周 煒，郭炫君，2，王武強，陳 勇，羅成江，沈紅霞，張航俊，侯 軒，張曉麗，王 彬，孫冰冰

(1. 浙江省動物疫病預(yù)防控制中心，杭州 311119；2. 鈦和(杭州)醫(yī)藥技術(shù)服務(wù)有限公司，杭州 311121；3. 麗水市縉云縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江麗水 321400)

長期以來，生豬養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的糞污因資源化利用率低，難以得到合理妥善處置而造成的環(huán)境污染事件時有發(fā)生，制約著生豬養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；l(fā)展。近年來，生豬糞污異位發(fā)酵床處理技術(shù)，一種基于種植業(yè)桔桿粉末為載體的微生物持續(xù)發(fā)酵處理技術(shù)，正逐步被規(guī)?；i養(yǎng)殖場應(yīng)用于生豬糞污處理。生豬糞污經(jīng)動態(tài)的噴淋、翻刨、發(fā)酵后，臭氣得到了有效控制，且熟化后的墊料可作為種植業(yè)和林業(yè)的有機肥料。在非洲豬瘟疫情防控形勢依然嚴(yán)峻的當(dāng)下，由于實現(xiàn)了與養(yǎng)殖核心區(qū)的分離，能滿足生物防護(hù)要求、易于維護(hù)的異位發(fā)酵床迅速取代了直接與生豬接觸的同位發(fā)酵床技術(shù)。2018年10月，全國畜牧總站為推廣這一技術(shù)，舉辦了異位發(fā)酵床處理豬場糞污技術(shù)集成示范現(xiàn)場觀摩活動。生豬養(yǎng)殖過程中使用的抗菌藥物，多以原型、代謝產(chǎn)物等形式經(jīng)糞、尿排出體外[1]。在異位發(fā)酵過程中，這些藥物/代謝產(chǎn)物經(jīng)糞污噴淋不斷在墊料中蓄積。隨著發(fā)酵堆積時間的延長，其量超出可接受的范圍后，可能對消納地中正常土壤菌群的生存環(huán)境、耐藥基因水平傳播產(chǎn)生不利影響[2-3]。然而，發(fā)酵堆積時間過短，墊料中蓄積的有機質(zhì)過少，不能滿足肥力要求。2020年6月，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳、生態(tài)環(huán)境部辦公廳聯(lián)合印發(fā)《關(guān)于促進(jìn)畜禽糞污還田利用依法加強養(yǎng)殖污染治理的指導(dǎo)意見》，鼓勵畜禽糞污資源化利用先進(jìn)工藝、技術(shù)和裝備研發(fā)，保障生豬產(chǎn)品有效供給的同時保障環(huán)境安全。既要實現(xiàn)養(yǎng)殖場糞污的高效、低成本處理，又要保障消納地環(huán)境安全以及種植業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量安全，異位發(fā)酵床墊料中抗菌藥物殘留檢測技術(shù)和墊料安全性評估，就成為亟待解決的問題。目前，關(guān)于異位發(fā)酵床的研究仍主要集中于發(fā)酵、維護(hù)、除臭等方面，關(guān)于墊料中抗菌藥物殘留檢測技術(shù)和墊料安全性評估的研究尚未見報道。本研究擬基于LC-MS/MS平臺，開發(fā)墊料中抗菌藥物殘留檢測技術(shù)，并對墊料中抗菌藥物的分布和蓄積趨勢進(jìn)行研究，從而為異位發(fā)酵床墊料的合理、安全利用提供可靠的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器 液質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫 1290 N液相系統(tǒng)及AB 5500 Qtrap質(zhì)譜系統(tǒng))；MM 400球磨儀(德國Retsch公司)；V20 水分測定儀和電子天平(梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司)；低溫高速離心機(Sigma公司)。

