余勤陽，鄒如意，2，何 瑤，孟慧君，張冰雪，丁孟莎，周睿涵，孫 偉*

（1.海南師范大學 化學與化工學院，?？谑泄δ懿牧吓c光電化學重點實驗室，海南 ?？?571158；2.上饒師范學院 化學與環(huán)境科學學院，江西 上饒 334001）

亞硝酸鹽對水資源的污染最終會影響到人的健康，而且這種威脅也不斷加劇。世界衛(wèi)生組織確定飲用水中亞硝酸鹽的最高限量為3mg/L[1]，因此，對亞硝酸鹽的監(jiān)測與控制對于環(huán)境和食品工業(yè)具有重要意義。亞硝酸鹽的檢測方法有色譜法和毛細管電泳等方法，所涉及的設(shè)備昂貴，檢測程序繁瑣，而電化學檢測方法因簡單、可靠、便攜的特點而受到重視。

碳質(zhì)材料導電性能好、化學性能穩(wěn)定，其中石墨烯材料具有獨特的二維層狀結(jié)構(gòu)，更適宜其他低維度納米材料的附著和生長，以適應構(gòu)建各種傳感器的需求。TiO2在顏料、吸附劑、催化劑載體、濾光劑、涂料、光導體和介電材料等方面有著廣泛的應用[2]。TiO2/石墨烯復合物因其優(yōu)異的電化學性能引起廣泛關(guān)注，如Nagaraju等報道原位微波輻射合成的TiO2/石墨烯納米在超級電容器上的應用[3]；Zhang等報道Pt/TiO2/石墨烯/聚乙烯片在電降解偶氮染料的應用[4]；Wang等利用十二烷基硫酸鈉協(xié)助下自組裝雜交合成的TiO2/石墨烯鋰離子電池負極[5]。

血紅蛋白（Hb）是紅細胞的主要組成部分，含氧血紅蛋白可將NO轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，而脫氧血紅蛋白又可作為一種亞硝酸鹽還原酶催化亞硝酸鹽還原為NO[6]。本研究將牛血紅蛋白（Hb）固定于自制的TiO2-石墨烯復合材料表面，設(shè)計了一種用于檢測亞硝酸鹽的電化學傳感器，并采用循環(huán)伏安法（CV）和電化學阻抗譜（EIS）對該傳感器的性能進行了研究。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

1.1.1 試劑

Hb（MW 64500，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；離子液體（HPPF6，蘭州雨陸精細化工公司，＞99 wt%）；石墨粉（上海膠體化工有限公司，＞99.85wt%）；氧化石墨烯（中國科學院山西煤炭化學研究所，8mg/mL）；Ti2（SO4）3溶液（天津市光復精細化工研究所，15～20wt%）；NaNO2（上海阿拉丁試劑有限公司，AR）；Nafion乙醇溶液（北京鴻海天科技有限公司，5wt%）；0.1mol/L磷酸鹽系列緩沖溶液（PBS）為支持電解質(zhì)。

1.1.2 儀器

CHI 660D型電化學工作站，上海辰華儀器公司；JSM-7100F型掃描電子顯微鏡，日本電子公司；Nicolet 6700型FT-IR紅外光譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；TU-1901型雙光束UV-Vis分光光度計，北京普析通用儀器責任有限公司；Milli-Q IQ-7000超純水系統(tǒng)，德國達姆施塔特默克公司。

1.2制備

1.2.1 材料制備

將10mL氧化石墨烯與40mL超純水混合，在180℃下水熱反應10 h，冷卻后再加入5mL Ti2（SO4）3溶液，140℃下再次水熱反應5 h，冷卻后得到黑色柱體，冷凍干燥后即得到了具有三維結(jié)構(gòu)的還原氧化石墨烯（RGO）和納米TiO2的復合材料，記作TiO2-RGO。

1.2.2 電極制備

參照文獻[7]將1.6 g石墨粉與0.8 g HPPF6混合并研磨成糊狀物，填入玻璃管內(nèi)壓實并插入銅絲作為導線，即得到離子液體碳糊電極（CILE）。將CILE拋光后采用滴涂法依次將6μL 0.5mg/mL的TiO2-RGO分散液、6μL 15.0mg/mLHb水溶液和8μL 0.5wt%Nafion乙醇溶液涂覆在CILE表面，每次滴涂后自然干燥，最后得到修飾電極Nafion/Hb/TiO2-RGO/CILE，同法制備對照電極Nafion/Hb/CILE和Nafion/TiO2-RGO/CILE。

