吳小軍，董林沛，張?jiān)品澹w 鵬，劉冰潔

(1.公安部物證鑒定中心，北京 100038；2.愛博才思亞太應(yīng)用支持中心，北京 100015)

舒泰是一種寵物臨床常見的麻醉劑，它是由唑拉西泮和替來他明1∶1混合而成[1-3]。唑拉西泮是苯二氮卓類鎮(zhèn)靜劑，具有良好的肌肉松弛和抗驚厥作用；替來他明則是一種分離麻醉劑，止痛作用持久。這兩種藥物在藥物動(dòng)力學(xué)上具有互補(bǔ)作用，常用于小動(dòng)物的臨床麻醉。兩個(gè)藥物的代謝能力有一定差異，唑拉西泮在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性要強(qiáng)于替來他明，實(shí)際檢驗(yàn)過程中常常能檢測(cè)到唑拉西泮，而替來他明的濃度卻較低[4]。此藥物在動(dòng)物身上應(yīng)用廣泛，但近年來發(fā)現(xiàn)此類藥物在刑事犯罪領(lǐng)域的濫用現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，常見于藥物輔助性犯罪如迷奸、麻搶等[5-7]。目前對(duì)于唑拉西泮和替來他明的檢驗(yàn)主要采用GC-MS法[1, 4]，何思陽(yáng)等[6]采用GC-QTOF鑒定藥物輔助性犯罪案件樣品中替來他明和唑拉西泮及其代謝物組分，取得良好的定性效果。氣質(zhì)聯(lián)用法前處理較為繁瑣且靈敏度往往達(dá)不到要求。LC-MS法具有前處理簡(jiǎn)單，靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，采用LC-MS法檢驗(yàn)唑拉西泮和替來他明尚未見報(bào)道。由于基質(zhì)的復(fù)雜性,有時(shí)候即使使用液質(zhì)串聯(lián)四級(jí)桿MRM模式也難以避免假陽(yáng)或假陰誤判。本研究在優(yōu)化前處理的方式的基礎(chǔ)上建立了UPLC-MRM-IDA-EPI-MS同時(shí)定性、定量檢測(cè)唑拉西泮、替來他明的檢驗(yàn)方法。該方法借助于信息依賴性獲取技術(shù)(IDA)能將多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)和增強(qiáng)子離子掃描模式(EPI)相結(jié)合[8-12]。不僅能保證在MRM基礎(chǔ)上獲得高靈敏度的定量結(jié)果，同時(shí)能借助于線性離子阱的增強(qiáng)子離子掃描技術(shù)，獲得二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行定性確證。值得指出的是EPI技術(shù)具有離子富集、信號(hào)增強(qiáng)的作用，即使在極低含量下也能獲得質(zhì)量較高的二級(jí)全譜，為低濃度臨界值的定性提供參考。使用本方法對(duì)血液中唑拉西泮和替來他明進(jìn)行定性和定量分析，簡(jiǎn)便快速，并將定性和定量方法有機(jī)結(jié)合在一起，可以滿足復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)物的準(zhǔn)確定性和定量分析要求。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑、材料 超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜(島津LC-30AC- Scix5500-QTrap)；高速離心機(jī)(Thermo-Fisher 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī))；超純水機(jī)(Milli-Q Academic)；高速振蕩器(CUTEMIXER CM-1000)

鹽酸唑拉西泮(cas：33754-49-3)、鹽酸替來他明(cas：14176-50-2)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購(gòu)于天津阿爾塔科技有限公司；乙腈(色譜純Merck)；甲醇(色譜純Merck)；Prime HLB固相萃取小柱(Waters Oasis)

空白血液(購(gòu)于北京市復(fù)興醫(yī)院醫(yī)院血庫(kù))；待測(cè)樣品：心血、尿液，來自某地公安機(jī)關(guān)送檢樣本。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置 取唑拉西泮和替來他明標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10 mg，精密稱定，用甲醇定容至10 mL，配置成1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液于4 ℃冰箱保存，再用甲醇稀釋至10 μg/mL作為混合標(biāo)準(zhǔn)品使用液。

