蔡孟成，劉益群，俞超芹，金永生 （海軍軍醫(yī)大學(xué)：. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, . 長海醫(yī)院; . 藥學(xué)院，上海 200433）

清開靈是由《溫病條辨》安宮牛黃丸加減化裁而來，由珍珠母、梔子、水牛角、板藍根、金銀花五味中藥以及膽酸、豬去氧膽酸、黃芩苷3 種活性成分組成。具有清熱解毒、鎮(zhèn)靜安神的功效，臨床上常用于病毒性感冒、上呼吸道感染、急性扁桃體炎等疾病。現(xiàn)代研究表明，清開靈具有良好的抗病毒作用，對流感病毒H1N1、H5N1 和H7N9 以及2 型登革熱病毒等均有一定的抑制作用[1-2]。冠狀病毒感染引起的肺炎是由病毒感染引起，與流感的起因及癥狀極其相似[3]，因此，清開靈也有一定的干預(yù)冠狀病毒的作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來整合系統(tǒng)生物學(xué)和藥理學(xué)的一門新興學(xué)科，通過大量的生物學(xué)信息，對已有的分子生物學(xué)數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)全面的分析，從蛋白、分子、基因?qū)用娼沂緳C體與疾病的相互作用機制，可以為多靶點藥物的開發(fā)和機制研究提供依據(jù)；分子對接是通過受體的特征以及受體和藥物分子之間的相互作用方式來進行藥物設(shè)計的方法，通過結(jié)合能的大小判定受體與藥物分子結(jié)合的能力。本文旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)探討清開靈干預(yù)病毒性感冒的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制，以期為今后清開靈用于臨床預(yù)防和治療病毒性感冒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物靶點的篩選

本研究采用計算系統(tǒng)生物學(xué)實驗室的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺 (TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php) 檢索中藥梔子、板藍根、金銀花的活性成分。因珍珠母和水牛角作為動物類藥材在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中未收錄，筆者應(yīng)用Traditional Chinese Medicines Integrated Database (TCMID，http://119.3.41.228:8 000/tcmid/search/) 對珍珠母與水牛角進行活性成分檢索。根據(jù)化合物口服生物利用度 (OB) 與類藥性 (DL) 進行篩選，OB 閾值設(shè)為 OB≥30%，DL 閾值設(shè)為 DL≥0.18[4-5]。此外，由于黃芩苷易在體內(nèi)代謝為黃芩素，膽酸易代謝為去氧膽酸，豬去氧膽酸易代謝為豬膽酸[6-8]，故黃芩素、去氧膽酸、豬膽酸也被納入活性成分范圍內(nèi)。采用 PubChem BioActivity Analysis Service 數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/assay/assay.cgi)來獲取豬膽酸和豬去氧膽酸的靶點，其余活性成分靶點則通過TCMSP 獲得[9]。

1.2 疾病靶點的收集

以 “influenza”為關(guān)鍵詞檢索 GeneCard（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，收集與病毒性感冒相關(guān)的作用靶點[3]。

1.3 構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)

為明確疾病靶點與藥物靶點之間的關(guān)系，將兩部分靶點進行交集，輸入 Cytoscape 軟件構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape 軟件的核心架構(gòu)是網(wǎng)絡(luò)，每個節(jié)點是基因或活性成分，節(jié)點與節(jié)點之間的連接代表這些生物分子之間的相互作用，節(jié)點的度值代表網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點與節(jié)點相連的數(shù)目，度值越大說明該活性成分或靶點處于核心地位。

1.4 構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

為更深層次探究靶點之間的相互作用關(guān)系，將交集所得的共同靶點上傳至線上軟件STRING10.5(http://string db.org)，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。把物種選擇為 Homosapiens，置信度設(shè)置為＞0.9，其余參數(shù)保持默認設(shè)置，獲取 PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.5 生物過程與通路分析

利用 R Project 中的 org.Hs.eg.db 程序包（http://www.bioconductor.org/packages/release/data/annotati on/html/org.Hs.eg.db.html）將基因 symbols 轉(zhuǎn)變?yōu)镋ntrez IDs，進而利用 clusterProfiler 程序包（3.6 版）（http://bioconductor.org/packages http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html）對網(wǎng)絡(luò)進行 GO 分析和 KEGG 通路分析。設(shè)定P＜0.05，并按照涉及的靶點數(shù)目多少進行排序，獲取 GO 富集分析中分子功能、細胞組成和生物過程的前10 個條目以及 KEGG 富集的前 20 條信號通路。