1.2 試劑 乙腈與甲醇(色譜純，德國默克公司)；甲酸(色譜純，ROE科學(xué)有限公司)；Na2EDTA、磷酸氫二鈉、檸檬酸和氫氧化鈉(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；濃氨水和乙酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；PRIME HLB固相萃取柱(Waters公司)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液 4種四環(huán)素類抗菌藥混標(biāo)(四環(huán)素、金霉素、土霉素和強力霉素，濃度為1 mg/mL，介質(zhì)為甲醇)、22種磺胺類抗菌藥混標(biāo)(磺胺醋酰、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲異噁唑、磺胺氯噠嗪、磺胺嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺噻唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺二甲嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺異嘧啶、磺胺苯甲酰、磺胺二甲唑、酞磺胺噻唑、甲氧芐啶，濃度為1 mg/mL，介質(zhì)為乙腈)、19喹諾酮類抗菌藥混標(biāo)(恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、氟羅沙星、麻保沙星、達(dá)氟沙星、依諾沙星、吡哌酸、噁喹酸、二氟沙星、洛美沙星、氟甲喹、奧比沙星、司帕沙星、萘啶酸、西諾沙星，濃度為1 mg/mL，介質(zhì)為甲醇)、3酰胺醇類抗菌藥混標(biāo)(氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素，濃度為1 mg/mL，介質(zhì)為甲醇)和6大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥混標(biāo)(林可霉素、泰樂菌素、替米考星、羅紅霉素、克林霉素、阿奇霉素，濃度為1 mg/mL，介質(zhì)為甲醇),均購自天津阿爾塔科技有限公司。

1.4 樣品的采集與制備 發(fā)酵床按九宮格分區(qū)，各區(qū)中心位置點自上而下用對鏟采集各層墊料，混勻。九份試樣攪拌混合均勻后，四分法取1 kg墊料于密封袋中。液氮速冷后，4 ℃冷藏保存，7 d內(nèi)完成檢測。共對12個養(yǎng)殖場的異位發(fā)酵床進(jìn)行了采樣。試驗所需陰性對照試料(新配尚未投入使用的墊料)，由麗水市縉云縣新建異位發(fā)酵床場提供。

取試樣約5 g，均分至2個球磨罐中，放入直徑1 cm的鋼珠1顆。迅速置于液氮中，預(yù)冷2 min后，用球磨儀以30 Hz頻率振搖0.5 min后，取出粉末，置50 mL離心管，備用。

1.5 試料水分測定 取新制試料適量，照《中華人民共和國 獸藥典》附錄水分測定法中第一法“費休氏法 庫侖滴定法”，測定試料中水分含量。

1.6 試料前處理 稱取試料2.0 g，加入10 mL Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液(pH 4.5)，渦動混勻，超聲提取15 min，10000 r/min離心5 min。取全部上清液，置另一50 mL離心管中。上清液和殘渣分開處理。取上清液，全部通過經(jīng)甲醇和水活化好的PRIME HLB固相萃取柱，依次用水、5%甲醇水溶液淋洗，抽干。用8 mL洗脫液(取甲醇150 mL，乙酸乙酯150 mL、濃氨水6 mL，混勻)洗脫。取殘渣加入10 mL乙腈重復(fù)提取1次，取上清液于50 mL離心管中。將HLB柱的洗脫液與乙腈提取液合并，40 ℃水浴氮氣吹干，加入1.0 mL復(fù)溶液(取甲醇50 mL、0.1%甲酸水50 mL，混勻)，渦動溶解殘余物，濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.7 儀器條件

1.7.1 色譜條件 色譜柱：Waters Atlantis dC18柱(3.0 mm×150 mm，3 μm)，柱溫：30 ℃；流動相A：0.2%甲酸水，流動相B：甲醇；梯度洗脫程序：0～1 min，5% B， 1～16 min，98% B， 16～18 min，98% B， 18.1～22 min，5% B。進(jìn)樣量：5 μL，流速： 0.5 min。

1.7.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正負(fù)離子同掃，監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；離子源溫度：550 ℃，氣簾氣流速：40 L/h；脫溶劑流速：medium；離子源氣流速：霧化氣：50 L/h，輔助氣：35 L/h；駐留時間：20 ms；多反應(yīng)監(jiān)測離子的定性、定量離子對及碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 待測化合物的MRM模式檢測參數(shù)Tab 1 MRM parameters of the target compounds

