曹海鵬，文小飛，徐興娜，辛健康

（貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550001）

養(yǎng)殖業(yè)中，大腸桿菌常引起仔豬發(fā)生腸道傳染性疾病，如仔豬黃痢、白痢和水腫病等，是造成豬腹瀉、死亡的重要細(xì)菌性因素[1]。目前，治療和預(yù)防豬細(xì)菌性疾病的常規(guī)措施依然是投喂抗生素，其作為飼料添加劑曾為規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展作出了巨大貢獻(xiàn)。但由于抗生素的長期不合理使用，導(dǎo)致了一系列問題，如肉制品抗生素殘留超標(biāo)，嚴(yán)重危害人類及其他動(dòng)物健康；致腸道菌群失調(diào)及產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性等，使動(dòng)物機(jī)體免疫力下降，易引發(fā)內(nèi)源性感染和一系列的公共安全問題[2]。因此，歐盟已于2006年全面禁止在飼料中添加抗生素，隨后日本和美國也在飼用抗生素種類及使用方面做了嚴(yán)格限制[3]。

乳酸菌是食品級(jí)益生菌，具有抑制病原菌生長、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、激活腸道黏膜免疫及佐劑效應(yīng)等多種生理功能，在預(yù)防及治療細(xì)菌性疾病方面具有一定優(yōu)勢，是養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的理想替代品[4,5]。研究表明，乳酸菌可以有效增加母豬采食量，降低哺乳期母豬失重幅度及仔豬因感染細(xì)菌性疾病導(dǎo)致的腹瀉率與死亡率[6,7]；可以改善動(dòng)物健康水平，提高仔豬機(jī)體免疫力和飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)仔豬生長，預(yù)防仔豬腹瀉[8]；可以在仔豬腸道定植，促進(jìn)仔豬生長發(fā)育，抵抗產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的感染，降低仔豬的發(fā)病率和死亡率[9]。由于乳酸菌及其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的特殊性，不會(huì)造成大腸桿菌等致病菌對其產(chǎn)生耐藥性或抵抗力，在預(yù)防和治療多重耐藥病原菌感染方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值[10,11]。

實(shí)驗(yàn)室前期從健康豬的腸道黏膜中分離出一株對大腸桿菌具有強(qiáng)抑制作用的植物乳桿菌R-21，具有一定的研究和應(yīng)用價(jià)值[12]。為促進(jìn)其在生產(chǎn)中的應(yīng)用，本研究擬從菌株發(fā)酵液對大腸桿菌的抑制特性、乳酸菌與大腸桿菌的體外共培養(yǎng)及乳酸菌的抑菌穩(wěn)定性等方面，繼續(xù)研究植物乳桿菌R-21對大腸桿菌的抑菌特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 植物乳桿菌R-21，本實(shí)驗(yàn)室自行分離并保藏[12]；大腸埃希氏菌ATCC25922，購于上海魯微科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母膏10 g，牛肉膏10 g，吐溫80 1.0 ml，葡萄糖20.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，七水硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水 1 000 ml，pH 6.2～6.6，121℃高壓滅菌20 min。固體MRS在此基礎(chǔ)上添加1.5%瓊脂粉[9]。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，氯化鈉10.0 g，水1 000 ml，121℃高壓滅菌20 min。固體LB在此基礎(chǔ)上添加1.5%瓊脂粉[9]。

伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基（EMB），購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.3 試劑 主要化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JA1003 電子天平：力辰科技有限公司；DH6000B電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；XMTA-7000智能恒溫干燥箱：上海景邁儀器設(shè)備有限公司；THZ-82A雙數(shù)顯旋轉(zhuǎn)氣浴振蕩器：金壇市城東新瑞儀器廠；SW-CJ-1G單人凈化工作臺(tái)：上海蘇凈凈化工作臺(tái)；FE20 pH計(jì)：深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司；HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化 取冰箱冷藏的植物乳桿菌R-21和大腸埃希氏菌ATCC25922斜面種子，分別以平板劃線方式接種于固體MRS和LB培養(yǎng)基中，37℃活化培養(yǎng)36 h，取單菌落轉(zhuǎn)接于相應(yīng)斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 不同培養(yǎng)時(shí)間的抑菌活性 取1.3.1活化的植物乳桿菌R-21和大腸埃希氏菌ATCC25922斜面種子，分別轉(zhuǎn)接于10 ml MRS和10 ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150 rpm振蕩培養(yǎng)24 h。各取1%種子液接種于200 ml相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，其中ATCC25922培養(yǎng)約12 h，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?；植物乳桿菌R-21培養(yǎng)48 h，其間每隔4 h取樣5 ml，離心取上清液，檢測其pH，并各取200 μl進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。抑菌試驗(yàn)為牛津杯法，具體如下：取稀釋100倍大腸桿菌ATCC25922菌液，均勻涂布于LB平板中，每皿等距離放入兩只6 mm內(nèi)徑的牛津杯，杯中加入200 μl的乳酸菌上清液，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，并采用游標(biāo)卡尺測量各時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑，每樣3個(gè)平行[13]。

1.3.3 發(fā)酵上清液對大腸桿菌的抑制效果 取培養(yǎng)48 h的乳酸菌發(fā)酵上清液，微孔濾膜過濾后加在等體積、離心處理的大腸桿菌沉淀樣品中，置于室溫，懸浮后取處理0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h的指示菌菌液各1 ml，梯度稀釋后取200 μl稀釋液涂布于LB平板中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)殘留活菌數(shù)（colony-forming units,CFU），計(jì)算各處理時(shí)間點(diǎn)的存活率。

1.3.4 植物乳桿菌R-21與大腸桿菌的體外共培養(yǎng)試驗(yàn) 將制備的植物乳桿菌R-21與大腸桿菌ATCC25922菌液分別用無菌水稀釋至約1.0×108CFU/ml，各取2%體積接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃、150 rpm震蕩培養(yǎng)。取0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h的菌液各5 ml，檢測pH后再梯度稀釋取200 μl稀釋液均勻涂布于EMB平板中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)殘留大腸桿菌活菌數(shù)，計(jì)算各處理時(shí)間點(diǎn)的存活率。

1.3.5 植物乳桿菌R-21的抑菌穩(wěn)定性試驗(yàn) 取植物乳桿菌R-21的種子液，以1%比例接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃、150 rpm培養(yǎng)24 h；再取1%比例接種于MRS液體培養(yǎng)基中，重復(fù)培養(yǎng)10次，每次取5 ml菌液離心，取上清液并保存-20℃?zhèn)溆?。連續(xù)培養(yǎng)結(jié)束后，取收獲的上清液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，每組3個(gè)平行，統(tǒng)計(jì)抑菌直徑，并評(píng)價(jià)其抑菌穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間的抑菌活性

植物乳桿菌R-21培養(yǎng)48 h，其發(fā)酵過程發(fā)酵上清液中的pH及對大腸埃希氏菌ATCC25922的抑菌直徑變化如圖1所示。pH隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸下降，由0 h的5.4降至40 h的3.0，并保持穩(wěn)定；抑菌直徑從0 h的6.7 mm增至24 h的22 mm左右，并保持基本穩(wěn)定。與繆璐歡等（2015）[14]、杜靜芳等（2017）[15]所分離的乳酸菌相比，總體變化規(guī)律一致，但產(chǎn)酸較緩慢，最終pH較低，說明其產(chǎn)酸持續(xù)時(shí)間長且數(shù)量多；抑菌活性同樣是緩而強(qiáng)勁，最終抑菌直徑大于乳酸菌LY-19和LY-21對大腸桿菌O157:H7的抑菌直徑。從圖中還可得知，抑菌直徑的增加與pH下降呈正相關(guān)，說明發(fā)酵上清液中主要抑菌物質(zhì)可能為有機(jī)酸。0 h時(shí)的pH與培養(yǎng)基的初始pH不一致，且抑菌直徑不是牛津杯直徑（6 mm），這是種子液加入造成的，因?yàn)榉N子呈酸性，且含有少量的抑菌物質(zhì)。