1.6 分子對接

為進一步篩選清開靈中可能干預(yù)病毒性感冒的潛在活性成分，將清開靈中的關(guān)鍵化合物膽酸、豬去氧膽酸、黃芩苷與“1.4”項下篩選出的度值較高的蛋白進行分子對接。從PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載靶蛋白RELA 與JUN 的三維晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID 為1VJ7 和2H7H，PDB 格式），從Pubchem 數(shù) 據(jù) 庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載膽酸、豬去氧膽酸與黃芩苷的三維結(jié)構(gòu)（CAS 號為81-25-4、83-49-8、21 967-41-9，PDB 格式），采用AutoDock Tools 1.5.6 軟件刪除靶蛋白的水分子，分離配體和受體，添加非極性氫，計算Gasteiger 電荷，分別保存為pdbqt 格式的文件。將已經(jīng)保存為PDB 格式的化合物導(dǎo)入AutoDock Tools 1.5.6，添加原子電荷，分配原子類型，所有柔性鍵均默認可旋轉(zhuǎn)，保存為pdbqt 格式，作為對接配體。運行Auto Dock 軟件進行對接，采用Pymol軟件可視化對接結(jié)果[10]。

2 結(jié)果

2.1 潛在活性成分的篩選與對應(yīng)靶點的收集

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索到板藍根活性成分169 個，金銀花活性成分236 個，梔子活性成分98 個，通過TCMID 數(shù)據(jù)庫檢索到珍珠母活性成分9 個，水牛角活性成分6 個。根據(jù)OB≥30%與DL≥0.18篩選出板藍根活性成分39 個，金銀花活性成分23 個，梔子活性成分15 個，其中MOL000098（槲皮素）、MOL000422（山奈酚）、MOL001194（亞油酸乙酯）和MOL003095（甘露醇）為梔子與金銀花的共有成分，MOL000358（β-谷甾醇）和MOL000449（豆甾醇）為梔子、金銀花和板藍根的共有成分（圖1 中綠色節(jié)點表示活性成分，紅色節(jié)點表示藥物，橙色圈內(nèi)節(jié)點為藥物共有成分）。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取上述中藥活性成分以及黃芩苷、黃芩素、膽酸、去氧膽酸的靶點，通過PubChem BioActivity Analysis Service 獲取豬去氧膽酸以及豬膽酸的靶點，除去重復(fù)靶點，共獲得靶點225 個。

2.2 疾病相關(guān)靶點的篩選

從GeneCard 數(shù)據(jù)庫中獲得病毒性感冒靶點2 506 個。

2.3 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將“2.1”中的225 個清開靈活性成分靶點與“2.2”中的2 506 個病毒性感冒靶點輸入Venny2.1軟件，繪制韋恩圖，兩者進行交集后獲得疾病-藥物成分共同靶點100 個，見圖2。采用Cytoscape 軟件構(gòu)建的活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)共包含147 個節(jié)點(47 個化合物節(jié)點，100 個靶點節(jié)點)和315 條邊，其中，紅色節(jié)點表示化合物，綠色節(jié)點表示藥物靶點，連接化合物與靶點的邊表示它們之間有作用關(guān)系，見圖3。表1 列出了化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點、類別及其度值。活性成分度值排名前5 位的是槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-胡蘿卜素和黃芩素，這5 種化合物的節(jié)點數(shù)分別是71、31、23、18 和15。靶點度值排名前5 位的是前列腺素過氧化物合酶2（PTGS2）、前列腺素過氧化物合酶1（PTGS1）、絲氨酸蛋白酶1（PRSS1）、一氧化氮合酶（NOS2）和雌激素受體1（ESR1），分別能與44、31、15、14 和13 個化合物發(fā)生相互作用，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點的特性。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

圖2 清開靈化學(xué)成分作用靶點與病毒性感冒相關(guān)靶點交集分析

應(yīng)用 STRING 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)(圖4)，在此網(wǎng)絡(luò)圖中包含88 個節(jié)點，718 條邊，同時得到網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵靶點的頻次 (圖5)。根據(jù)“度值＞均值”篩選出關(guān)鍵節(jié)點34 個，包括：JUN、RELA、MAPK1、IL6、AKT1、MAPK14、CXCL8、APP、IL1B、MAPK8、VEGFA、FOS、EGFR、IL-4、ESR1、IL2、PRKCA、PRKCB、CASP8、CCL2、MYC、NFKBIA、CASP3、CTNNB1、 IFNG、 IL-10、 CXCL2、 RB1、 ARG1、CHUK、CXCL10、MMP9、NOS2、STAT1。度值最高的是JUN，度值為29；其次為RELA，度值為27；MAPK14 度值為25，IL-6 度值為23。度值大的靶點提示在網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，度值大的靶點很可能是清開靈治療 病毒性感冒的關(guān)鍵靶點。