序號No.化合物Compound離子對Ionpair(m/z)碰撞電壓Collisionenergy/eV序號No.化合物Compound離子對Ionpair(m/z)碰撞電壓Collisionenergy/eV19氟甲喹(Flumequine,FLU)262.1/202.0*46262.1/244.22746氯霉素(Chloramphenicol,CAP)321.0/152.1*-24321.0/257.0-1520奧比沙星(Orbifloxacin,ORB)396.1/352.2*25396.1/295.13447氟苯尼考(Florfenicol,FF)356.0/336.0*-15356.0/185.0-3021司帕沙星(Sparfloxacin,SPA)393.2/292.1*36393.2/375.23048甲砜霉素(Thiamphenicol,TAP)354.0/290.1*-28354.0/185.1-2422萘啶酸(Nalidixicacid,NAL)233.1/187*34233.1/215.12249林可霉素(Lincomycin,LIN)407.4/126.2*25407.4/359.22523西諾沙星(Cinoxacin,CIN)263.1/217.1*30263.1/245.12350泰樂菌素(Tylosin,TLJS)916.6/772.6*41916.6/174.24824磺胺醋酰(Sulfacetamide,HACX)215.1/156*13215.1/108.12551替米考星(Tilmicosin,TMKX)869.6/174.1*56869.6/156.05525磺胺甲噻二唑(Sulfamethizole,JXEZ)271.1/156.1*22271.1/108.13252羅紅霉素(RoxithroMycin,LHMS)837.7/158.1*35837.7/679.32626磺胺二甲異惡唑(Sulfafurazole,EJEWZ)268.1/156.1*19268.1/113.12153克拉霉素(ClarithroMycin,KLMS)748.6/158.1*33748.6/590.32927磺胺氯噠嗪(Sulfachloropyridazine,LDQ)285.1/155.9*23285.1/108.03554阿奇霉素(AzithroMycin,AQMS)749.7/591.4*40749.7/116.178

1.8 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取6份陰性對照試料，除在HLB柱的洗脫液與乙腈提取液的合并液中加入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液適量外，其余步驟同1.6 試料前處理項操作。使6份陰性對照試料的上機液中四環(huán)素類藥物的濃度依次為20、40、80、150、300、500 μg/kg；磺胺類藥物、喹諾酮類藥物、大環(huán)內(nèi)酯類藥物和氯霉素類藥物最終上機濃度依次為 5、10、20、50、100、200 μg/kg系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。上機檢測后，以其濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，制備基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.9 方法的靈敏度、回收率和精密度 采用陰性對照上機液添加目標(biāo)化合物的方法，依據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N≥3的濃度為檢出限(LOD)，S/N≥10的濃度為定量限(LOQ)。依據(jù)初定的LOD及LOQ濃度，添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液于2.0 g陰性試料中，經(jīng)前處理并上機測定。在相應(yīng)的保留時間處，無共流出物干擾，且滿足定性定量檢測的濃度，確定方法的靈敏度。

在確定方法定量限的基礎(chǔ)上，取陰性試料，作3個添加水平的回收率試驗，其中四環(huán)素類藥物為20.0、40.0、100.0 μg/kg，其他4類藥物均為10.0、20.0、50.0 μg/kg，每個水平5個平行，重復(fù)3次試驗，以確定其方法回收率和精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線線性結(jié)果 當(dāng)四環(huán)素類藥物在20～500 μg/kg濃度范圍內(nèi)，磺胺類藥物、喹諾酮類藥物、大環(huán)內(nèi)酯類藥物和氯霉素類藥物在5～200 μg/kg濃度范圍內(nèi)時，54種待測化合物的濃度-響應(yīng)曲線，線性良好，R均>0.99(表2)。

2.2 方法的靈敏度、回收率和精密度 在所試條件下，吡哌酸和依諾沙星回收率偏低且西諾沙星響應(yīng)值偏低，當(dāng)選取S/N≥3作為檢出限時難以滿足檢測要求，但當(dāng)選取S/N≥5對應(yīng)的濃度作為檢出限時，可滿足檢測要求。經(jīng)試，四環(huán)素類藥物的LOD和LOQ值最終分別確定為10 μg/kg和20 μg/kg，磺胺類藥物、喹諾酮類藥物、大環(huán)內(nèi)酯類藥物和氯霉素類藥物的LOD和LOQ值均則分別確定為5 μg/kg和10 μg/kg。