1.3 樣品前處理 取血液(尿液)樣品0.5 mL于15 mL離心管中，加入2 mL乙腈，高速震蕩10 min，8000 r/min離心10 min，取上層清液過PRIME-HLB固相萃取小柱，收集洗脫液，過0.22 μm有機(jī)相濾膜，待測(cè)。若檢材中藥物濃度過高，可用乙腈稀釋至線性曲線范圍內(nèi)測(cè)定。

1.4 超高效液相色譜條件 色譜柱phenomenex Kinetex F5(100×3.0 mm，2.6 μm)；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相A相：乙腈，B相：含0.01%甲酸1 mM甲酸銨水。進(jìn)樣體積3 μL。流速：0.45 mL/min。梯度洗脫程序：0～1 min，5%A相；1～1.1 min，20%A相；1.1～6 min，20%～95%A相；6～8 min，95%A相；8～8.1 min，5%A相；8.1～11 min，5%A相。

1.5 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI+)；離子源溫度：500 ℃；噴霧電壓5500 V；氣簾氣壓力35 psi；噴霧器壓力50 psi；輔助加熱器壓力50 psi；掃描模式(MRM-IDA-EPI)，MRM相關(guān)參數(shù)見表1。IDA采用動(dòng)態(tài)背景扣除；掃描閾值100 cps；EPI源參數(shù)與MRM模式一致；碰撞能量CE(35±15eV);掃描范圍50～300 Da。

表1 唑拉西泮和替來他明的MRM質(zhì)譜參數(shù)Tab 1 MRM parameters of zolazepam and tiletamine

2 結(jié)果與分析

2.1 離子對(duì)的獲取 采用針泵進(jìn)樣方式，將100 ng/mL的唑拉西泮和替來他明標(biāo)準(zhǔn)品分別注入質(zhì)譜中，分別采用正、負(fù)掃描模式對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行掃描，結(jié)果表明在正離子模式下，唑拉西泮和替來他明均有較好的響應(yīng)。在步進(jìn)電壓為5的碰撞能量下分別對(duì)兩個(gè)化合物的子離子進(jìn)行掃描，確定各個(gè)目標(biāo)物的特征子離子，并進(jìn)行去簇電壓和碰撞電壓的優(yōu)化，得到一系列離子對(duì)，如表2所示。

表2 唑拉西泮和替來他明優(yōu)化后的備選離子對(duì)Tab 2 Alternative ion pairs optimized for zolazepam and tietamine

2.2 離子對(duì)的選擇及條件優(yōu)化 離子對(duì)的選擇原則應(yīng)該遵循無干擾、信噪比高等原則。采用液相色譜進(jìn)樣，進(jìn)樣濃度為100 ng/mL，使用MRM模式掃描監(jiān)控各個(gè)離子對(duì)。如圖1中所示唑拉西泮和替來他明的備選離子對(duì)均不存在干擾，故選擇信噪比最高的離子對(duì)作為定量離子，信噪比次之的選作定性離子。篩選后的結(jié)果如表1所示。

圖1 100 ng/mL 唑拉西泮和替來他明各個(gè)離子對(duì)的抗干擾及信噪比考察Fig 1 Investigation of anti-interference and signal-to-noise ratio of each ion pair of zolazepam and tiletamine at 100 ng/mL

2.3 基質(zhì)工作曲線、靈敏度與精密度 采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。由于不同檢材的藥物含量差異較大，難以采用一致的內(nèi)標(biāo)濃度，需要根據(jù)不同的樣品設(shè)置內(nèi)標(biāo)，可操作性差；其次內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇相對(duì)困難，氘代內(nèi)標(biāo)較為昂貴，故采用外標(biāo)法定量分析。分別配置1、5、10、20、50、100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)基質(zhì)添加溶液，以定量離子對(duì)的峰面積(y)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量溶度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明兩目標(biāo)物物線性關(guān)系良好(R2>0.995)；以定量離子對(duì)的10倍信噪比作為方法的定量限(LOQ)，以定性離子對(duì)3倍信噪比作為方法的檢出限(LOD)。將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中濃度為20 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積的RSD值計(jì)算曲線點(diǎn)的精密度。結(jié)果如表3所示。兩種藥物的線性曲線相關(guān)性好，線性范圍完全能夠滿足日常辦案要求，對(duì)于高濃度藥物在檢驗(yàn)過程中可以采用溶劑稀釋的方式，將藥物濃度稀釋至線性范圍內(nèi)檢驗(yàn)，不僅能滿足線性要求，對(duì)降低基質(zhì)效應(yīng)也有一定作用。