圖3 清開靈活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

表1 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點及其度值

2.5 GO 與KEGG 富集分析

GO 富集條目（圖6）生物過程主要包括：脂多糖反應(yīng)、 氧化應(yīng)激反應(yīng)、金屬離子反應(yīng)、細胞脂多糖反應(yīng)，分子功能包括：細胞因子受體結(jié)合、細胞因子活性、血紅素結(jié)合、 磷酸酶結(jié)合，其在膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、囊腔等處富集。KEGG 富集信號通路（圖7）主要包括：卡波濟肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、乙型肝炎、人巨細胞病毒感染、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE 信號通路等。其中，卡波濟肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染的靶點主要包括IL-6、STAT1、p38、CASP8、Bax、CASP3、CASP9、 CyrC、 IKK、 RB、 E2F、 ICAM1、 Raf、ERK、 AKT、 IKBa、 NFKB、 JNK、 AP-1、 IL-8、COX2、VEGF 和Myc；乙型肝炎的靶點主要包括：STAT1、JNK、p38、AP-1、ERK、IKK、IKB、NFKB、 PKC、 Raf、 STAT、 IL-8、 PCNA、 MMP-9、Bax、Bcl2、CASP9、CASP3、Akt、SAPK、pRb 和E2F（圖8、圖9）。

圖4 清開靈蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對接

一般認為配體與受體結(jié)合的穩(wěn)態(tài)構(gòu)象能量越低，產(chǎn)生的效應(yīng)越強。筆者對清開靈中的膽酸、豬去氧膽酸合黃芩苷進行分子對接，對接模式見圖10，其中，藍紫色部分代表蛋白質(zhì)，紅黃色部分代表活性成分。膽酸、豬去氧膽酸合黃芩苷與RELA 和JUN 對接的結(jié)合能見表2。其中，HQG表示黃芩苷，ZQYDS 表示豬去氧膽酸，DS 表示膽酸。

3 討論

清開靈由珍珠母、梔子、水牛角、板藍根、金銀花五味中藥以及膽酸、豬去氧膽酸、黃芩苷3 種活性成分組成。金銀花中槲皮素、木犀草素、綠原酸等是抗流感病毒的主要活性成分，對甲型流感病毒、皰疹病毒及腺病毒均有一定的抑制作用[11]。梔子提取物對流感病毒感染所致小鼠的肺部炎癥有明顯抑制作用，在體外對流感病毒等6 種病毒引起的細胞病變有明顯抑制作用[12]。板藍根乙酸乙酯部位的生物堿、有機酸和氨基酸衍生物與抗病毒活性密切相關(guān)[13]?，F(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明水牛角-珍珠母藥對的解熱作用可能與水牛角內(nèi)的氨基酸代謝與珍珠母內(nèi)金屬離子代謝有關(guān)[14]；膽酸-豬去氧膽酸藥對可能通過作用于MR 影響水、電解質(zhì)代謝，從而發(fā)揮抗炎作用[9]。黃芩苷可以通過抑制H1N1 流感病毒的中后期mRNA 的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，抑制神經(jīng)氨酸苷酶活性，以及抑制病毒誘導(dǎo)的巨噬細胞和肺上皮細胞中促炎基因的表達，從而影響 IL-6和 IL-8 等的合成[15-16]。綜上所述，現(xiàn)代研究表明清開靈干預(yù)病毒性感冒的機制可能是通過抗病毒、抗炎實現(xiàn)的。

圖5 清開靈作用的關(guān)鍵靶點

圖6 清開靈GO 富集分析

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法共篩選出清開靈中活性成分90 個，作用靶點225 個，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點聯(lián)合作用的整體性和關(guān)聯(lián)性的特點。根據(jù)“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)結(jié)果，進一步得到排名前5 的關(guān)鍵化合物為槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-胡蘿卜素和黃芩素。其中，槲皮素、山柰酚、木犀草素、黃芩素經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)也是目前抗擊新冠疫情“三藥三方”中連花清瘟膠囊、金花清感顆粒、清肺排毒湯等的核心化合物[17-19]?，F(xiàn)代研究表明，槲皮素可以與F 蛋白相互作用阻斷病毒的黏附，發(fā)揮抗人呼吸道合胞病毒的作用[20]；木犀草素可通過干擾外殼蛋白I 復(fù)合物的表達，降低甲型流感病毒的含量[21]；β-胡蘿卜素對腺病毒轉(zhuǎn)化的293 細胞和人類皰疹病毒轉(zhuǎn)化的 Raji 細胞的生長增殖具有明顯的抑制作用，對293 細胞內(nèi)整合的腺病毒早期基因的表達具有下調(diào)作用[22]?？梢?，實驗研究進一步證實了清開靈的活性成分具有一定的抗病毒作用。此外，山奈酚可以減輕脂多糖導(dǎo)致的小鼠急性肺損傷，其機制可能是通過抑制肺組織促炎因子NFκB、IL-1β、HO-1、PTGE、iNOS、TNF-α 和COX-2mRNA 的表達和促進抗炎因子HO-1mRNA 的表達而發(fā)揮保護作用[23]；槲皮素、木犀草素、β-胡蘿卜素也具有抗炎活性[24-25]。綜上可知，抗炎作用也是清開靈干預(yù)病毒性感冒的重要機制。