如表2所示，52種待測化合物的平均回收率在61.3%～111.7%之間，吡哌酸和依諾沙星平均回收率在46%左右，各待測化合物整體回收率在40.8%～126.2%之間，較低的回收率主要集在中濃度相對較低的定量限濃度點。54種化合物的批內(nèi)回收率在0.7%～14.2%之間，批間回收率則在6.4%～18.3%之間。表明所建立的方法能滿足日常檢測要求。

2.3 墊料水分含量 結(jié)果如表3所示。如表3所示，12家養(yǎng)殖場的異位發(fā)酵床墊料樣品，水分含量在37.7%～70.2%之間，其均值和中位值分別為54.7%和56.4%。結(jié)果表明，生豬異位發(fā)酵床墊料樣本中水分含量較高，且波動范圍也較大。為排除試樣水分對評估結(jié)果的干擾，本實驗中墊料中抗菌藥物殘留量結(jié)果均以折水后含量表示。

表3 生豬異位發(fā)酵床墊料樣品中水分含量Tab 3 The moisture levels of litters form ectopic pig manure fermentation beds

2.4 墊料中抗菌藥物分布 結(jié)果如圖1所示。如圖1所示，在監(jiān)測的12家養(yǎng)殖場的異位發(fā)酵床墊料中檢出4種四環(huán)素類、10種喹諾酮類、5種磺胺類、2種酰胺醇類和4種大環(huán)內(nèi)酯類藥物，共涉及25種抗菌藥物殘留，殘留總量在0.7～28 g/t之間，平均值和中位值分別為6.8 g/t和2.0 g/t。

圖1 生豬異位發(fā)酵床墊料中四環(huán)素類、喹諾酮類、磺胺類、酰胺醇類和大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物殘留量Fig 1 Tetracyclines(A), Quinolones(B), Sulpha(C), Amphenicols(D), Macrolides(E) levels and the total antibiotics residual levels in litters form 12 ectopic pig manure fermentation beds

在12家養(yǎng)殖場的所有墊料樣本中，4種四環(huán)素類藥物均有檢出，總殘留量介于687.5～27736.1 μg/kg之間。金霉素和土霉素檢出量最高，除11號養(yǎng)殖場外(27.4%)，兩者對四環(huán)素類藥物總殘留量的貢獻(xiàn)率在60.8%～92.4%之間。

12家養(yǎng)殖場的所有墊料樣本中，喹諾酮類藥物總殘留量在5.6～1858.2 μg/kg之間。恩諾沙星和環(huán)丙沙星檢出率均為100%，兩者對喹諾酮類藥物總殘留量的貢獻(xiàn)率在16%～100%之間，氧氟沙星和氟甲喹的檢出率則分別為91.7%和41.7%，其余6種檢出的喹諾酮類抗菌藥物僅為零星檢出。

2家養(yǎng)殖場的墊料樣本中磺胺類化合物殘留量低于檢出限，其余10家養(yǎng)殖場墊料樣本中的總殘留水平在5.6～50.2 μg/kg區(qū)間內(nèi)?；前烽g甲氧嘧啶的檢出率為72.7%，檢出濃度均值為7.46 μg/kg，其對磺胺類藥物殘留總量的貢獻(xiàn)率在33.1%～97.9%之間。其他磺胺類藥物均為零星檢出，增效劑磺胺甲氧芐啶盡管檢出率達(dá)到91.7%，但濃度均在檢出限附近，僅10號養(yǎng)殖場樣本達(dá)到10.7 μg/kg。

就酰胺醇類化合物而言，僅6家養(yǎng)殖場墊料樣本有檢出，總殘留量在8.4～536.2 μg/kg之間。除1號養(yǎng)殖場墊料樣本中同時檢出氟苯尼考(582.8 μg/kg)和甲砜霉素(7.4 μg/kg)外，其余5份墊料樣本均僅檢出氟苯尼考，均值為116.3 μg/kg，中位值為45.9 μg/kg。