圖1 發(fā)酵液pH及抑菌直徑隨培養(yǎng)時(shí)間的變化

2.2 發(fā)酵上清液對大腸桿菌的抑制效果

取乳酸菌發(fā)酵上清液室溫處理0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h的指示菌菌液，梯度稀釋后取200 μl稀釋液涂布于LB平板中，培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)殘留活菌數(shù)對數(shù)值，結(jié)果如圖2所示。上清液處理2 h，大腸埃希氏菌ATCC25922的殘留對數(shù)值下降0.93 log，3 h時(shí)迅速降至5.26，至6 h時(shí)上清液中檢測不到活菌，抑菌效果大大優(yōu)于Koo等（2015）所分離菌株對大腸桿菌的抑制和殺滅效果[16]。表明乳酸菌R-21發(fā)酵上清液對大腸埃希氏菌ATCC25922具有極強(qiáng)的抑菌能力，能夠在短時(shí)間內(nèi)殺死被處理的指示菌，在預(yù)防和治療大腸桿菌性疾病方面具有一定的研究和應(yīng)用價(jià)值。

圖2 經(jīng)乳酸菌發(fā)酵上清液處理的大腸桿菌殘留對數(shù)值

2.3 植物乳桿菌R-21與大腸桿菌的體外共培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

將植物乳桿菌R-21與大腸桿菌ATCC25922菌液分別稀釋至1.0×108CFU/ml，各取2%體積接種于MRS液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)。取0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h的菌液，檢測pH，梯度稀釋取200 μl均勻涂布于EMB平板中，靜置培養(yǎng)24 h，并統(tǒng)計(jì)殘留大腸桿菌活菌數(shù)（CFU/ml），結(jié)果如圖3所示。共培養(yǎng)菌液pH隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸下降，至16 h下降至3.4左右，接近植物乳桿菌R-21單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的菌液pH，說明其R-21菌株產(chǎn)酸能力強(qiáng)，產(chǎn)酸雖緩慢，但總體基本不受共培養(yǎng)時(shí)大腸桿菌生長的影響；大腸桿菌殘留活菌數(shù)log值開始時(shí)隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸增加，4～6 h達(dá)到平衡，而后開始迅速下降，至16 h時(shí)EMB培養(yǎng)基中檢測不到存活大腸桿菌。這一研究結(jié)果與Koo等（2015）研究結(jié)果差異極大，其所分離的菌株主要抑菌物質(zhì)是有機(jī)酸，且抑菌直徑較小，對指示菌只起到抑制作用而非殺菌[16]。本研究中，殘留指示菌的數(shù)量迅速減少，說明R-21菌株所產(chǎn)抑菌物質(zhì)能直接殺死被處理的指示菌。

圖3 植物乳桿菌R-21與指示菌的體外共培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

2.4 植物乳桿菌R-21的抑菌穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

取植物乳桿菌R-21的種子液，以1%比例接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃、150 rpm培養(yǎng)條件下，連續(xù)傳代培養(yǎng)10次，取每次培養(yǎng)的上清液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，驗(yàn)證傳代多次之后的抑菌穩(wěn)定性，結(jié)果如圖4所示。連續(xù)傳代培養(yǎng)10次中，每次培養(yǎng)24 h，只有第5次乳酸菌上清液的抑菌直徑小于20 mm（約19.6 mm），其余9次抑菌直徑為20～24 mm，且沒有明顯的下降趨勢，說明R-21菌株具有相對的抑菌穩(wěn)定性，有利于菌種的長期保存和工業(yè)生產(chǎn)。

圖4 植物乳桿菌R-21的傳代抑菌穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

通過研究分離菌株植物乳桿菌R-21對指示菌ATCC25922的抑菌特性，發(fā)現(xiàn)菌株R-21發(fā)酵上清液對指示菌有較強(qiáng)的抑制作用，且抑制作用與發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸性物質(zhì)有關(guān)；乳酸菌上清液及與指示菌共培養(yǎng)時(shí)，對指示菌具有殺滅作用，抑菌活性強(qiáng)；菌株R-21產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，培養(yǎng)48 h發(fā)酵液pH低至3.0左右；連續(xù)傳代培養(yǎng)中，上清液對指示菌的抑菌直徑基本維持在20～24 mm，具有一定的遺傳穩(wěn)定性，說明R-21菌株適合于工業(yè)生產(chǎn)及保存。