1.3實驗方法

用UV-Vis光譜和FT-IR光譜分析Hb的結(jié)構(gòu)性狀，其直接電化學用循環(huán)伏安（CV）法進行研究。電化學測試用三電極體系在電化學工作站上進行，分別以Nafion/Hb/TiO2-RGO/CILE、Nafion/Hb/CILE、Nafion/TiO2-RGO/CILE和Nafion/CILE為工作電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極，鉑絲電極為輔助電極。系列磷酸鹽緩沖溶液（0.1mol/LPBS）為支持電解質(zhì)，實驗前需通N2氣25min去除氧氣。CV測試的電壓范圍-0.8～0.2 V，掃速范圍50～1000mV/s。交流阻抗（EIS）測試在含有0.1mol/LKCl的10.0mmol/L[Fe（CN）6]3-/4-水溶液中進行，頻率范圍為10-2～105Hz。

2結(jié)果與討論

2.1 光譜學分析

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)決定了它們的光譜學特征，Hb中卟啉的構(gòu)象發(fā)生變化必然引起紫外可見區(qū)Soret帶的位移[8]。圖1（A）顯示了Hb（曲線a）和Hb/TiO2-RGO復合物（曲線b）在pH 1.0 PBS中的UV-Vis光譜，它們的Soret吸收帶都出現(xiàn)在409 nm附近[9]，表明Hb/TiO2-RGO中Hb的生物結(jié)構(gòu)未變。FT-IR進一步分析了Hb多肽鏈的結(jié)構(gòu)，純Hb的酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ共振帶出現(xiàn)在1660 cm-1和1549 cm-1處（曲線a）[10]，如圖1（B）所示。Hb與TiO2-RGO混合后的酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ共振帶（曲線b）與純Hb的保持一致，即Hb在混合體系中未發(fā)生變性，證明TiO2-RGO具有良好的生物相容性。

圖1 Hb(a)和Hb/TiO2-RGO復合物(b)的紫外可見光譜圖(A)和紅外光譜圖(B)Figure1 UV-Vis spectra(A)and FT-IR spectra(B)ofHb(a)and Hb/TiO2-RGO m ixture(b)

2.2 掃描電鏡和能量色散X射線譜分析

SEM研究了TiO2-RGO復合材料的形貌特征。圖2（A）、（B）、（D）顯示了TiO2-RGO復合物由少層石墨烯卷曲成三維多孔結(jié)構(gòu)且顆粒狀的TiO2分散在納米片的表面。圖2（C）顯示了TiO2-RGO復合物的能量色散X射線譜（EDS）圖，表明復合物中具C、O、Ti和S等元素，其中Ti和O的摩爾比與TiO2的化學計量比不對應，可能是因為復合物中除TiO2外還有硫及其它雜元素的氧化物存在，EDS分析估算復合物中TiO2的質(zhì)量比約占27.30%。組分元素的EDS映射結(jié)果如圖2（E）—2（G）所示，其中綠色、紅色和藍色區(qū)域分別對應碳、氧和鈦元素，可見還原石墨烯和二氧化鈦在TiO2-RGO復合物中分布均勻。

圖2 TiO2-RGO復合物不同放大分辨率的SEM圖（A、B、D），能量色散光譜（EDS）)（C）和用于TiO2-RGO復合材料中各元素映射的SEM圖（E：碳，F(xiàn)：氧，G：鈦）Figure 2 SEM images atdifferentmagnification resolutions(A，B，D)，EDS(C)and corresponding SEM image for elementalm apping of TiO2-RGO com posite（E：carbon，F(xiàn):oxygen，G:titanium）

2.3 電化學交流阻抗譜分析

圖3（A）顯示了不同修飾電極在含5.0mM[Fe（CN）6]3-/4-的電解液中的Nyquist曲線。Nyquist曲線高頻區(qū)的半圓直徑反映修飾電極對氧化還原探針的電子傳遞阻抗（Rct）大小。其中Nafion/CILE的Nyquist曲線a半圓直徑對應的Rct值為50.7Ω，曲線b顯示Nafion/TiO2-RGO/CILE的Rct值為34.0Ω，小于Nafion/CILE的Rct值，說明TiO2-RGO復合物減小了Rct值，這得益于RGO的大表面積和高導電性[11]。曲線c顯示Nafion/Hb/CILE的Rct為232.8Ω，說明Hb分子阻礙電極表面的電荷轉(zhuǎn)移[12]。曲線d顯示Nafion/Hb/TiO2-RGO/CILE的Rct為157.2Ω，比Nafion/Hb/CILE的Rct值有所降低，這是綜合了Hb和TiO2-RGO對電荷轉(zhuǎn)移效率的影響。