12家養(yǎng)殖場墊料樣本中均有大環(huán)內(nèi)酯類藥物檢出，總殘留量在5.2～176.0 μg/kg之間。其中替米考星和林可霉素檢出率均為66.7%，兩者之和對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物殘留總量的貢獻(xiàn)率達(dá)到96%～100%。

3 討論與結(jié)論

3.1 前處理方法 根據(jù)前期調(diào)研，生豬養(yǎng)殖過程中主要使用的抗菌藥物有四環(huán)素類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、酰胺醇類和喹諾酮類。因而，所建立的方法應(yīng)盡量涵蓋這些常用抗菌藥物。

由于四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物多對熱不耐受，制樣采用超低溫冷凍球磨的方式，避免了粉碎過程產(chǎn)熱對這些藥物的破壞。為控制水溶性色素及雜質(zhì)的共流出干擾，嘗試僅使用甲醇、乙腈等有機溶劑進(jìn)行提取，然而四環(huán)素類化合物的添加回收率近乎為零。這可能與飼料中鐵、銅、鈣等金屬元素含量較高有關(guān)。這些經(jīng)糞污進(jìn)入墊料中的Ca2+、Mg2+、Fe3+離子，可與四環(huán)素類化合物B環(huán)C12位的烯醇基和C環(huán)C11位的酚羥基，形成難溶的螯合物[1]?，F(xiàn)有飼料中四環(huán)素類藥物液質(zhì)法檢測的文獻(xiàn)中，基本均使用0.1 mol/L Mcllvaine-Na2EDTA溶液提取配合親水親酯型固相萃取小柱(SPE)凈化策略。Mcllvaine-Na2EDTA溶液既保障了四環(huán)素類抗菌藥物的水溶性和水溶液的穩(wěn)定性，也控制了基質(zhì)中金屬離子對目標(biāo)化合物的絡(luò)合反應(yīng)[4]?；前奉惡袜Z酮類藥物通常使用甲醇、乙腈等有機溶劑進(jìn)行提取。預(yù)試結(jié)果表明，純乙腈作提取體系時，可有效降低上機液中的蛋白質(zhì)類雜質(zhì)。氟苯尼考的代謝產(chǎn)物氟苯尼考胺通常在偏堿性條件下提取，經(jīng)試，在本方法條件下氟苯尼考胺的提取效率不穩(wěn)定，且在C18柱上的色譜行為易受試樣中共流出物的干擾。同時，已有研究表明，約64%的氟苯尼考以原型方式通過尿液排出動物體外[5]，因而本研究中放棄對氟苯尼考胺的考查，以保全其通用性。

受親水親酯型SPE小柱凈化過程中對有機相和水相比例要求較為嚴(yán)苛的影響，很難兼顧這5類藥物的凈化。因而，采取“Mcllvaine-Na2EDTA溶液提取，配合親水親酯型SPE小柱凈化”加“乙腈進(jìn)行二次提取”的方式對試樣進(jìn)行提取與凈化。將SPE柱洗脫液與乙腈提取液合并后，經(jīng)吹干、復(fù)溶即可上機檢測。

3.2 異位發(fā)酵床墊料水分含量 一般生豬養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的糞污每天2～4次噴淋在異位發(fā)酵床墊料上，且邊噴淋邊翻拋攪拌以使微生物充分發(fā)酵。為保障菌種有適宜的條件生長，蔣鎖俊等[6]建議異位發(fā)酵床墊料水分控制在37%～45%之間。受噴淋與采樣間隔時間以及噴淋量、噴淋霧化效果、發(fā)酵床溫度等多重因素影響，發(fā)酵床墊料中水分含量波動幅度很大，可能嚴(yán)重干擾對墊料中抗菌藥物殘留量的評估。經(jīng)干燥后測定的方法，可控制水分的干擾，但干燥方法的選擇同樣影響抗菌藥物殘留量的評估。干燥失重的方法可直接測定其水分的相對含量，但105 ℃的常用干燥溫度并適合于對熱不耐受的抗菌藥物。此外，因墊料基質(zhì)多由木屑、桔桿等對水吸附能力較強的材料組成，測定結(jié)果重現(xiàn)性較差，且過長的干燥時間加重樣品間交叉干擾的風(fēng)險。因墊料基質(zhì)和待測的抗菌藥物并不與卡費休試劑反應(yīng)，且所需樣品量很少，故本方法采用費休氏滴定法進(jìn)行水分含量測定。采用超低溫冷凍球磨的方式制樣，既有利于減少制樣過程中墊料樣品中的水分揮發(fā)，也利于滴定過程中樣品內(nèi)部水分的全部快速釋放。12家養(yǎng)殖場的異位發(fā)酵床墊料樣品，水分含量在37.7%～70.2%之間，其均值和中位值分別為54.7%和56.4%，略高于蔣鎖俊等建議的參考范圍[6]，這可能與水分測定方式、采樣時間和噴淋時間之間的間隔長短、養(yǎng)殖場糞污預(yù)處理方式等因素有關(guān)。晏婷等[7]在探索異位發(fā)酵床對肉鴨糞污處理能力時，在其所試條件下，墊料水分含量在66%～76%之間，與本試驗結(jié)果部分重合。