表3 方法的基質(zhì)工作曲線、靈敏度與精密度Tab 3 calibration curves， sensitivity and precision of the method

2.4 方法的回收率與精密度 選擇同一批次的空白血，添加適量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成3個(gè)濃度水平(5、20、50 ng/mL)的待測(cè)樣品，每個(gè)水平3個(gè)平行樣，使用上述前處理方法處理后，使用基質(zhì)外標(biāo)曲線定量。結(jié)果如表4所示。各個(gè)水平的加標(biāo)回收率均大于85%，方法穩(wěn)定性符合要求。

表4 血液中唑拉西泮和替來他明的回收率和精密度Tab 4 Recovery rates and precision of zolazepam and tiletamine in the blood

2.5 EPI數(shù)據(jù)采集分析 運(yùn)用MRM-IDA-EPI技術(shù)，分別采集了唑拉西泮、替來他明50 ng/mL基質(zhì)添加的二級(jí)質(zhì)譜圖，并將采集到的二級(jí)質(zhì)譜圖導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫(kù)中，用于定性檢索。如圖2所示，唑拉西泮的兩個(gè)子離子碎片138、243都是由母離子287碎裂產(chǎn)生，而替來他明的151、179則由母離子224碎裂產(chǎn)生，借助peakview軟件可以給兩物質(zhì)的特征離子做碎片歸屬，進(jìn)一步提高定性的準(zhǔn)確性。

圖2 A-唑拉西泮和B-替來他明二級(jí)質(zhì)譜圖Fig 2 Full spectrum of A-zolazepam and B-tiletamine

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè) 2019年黑龍江某地發(fā)生一起命案，具嫌疑人供述，其將從獸藥店買來的麻醉劑注射進(jìn)被害人體內(nèi)，導(dǎo)致被害人死亡。當(dāng)?shù)毓矙C(jī)關(guān)立案?jìng)刹楹?，將檢材送至中心要求檢驗(yàn)被害人血液和尿液中唑拉西泮和替來他明的含量。

運(yùn)用上述建立的方法不僅能獲得高靈敏度的定量結(jié)果，還能借助EPI技術(shù)對(duì)樣本的目標(biāo)物二級(jí)全譜與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的二級(jí)全譜進(jìn)行比對(duì)，獲得更加準(zhǔn)確的定性結(jié)果。檢驗(yàn)結(jié)果如圖3～圖5、表5所示。

圖3 樣品總離子流色譜圖Fjg 3 Chromatogram of total ion flow of the sample

圖4 檢材血和檢材尿中唑拉西泮的EPI全譜與譜庫(kù)比對(duì)結(jié)果Fig 4 Comparison results of EPI full spectrum and spectrum library of zolazepam in blood and urine samples

圖5 檢材血和檢材尿中替來他明的EPI全譜與譜庫(kù)比對(duì)結(jié)果Fig 5 Comparison results of EPI full spectrum and library of tiletamine in blood and urine samples

