李昕竺曾先富 熊維全 張潤吉 辜運富 向泉桔

（1成都市農(nóng)林科學(xué)院，四川成都 611130；2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川成都 611130）

香菇（Lentinula edodes）又名香蕈、香菰、花菇、冬菇、香信等[1-2]，是全球第二大食用菌，同時也是我國栽培規(guī)模最大的食用菌之一，產(chǎn)量居世界前列。香菇因具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值，被廣泛用于抗癌、抗病毒、抗氧化、抗真菌、降血糖研究[3-4]。香菇多糖是從香菇菌絲體或子實體中提取純化得到的高分子葡聚糖，作為香菇主要的生物活性物質(zhì)，具有提高免疫力、降低膽固醇和抗病毒等多種生物活性[5-6]。因此，提高香菇多糖的含量具有較大的經(jīng)濟價值。

以收集到的國內(nèi)多個香菇品種及野生菌株為試驗材料，分別以高多糖含量和優(yōu)良農(nóng)藝性狀為指標(biāo)，篩選親本材料并進行雜交，最終獲得農(nóng)藝性狀優(yōu)良的高多糖含量香菇菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

（1）試驗香菇菌株

從國內(nèi)香菇生產(chǎn)單位和主要科研院所引進菌株61份，從四川省石棉縣、瀘定縣和冕寧縣等地采集野生香菇菌株26份，分別提取DNA，成功進行了ITS、ISSR序列擴增，通過ISSR聚類分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，排除同種異名菌株2個[7]。

（2）培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，加水1 000 mL。

栽培料配方：雜木屑78%，麩皮20%，白糖1%，石膏1%，料含水量60%。

（3）試驗其他材料

20 mm×200 mm玻璃試管，90 mm一次性培養(yǎng)皿，17 cm×33 cm透氣聚丙烯袋。

1.2 試驗方法

1.2.1 親本材料篩選

（1）出菇菌株子實體粗多糖測定：87份香菇菌株在同一地點，用相同配方培養(yǎng)料栽培出菇，采集頭潮菇子實體，采用苯酚-硫酸法測定子實體粗多糖[8]。

（2）雜交親本材料的確定：分析比較子實體粗多糖含量，選取子實體多糖含量較高的菌株與我國廣栽品種作為雜交育種的親本材料。

1.2.2 配對雜交

1.2.2.1 單核體制備

采集親本生長健壯、菌肉厚、形態(tài)完整的七分成熟子實體，于無菌條件下用孢子印法收集孢子[9]。取適量擔(dān)孢子放入無菌水中稀釋至105/mL，吸取50μL孢子懸浮液于PDA培養(yǎng)基平板上并涂布均勻，于22~25℃避光培養(yǎng)。將初萌發(fā)的星芒狀菌落鏡檢，無鎖狀聯(lián)合者為單核體。

1.2.2.2 交配型鑒定

將獲得的單核體與已知交配型的單核體（A1B1，A2B2，A1B2，A2B1）進行雜交配對，通過鏡檢觀察有無鎖狀聯(lián)合來確定其交配型。

1.2.2.3 雜交配對

將確定好交配型的兩個親本的單核體兩兩配對，在無菌條件下用滅菌的吸管切取直徑約0.8 cm的菌塊于PDA平板上培養(yǎng)，兩個菌塊間距3 cm，25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3~5 d。當(dāng)兩個能融合的單菌落中間形成突起的融合線時，在無菌環(huán)境下挑取融合處菌絲鏡檢，有鎖狀聯(lián)合系雙核菌絲體，挑取小塊菌絲體轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