3.3 異位發(fā)酵床墊料中5大類抗菌藥物蓄積量與趨勢 在監(jiān)測的12家養(yǎng)殖場的異位發(fā)酵床墊料中共檢出5大類25種抗菌藥物。5類抗菌藥物蓄積總量的平均值排序為：四環(huán)素類(6665 μg/kg)>喹諾酮類(84.7 μg/kg)>酰胺醇類(59.5 μg/kg)>大環(huán)內(nèi)酯類(41.4 μg/kg)>磺胺類(15.4 μg/kg)，這一排列順序符合養(yǎng)殖場抗菌藥物使用情況調(diào)研結(jié)果，也基本符合獸醫(yī)臨床中跨類別組方的比例。盡管尚沒有墊料中抗菌藥物殘留檢測的相關(guān)數(shù)據(jù)佐證，但與一些畜禽糞便中抗菌藥物殘留檢測結(jié)果相符。Zhao等[8]對中國8個省大型養(yǎng)殖場豬糞便的檢測結(jié)果顯示，土霉素和金霉素的殘留均值分別為59.06 mg/kg和21.06 mg/kg，環(huán)丙沙星和恩諾沙星的殘留均值分別為33.98 mg/kg和33.26 mg/kg。Yevenes K等[9]檢測發(fā)現(xiàn)糞便中四環(huán)素類、磺胺類和酰胺醇類藥物的濃度在1.4～300 mg/kg之間。

12家養(yǎng)殖場墊料樣本中，四環(huán)素類殘留總量最高。土霉素和金霉素殘留量對四環(huán)素類藥物殘留總量的貢獻(xiàn)率在61%～94%之間。依據(jù)原《農(nóng)業(yè)部公告第168號》[10]，土霉素和金霉素除具抑菌作用外，還允許作為促豬、禽生長添加劑使用。在這些養(yǎng)殖場抽取的19批次育肥豬飼料中10批次檢出金霉素，13批次保育豬飼料中3批次檢出土霉素。多西環(huán)素主要用于獸醫(yī)臨床治療使用，因而，其檢出率和檢出值均顯著低于土霉素和金霉素。

12家養(yǎng)殖場墊料樣本中，恩諾沙星和環(huán)丙沙星檢出率均為100%。除1號養(yǎng)殖場墊料樣本中環(huán)丙沙星殘留量顯著高于恩諾沙星殘留量外(P<0.05)，其余11家養(yǎng)殖場墊料樣本中環(huán)丙沙星殘留量均約為恩諾沙星殘留量的1/3～1/7，這些較低含量的環(huán)丙沙星可能是恩諾沙星在生豬體內(nèi)代謝形成[1,11]，也不排除在異位發(fā)酵過程中經(jīng)微生物代謝形成的可能，但仍需進(jìn)一步研究證實。