2.4 Hb的直接電化學行為

用循環(huán)伏安法（CV）研究了不同電極在0.1mol/L pH 1.0 PBS中的電化學行為。如圖3（B）所示，Nafion/CILE和Nafion/TiO2-RGO/CILE的CV掃描（曲線a和b）上都沒有氧化還原峰，但由于TiO2-RGO具有高導電率，致使Nafion/TiO2-RGO/CILE表現(xiàn)出大的電容電流。Nafion/Hb/CILE和Nafion/Hb/TiO2-RGO/CILE的CV掃描（曲線c和d）各有一對準可逆的氧化還原峰，這是Hb中血紅素的特征峰。相比于曲線d，曲線c上的氧化還原峰電流較小，并且曲線d的氧化還原峰電流之比更接近于1，說明TiO2-RGO的存在促進了電化學活性中心的電子轉(zhuǎn)移，還增強了可逆性。曲線d的氧化峰電位（Epa）和還原峰電位（Epa）分別為-0.118 V和-0.187 V（vs.SCE），峰電位差（△Ep）為69mV，根據(jù)公式Eo'=（Epc+Epa）/2[13]可計算得到式電位（Eo'）為-0.153 V（vs.SCE）。

圖3 不同電極在10.0mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-和0.1mol/LKCl混合溶液中，頻率為10-2～105Hz時的Nyquist曲線（A）；在pH 1.0的PBS中掃速為100m V/s時的循環(huán)伏安曲線（B）Figure 3 Nyquist curves of differentelectrodes w ith frequency from 10-2～105 Hz in a 10.0mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-and 0.1mol/LKClsolution(A)，cyclic voltammograms in pH 1.0 PBS at100m V/s(B)

2.5 pH的影響

圖4顯示了不同pH的PBS對Nafion/Hb/TiO2-RGO/CILE電化學行為的影響。隨著pH值的增大，Hb的氧化還原峰電位逐漸負移，pH值與式電位（Eo'）呈良好的線性關(guān)系：Eo'（V）=-0.154－0.019 pH（γ=0.98）。在pH為1.0時有最大峰電流，即反應最佳pH為1.0。

圖4 Nafion/Hb/TiO2-RGO/CILE在不同pH環(huán)境下的循環(huán)伏安曲線(a至f，pH：1、2、3、4、6和7)Figure4 Effectof pH on electrochem ical response of Nafion/Hb/TiO2-RGO/CILE atscan rate of 100m V/s(from a to f，pH:1，2，3，4，6 and 7)

2.6 掃速的影響

掃速對Nafion/Hb/TiO2-RGO/CILE的電化學響應如圖5（A）所示，在50～1000mV/s掃速范圍內(nèi)的CV曲線都有一對峰形良好的氧化還原峰。且峰電流隨掃速的增加而增大，陽極峰電位(Epa)和陰極峰電位(Epc)分別發(fā)生正移和負移，Eo'穩(wěn)定。圖5（B）顯示了峰電流(Ip)與掃速(υ)間良好線性關(guān)系，線性回歸方程為Ipc（μA）=421.55υ（V/s）+24.55（n=20，γ=0.999）和Ipa（μA）=-383.95υ（V/s）-15.34（n=20，γ=0.998）。由方程Q=nAFГ*[14]可計算求得具有電活性的Hb在電極表面覆蓋度（Г*）為1.37×10-9mol/cm2，占Hb理論總量（1.11×10-8mol/cm2)的12.34%。圖5（C）顯示在高掃速區(qū)域氧化還原峰電位與lnυ的線性關(guān)系：Epc(V)=-0.043 21 lnυ（V/s）-0.264 74（n=10，γ=0.992 27）和Epa（V）=0.035 36 lnυ（V/s）-0.110 96（n=10，γ=0.994 42）。根據(jù)Laviron理論[15]計算出電子傳遞數(shù)（n）、電荷傳遞系數(shù)(α)和表觀異質(zhì)電子傳遞速率常數(shù)（ks）等參數(shù)分別為1.21、0.51和1.43 s-1，其中ks值大于部分文獻所報道的CTS/ELDH-GR-Hb/CILE(1.202 s-1)[16]、GOx-GQD/CCE（1.12 s-1）[17]、Nafion/HRP/AuNTs/CILE（1.01 s-1）[18]、NF-Hb-AgNPs-CS-SPCE（0.47 s-1）[19]、3DGA-AuNPs/Cyt c/GCE（0.56 s-1）[20]等電極的ks值，說明所制備的TiO2-RGO復合物能有效促進Hb的反應速率。