圖1 交配型鑒定及配對雜交圖解

1.2.3 出菇試驗

1.2.3.1 小試初篩

采用17 cm×35 cm的聚丙烯袋，每個菌株3個重復(fù)，每個重復(fù)20袋。每袋裝料（1 000±50）g，108~110℃蒸汽滅菌5 h。接種后置于（24±2）℃，空氣相對濕度為70%的培養(yǎng)室層架上暗培養(yǎng)。當(dāng)菌絲長滿袋并出現(xiàn)不規(guī)則隆起時，將菌袋轉(zhuǎn)移至室外大棚，刺孔，每袋約刺30個孔，并適當(dāng)按壓使料袋與料分離（使袋內(nèi)培養(yǎng)基與空氣充分接觸）。白天保持溫度在23℃左右，增加大棚內(nèi)散射光，加強通風(fēng)，創(chuàng)造干濕交替環(huán)境，進行溫差、干濕差刺激，促進菌筒表面氣生菌絲倒伏，分泌色素，形成一層紅棕色有光澤的菌膜。轉(zhuǎn)色完成后，脫袋出菇。以菇形較好、出菇密集或較為密集的菌株為優(yōu)良菌株，采集其頭潮菇子實體與親本（對照）同時送樣至專業(yè)檢測機構(gòu)檢測粗多糖含量，初篩多糖含量高的菌株。

1.2.3.2 小試復(fù)篩

對初篩獲得的高多糖含量菌株按照1.2.3.1的方法進行復(fù)篩，親本做對照。每菌株100袋，3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本材料篩選

栽培的87份香菇菌株，有62份菌株長出子實體。62份菌株頭潮菇子實體粗多糖含量見表1。由表1可以看出，子實體粗多糖含量較高的5個菌株分別為4號（廣香2044）、29號、23號、87號、1號，而51號（新808）為我國栽培面積大、溫型范圍較寬、子實體農(nóng)藝性狀和商品性狀好的菌株。為此，選定子實體粗多糖含量高的4號、51號菌株為雜交的親本材料。

表1 出菇菌株子實體多糖含量比較

2.2 配對雜交結(jié)果

親本新808獲得166個單核體，廣香2044獲得50個單核體，通過雜交配對獲得雜合子534株。

2.3 出菇試驗

2.3.1 小試初篩結(jié)果

534個雜合子中共有14個菌株出菇密集度、子實體形態(tài)等農(nóng)藝性狀表現(xiàn)較好。由表2可見，雜合子菌蓋直徑大于兩親本菌株的有XG3、XG82、XG85、XG138、XG177、XG206、XG212、XG215、XG253，其中菌蓋直徑大于5 cm的菌株有XG3、XG82、XG138、XG212、XG253；菌蓋厚度大于1 cm的 菌 株 有XG3、XG85、XG140、XG212、XG215、XG253，其中大于親本菌株的有XG3、XG212、XG253；菌柄長度介于親本之間的有XG3、XG85、XG212，菌柄直徑介于兩個親本之間的有XG3、XG85、XG253，大 于 親 本 的 有XG138、XG212、XG215；14個雜合子菌株每袋子實體平均產(chǎn)量高于親本的有XG3、XG212、XG215。

圖1 雜交菌絲生長狀態(tài)

圖2 親本及14個初篩優(yōu)勢菌株子實體

表2 14個初篩優(yōu)勢菌株子實體農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量比較（P＜0.05）

綜合子實體農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量，確定優(yōu)勢菌株為XG3、XG212、XG215。

由表3可知，14個雜合子菌株子實體粗多糖含量介于兩個親本之間，其中，XG212菌株子實體粗多糖含量超過親本（新808）35.8%，XG3菌株粗多糖含量超過親本（新808）30.5%。

綜合考慮子實體農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量和粗多糖含量，確定XG212、XG3菌株為香菇高多糖含量優(yōu)勢菌株。

表3 14個初篩優(yōu)勢菌株子實體粗多糖含量比較

2.3.2 小試復(fù)篩結(jié)果

由表4可見，XG212、XG3優(yōu)勢菌株出菇性狀特征與初篩時表現(xiàn)基本一致。

表4 高多糖含量雜合子菌株與親本子實體形態(tài)特征及產(chǎn)量比較（P＜0.05）

3 小結(jié)

試驗初步篩選出2個多糖含量高，子實體農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量表現(xiàn)都較優(yōu)的菌株。受培養(yǎng)料配方、栽培環(huán)境、管理條件、檢測方法等的影響，多糖含量會有所變化，因此，還需要進一步的試驗來穩(wěn)定優(yōu)勢菌株的品性。