白對照組0 g/kg。經(jīng)口給予大鼠復(fù)配樣品36 d，實(shí)驗(yàn)結(jié)束前8 d，用脫毛器脫去大鼠兩側(cè)腹股溝處的毛，乙醚麻醉大鼠，碘伏消毒，在無菌條件下切開大鼠兩側(cè)腹股溝皮膚，植入經(jīng)高壓滅菌并烘干、稱重的棉球，縫合切口，繼續(xù)給予復(fù)配樣品。實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，給予復(fù)配樣品1 h 后，斷頸處死大鼠，在原縫合處剪開皮膚，剝離并取出棉球肉芽組織，置于已稱重的潔凈平皿中，恒溫干燥箱60 ℃開蓋干燥1 h 后稱重，計(jì)算肉芽腫凈重量。

由表4 可見，經(jīng)口給予大鼠復(fù)配樣品36 d 后，與空白對照組比較，中劑量組（0.75 g/kg）和高劑量組（2.25 g/kg）大鼠肉芽腫凈量降低，其中，中劑量組具有顯著性差異，高劑量組具有極顯著性差異，說明該劑量下的復(fù)配樣品可顯著改善大鼠棉球植入致炎率。

2.6.3 小鼠耳腫脹致炎模型

小鼠低、中、高劑量組分別給予0.75、1.50、*P＜ 0.05，**P＜ 0.01，與空白對照組比較。4.50 g/kg 復(fù)配樣品原藥材折算濃縮液灌胃，同時(shí)設(shè)空白對照組0 g/kg。經(jīng)口給予大鼠復(fù)配樣品36 d，實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，吸取二甲苯20 μl，滴加在小鼠右耳外側(cè)面耳郭的中央，讓其自由擴(kuò)散，30 min 后，將小鼠脫頸椎處死，剪下雙耳，用9 mm 直徑打孔器在兩耳相同部位打下耳片并稱重，以兩耳重量之差為耳郭腫脹值，計(jì)算耳郭腫脹率。

表4 大鼠棉球植入實(shí)驗(yàn)肉芽腫凈量（ ±s ，n =12）

表4 大鼠棉球植入實(shí)驗(yàn)肉芽腫凈量（ ±s ，n =12）

組別 給藥劑量（g/kg） 肉芽腫（m/mg）空白對照組 0.00 428.2±65.4低劑量組 0.38 392.3±45.3中劑量組 0.75 372.6±58.9*高劑量組 2.25 347.3±20.9**

由表5 可見，經(jīng)口給予小鼠復(fù)配樣品36 d 后，各劑量組小鼠耳郭腫脹率與空白對照組比較均有降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)耳郭腫脹率（ ±s， n =15）

表5 小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)耳郭腫脹率（ ±s， n =15）

*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，與空白對照組比較。

組別 給藥劑量（g/kg） 耳郭腫脹率（%）空白對照組 0.00 74.8±24.3低劑量組 0.75 64.2±11.9中劑量組 1.50 59.8±13.8*高劑量組 4.50 53.7±7.8**

3 討論

本研究考察了湖北、湖南、貴州、福建等不同產(chǎn)地藤茶有效成分二氫楊梅素的含量，采樣點(diǎn)所在地為顯齒蛇葡萄主產(chǎn)區(qū)[8-9]，其中種植于貴州省江口縣的藤茶無論在不同產(chǎn)地功效成分含量還是同一產(chǎn)地不同植株含量穩(wěn)定性上都相對較好。藤茶以芽尖嫩葉多為佳，粗老葉、茶梗較多會影響藤茶整體品質(zhì)和功效。該研究數(shù)據(jù)可作為企業(yè)收購原料參考指標(biāo)，用于判定藤茶產(chǎn)品中二氫楊梅素的含量情況，為生產(chǎn)及研發(fā)提供依據(jù)。

經(jīng)口給予本配伍樣品36 d 后，高劑量組大鼠肉芽腫凈量及小鼠耳郭腫脹率均顯著低于空白對照組。該復(fù)配樣品對大、小鼠體重增長均無不良影響。據(jù)結(jié)果判定大鼠棉球植入結(jié)果及小鼠耳腫脹治療效果均呈陽性，可認(rèn)定該配伍樣品具有清咽功能。綜上所述，該藤茶及牛蒡子配伍樣品在動物致炎模型中發(fā)揮了消炎作用。

吸煙、飲酒等不良習(xí)慣加大群眾患急慢性咽炎的概率，具有清咽功能保健食品的開發(fā)需求迫在眉睫[10]，本著中醫(yī)藥主張未病先治的理論，筆者將繼續(xù)對本配伍藥效及安全性進(jìn)行深入研究。