磺胺氯達(dá)嗪和磺胺間甲氧嘧啶被廣泛應(yīng)用于預(yù)防夏季和秋季育肥豬的弓形體感染；甲氧芐啶作為磺胺類藥物的增效劑，使用量亦較大。因而，在異位發(fā)酵床墊料中這3種磺胺類藥物檢出率較高。其中，磺胺間甲氧嘧啶(均值為7.46 μg/kg)在8家養(yǎng)殖場的墊料樣本中檢出，其對磺胺類藥物殘留總量的貢獻(xiàn)率在33.1%～97.9%之間。長期以來，磺胺類藥物殘留量是豬肉產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測的重要監(jiān)測指標(biāo)，磺胺二甲嘧啶和磺胺間甲氧嘧啶也是豬肉產(chǎn)品質(zhì)量安全的主要風(fēng)險因子。然而，在12家養(yǎng)殖場墊料樣本中，僅4號和7號養(yǎng)殖場墊料樣本中檢出低于6 μg/kg的磺胺二甲嘧啶。這一方面與這幾家養(yǎng)殖場更傾向于使用磷酸泰樂菌素磺胺二甲嘧啶預(yù)混劑有關(guān)，一方面可能與磺胺類藥物水溶性有關(guān)。馬文瑾等[2]綜述了堆肥處理過程中磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類藥物的濃度變化趨勢，水溶性較強的磺胺在堆肥過程中會隨糞尿流失。

較氯霉素更安全、抗菌活性更好的氟苯尼考成為生豬呼吸道疾病防治的首選。12家養(yǎng)殖場墊料樣本中，氟苯尼考檢出率為83.3%，但除1號養(yǎng)殖場墊料樣本中氟苯尼考?xì)埩袅繛?82.8 μg/kg外，其余9個樣本中的殘留量均低于60 μg/kg。1號和2號養(yǎng)殖場墊料中檢出氟苯尼考的同時，還分別檢出7.37 μg/kg和0.68 μg/kg的甲砜霉素。

在12家養(yǎng)殖場墊料樣本中，9家養(yǎng)殖場墊料樣本檢出替米考星，且其對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物殘留總量的貢獻(xiàn)率達(dá)到58%～100%。這與替米考星對治療胸膜肺炎、巴氏桿菌感染和支原體感染有較好的效果有關(guān)。林可霉素雖然有著83.3%的檢出率，但殘留量均低于26 μg/kg，可能與這些養(yǎng)殖場使用的少量鹽酸大觀霉素鹽酸林可霉素可溶性粉有關(guān)。

總體而言，12家養(yǎng)殖場墊料樣本中5大類抗菌藥物殘留總量在0.7～28 g/t之間，平均值和中位值分別為6.8 g/t和2.0 g/t。5大類藥物中四環(huán)素類藥物殘留量最高，其對各場墊料中抗菌藥物總殘留量的貢獻(xiàn)率在91.3%～98.8%之間。異位發(fā)酵床墊料啟用時間最早的2號場(2009年啟用，1.2 g/t)墊料樣本中抗菌藥物殘留總量并非最高。表明，異位發(fā)酵床墊料中抗菌藥物殘留量并不完全取決于異位發(fā)酵床啟用時間，還與養(yǎng)殖場的養(yǎng)殖管理水平、用藥習(xí)慣以及異位發(fā)酵床維護(hù)方式方法等因素均有關(guān)。

本研究建立了生豬異位發(fā)酵床墊料中四環(huán)素類、喹諾酮類、磺胺類、酰胺醇類和大環(huán)內(nèi)酯類，共54種抗菌藥物殘留量的LC-MS/MS檢測方法。超低溫冷凍粉碎后的墊料樣本以費休氏-庫侖滴定法測定水分，用Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液和乙腈提取，經(jīng)親水親脂平衡固相萃取小柱凈化，用LC-MS/MS法測定抗菌藥物殘留量，最終結(jié)果以折水后含量表示。方法具有簡便、高通量、抗干擾的特點，滿足日常檢測要求。在12家養(yǎng)殖場墊料樣本中共檢出25種抗菌藥物，各場墊料樣本總殘留量在0.7～28 g/t之間，其中四環(huán)素類藥物對總殘留量的貢獻(xiàn)率在91.3%～98.8%之間。異位發(fā)酵床墊料中抗菌藥物殘留量并不完全取決于異位發(fā)酵床啟用時間，還與養(yǎng)殖場的養(yǎng)殖管理水平、用藥習(xí)慣以及異位發(fā)酵床維護(hù)方式方法等因素均有關(guān)。