圖7 清開靈KEGG 富集分析（氣泡圖）

圖8 卡波濟肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路圖

圖9 乙型肝炎通路圖

根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果和“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)結(jié)果，清開靈干預(yù)病毒性感冒的主要作用靶點有前列腺素過氧化物合酶2（PTGS2）、前列腺素過氧化物合酶1（PTGS1）、絲氨酸蛋白酶1（PRSS1）、一氧化氮合酶（NOS2）、雌激素受體1（ESR1）、細胞因子（IL-6）和絲裂原活化蛋白激酶家族成員（MAPK8）等。GO 功能富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，清開靈活性成分主要涉及氧化應(yīng)激、細胞應(yīng)答、炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答等生物學(xué)過程；KEGG 通路富集主要涉及卡波濟肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染，乙型肝炎，人巨細胞病毒感染，流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化，糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE 信號通路等通路，靶點富集數(shù)目最多的通路為病毒感染相關(guān)通路，如卡波濟肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、乙型肝炎、人巨細胞病毒感染等，推測清開靈對病毒引起的感染具有一定的干預(yù)作用?，F(xiàn)代研究表明，金銀花中的綠原酸可以抑制流感病毒結(jié)構(gòu)蛋白神經(jīng)氨酸酶，從而阻斷子代病毒的釋放與傳播；板藍根中的橙黃胡椒酰胺酯可降低RNA 聚合酶活性，同時可抑制NF-κB 因子的轉(zhuǎn)錄水平；黃芩中的黃芩苷不僅可以抑制神經(jīng)氨酸酶還可抑制流感病毒RNA 聚合酶[26]。此外，以上通路均涉及炎癥基因，如COX-2、IL-1β、IL-6、IFN-γ 等，同時，TNF 信號通路與IL-17 信號通路在KEGG 富集分析中亦有較高的相關(guān)度：TNF 信號通路在抗病毒、介導(dǎo)能量代謝、炎癥反應(yīng)、血管生成以及維持干細胞特性等方面發(fā)揮重要作用，IL-17 信號通路與免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[10]。綜上所述，清開靈可能通過抗病毒、抗炎途徑起到干預(yù)病毒性感冒的作用。

圖10 清開靈主要成分與RELA 和JUN 分子對接模式

表2 清開靈核心成分與RELA 和JUN 的結(jié)合能

膽酸、豬去氧膽酸以及黃芩苷作為清開靈中的主要成分，JUN 與RELA 為PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵蛋白。分子對接結(jié)果顯示，這3 種活性成分與JUN 和RELA 均有一定的結(jié)合能力。受體內(nèi)代謝因素影響，如黃芩苷會代謝為黃芩素，膽酸、豬去氧膽酸亦會在體內(nèi)代謝為去氧膽酸和豬膽酸。以黃芩苷為例，從數(shù)據(jù)庫的靶點數(shù)目來看，黃芩苷的靶點數(shù)目不如黃芩素，筆者推測黃芩素多靶點的原因可能是其結(jié)構(gòu)上更易與靶點蛋白結(jié)合。而清開靈中應(yīng)用黃芩苷而不用黃芩素可能是因為黃芩苷不易產(chǎn)生消化道副作用、成本低或者與藥動學(xué)有關(guān)，但實際情況仍需后續(xù)探究。

急性病毒性感冒屬于中醫(yī)瘟疫的范疇，具有強烈的傳染性與流行性，如SARS 與COVID-19 均屬于瘟疫，治療上大多應(yīng)用清熱解毒藥。清開靈中金銀花、梔子、板藍根、水牛角、珍珠母均為寒涼之品，黃芩與豬膽汁在中醫(yī)學(xué)中亦屬寒涼，故筆者推測黃芩中提取出的黃芩苷與豬膽汁中提取出的膽酸和豬去氧膽酸亦屬寒涼，根據(jù)中醫(yī)理論推測其干預(yù)病毒性感冒具有一定作用。臨床研究數(shù)據(jù)顯示，清開靈聯(lián)合奧司他韋可以提高小兒咽部甲型流感病毒的清除率[27]，與兒童清肺口服液聯(lián)用可治療小兒呼吸道合胞病毒性肺炎[28]，聯(lián)合利巴韋林可治療流行性感冒[29]。綜上分析，清開靈用于病毒性感冒的治療可能與其抗病毒、抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)，進一步證實了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果的合理性。但近些年對清開靈注射液的安全性討論層出不窮，使得人們對該藥物望而卻步[30]；而且中醫(yī)學(xué)認為該藥苦寒?dāng)∥?，不能夠長期應(yīng)用，故此，在臨床上我們?nèi)孕璞孀C論治。