圖5 PBS的pH為1.0時，不同掃描速率對Nafion/Hb/TiO2-RGO/CILE氧化還原反應的影響(從a到t：50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000m V/s)(A)；I pc、I pa與υ的線性關(guān)系(B)；E pc、E pa與lnυ的線性關(guān)系(C)Figure 5 Influence of scan rate on redox reaction ofNafion/Hb/TiO2-RGO/CILE in pH 1.0 PBS(from a to tas 50，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，1000 m V/s)(A);The linear relationship of I pc and I pa vs.υ(B)，the linear relationship of E pc and E pa vs.lnυ(C)

2.7 Nafion/Hb/TiO2-RGO/CILE對NO2-的電化學催化

進一步利用Nafion/Hb/TiO2-RGO/CILE研究了對NaNO2的電催化還原。如圖6（A）顯示了NaNO2在1.0～20.0mmol/L濃度范圍內(nèi)的電化學響應，隨著NaNO2濃度的增加，還原峰出現(xiàn)在-0.561 V并發(fā)生負移至-0.672 V。其峰電流值與NaNO2濃度在1.0～6.0mmol/L、7.0～14.0mmol/L和14.0～20.0mmol/L三個區(qū)間內(nèi)成線性關(guān)系，如圖6（B）所示，線性回歸方程分別為：Iss1（μA）=61.94C（mmol/L）+101.27（n=6，γ=0.988）、Iss2（μA）=40.08C（mmol/L）+233.53（n=8，γ=0.999）、Iss3（μA）=7.57C（mmol/L）+692.35（n=7，γ=0.994），檢出限為0.38mmol/L（3σ）。

圖6 Nafion/Hb/TiO2-RGO/CILE在不同濃度的NaNO2(a至t為：1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0和20，0mmol/L)pH 1.0的PBS中掃速為100m V/s時的循環(huán)伏安圖(A)；峰電流值與NaNO2濃度的線性關(guān)系(B)Figure 6 Cyclic voltamm ogram s of Nafion/Hb/TiO2-RGO/CILE w ith NaNO2(from a to tas 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，13.0，14.0，15.0，16.0，17.0，18.0，19.0 and 20.0mmol/L)in pH 1.0 PBS at the scan rate of100m V/s(A)，the linear relationship between peak currents and NaNO2 concentration(B)

2.8 穩(wěn)定性與重現(xiàn)性

4支Nafion/Hb/TiO2-RGO/CILE電極對10mL不同濃度的NaNO2溶液進行平行加標檢測，在10mmol/L加標條件下，各電極回收率分別為103.5%、98.7%、96.3%和100.6%，相對標準偏差分別為6.63%、7.00%、5.93%和2.77%（n=4），表明具有良好的重現(xiàn)性。將該組修飾電極放置在4℃冰箱中保存兩周后再進行循環(huán)伏安表征，發(fā)現(xiàn)峰電流值幾乎不變，說明電極的穩(wěn)定性好。

3 結(jié)論

本研究合成了三維多孔結(jié)構(gòu)的TiO2-RGO復合材料，經(jīng)SEM、EDS分析表明TiO2均勻分布于合成的多孔石墨烯中。紫外可見光譜和紅外光譜表征結(jié)果表明TiO2-RGO復合物固定支持的Hb保持了其天然的結(jié)構(gòu)和生物活性。電化學實驗表明該傳感器對亞硝酸鹽的還原具有良好的電催化活性，伏安法檢測NaNO2的線性濃度范圍寬，靈敏度高，說明TiO2-RGO有效地加快了Hb電活性中心與電極之間的電子轉(zhuǎn)移速率。