表5 樣品定量結(jié)果(μg/mL)Tab 5 Quantitative results of samples

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件的選擇 本研究考察了phenomenex Kinetex F5(100×3.0 mm，2.6 μm)；ACQUITY-UPLC-BEH C18(100×2.1 mm，1.7 μm)和ACQUITY-UPLC-HSS-T3(100×2.1 mm，1.8 μm)3種色譜柱，F(xiàn)5色譜柱為五氟苯基色譜柱，該柱對(duì)含鹵素含苯基及共軛基團(tuán)的物質(zhì)有較好的分離能力，而C18和T3色譜柱均為C18的鍵合相，區(qū)別在于T3色譜柱對(duì)極性化合物有更好的保留。研究結(jié)果表明phenomenex Kinetex F5(100×3.0 mm，2.6 μm)能夠?qū)⑦蚶縻吞鎭硭魍耆蛛x且信噪比高，另外兩種色譜柱均不能有效分離。根據(jù)藥物的結(jié)構(gòu)，選擇酸性流動(dòng)相有利于藥物電離，但過高的濃度的酸會(huì)使得基線噪音升高，研究過程中發(fā)現(xiàn)適當(dāng)增加揮發(fā)性鹽可以改善峰形，經(jīng)實(shí)驗(yàn)后選擇0.01%的甲酸1 mM甲酸銨水-乙腈作為液相流動(dòng)相。這兩種藥物出峰時(shí)間比較接近，采用梯度洗脫的方式使得兩物質(zhì)更好分離。

3.2 基質(zhì)效應(yīng)考察 質(zhì)譜分析過程中，樣品基質(zhì)中的干擾組分會(huì)對(duì)目標(biāo)待測(cè)物產(chǎn)生影響，從而產(chǎn)生基質(zhì)增強(qiáng)或基質(zhì)抑制效應(yīng)。本研究中評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)的方法是:基質(zhì)效應(yīng)=空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值/溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值×100%。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)在80%～120%之間時(shí)，可用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)<80%，為基質(zhì)抑制效應(yīng)，當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)>120%時(shí)，為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，此時(shí)可考慮用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。在檢驗(yàn)實(shí)踐中常通過三個(gè)途徑來減小基質(zhì)效應(yīng)的影響，一是對(duì)待測(cè)樣品的再凈化處理，常采用液液萃取或固相萃取的方式，去除樣品中的多肽、磷脂、無機(jī)鹽等干擾因素；二是改變液相分離條件，如改變洗脫強(qiáng)度、液相梯度或pH值等以提高分離度，避免待測(cè)組分與基質(zhì)的共洗脫，使得在分離過程中能夠有效避開基質(zhì)效應(yīng)區(qū)間；三是減少進(jìn)樣量或稀釋后進(jìn)樣，基質(zhì)效應(yīng)一般伴隨著進(jìn)樣載量增加而增加，只要靈敏度在許可的范圍內(nèi)均可通過此途徑來減少基質(zhì)效應(yīng)的影響。綜合上述因素，本研究采用固相萃取的方式來減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)分析的影響。本研究考察了1、10、50 ng/mL三個(gè)濃度梯度的基質(zhì)效應(yīng)，固相萃取柱子選擇了Waters-PRIME- HLB，該萃取柱吸附劑可以吸附樣品中非極性干擾物而不影響目標(biāo)物的回收率，特別是對(duì)于造成基質(zhì)干擾的脂肪和磷脂，去除效率高達(dá)95%以上。研究發(fā)現(xiàn)唑拉西泮和替來他明的基質(zhì)效應(yīng)均介于90%～105%之間。在實(shí)際工作過程中為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟可忽略基質(zhì)效應(yīng)的影響，采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線即可對(duì)二者準(zhǔn)確定量，但本研究中為提高研究結(jié)果可靠性，故采用基質(zhì)加標(biāo)方式考察線性關(guān)系。

3.3 EPI定性方法的選擇 法醫(yī)毒物分析的檢材都是被害人的血、尿、胃內(nèi)容物，基質(zhì)比較復(fù)雜。使用MRM定性模式，當(dāng)藥物濃度過低時(shí)，由于基質(zhì)的干擾，經(jīng)常會(huì)遇到離子對(duì)保留時(shí)間漂移、離子強(qiáng)度比例偏差大等問題，MRM定性準(zhǔn)確性難以保證。本研究利用Q-TRAP線性離子阱技術(shù)，借助于數(shù)據(jù)依賴性獲取技術(shù)(IDA)能將多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)和子離子增強(qiáng)掃描模式(EPI)相結(jié)合，在采集MRM離子對(duì)時(shí)，根據(jù)設(shè)定好的采集條件能夠在相同的時(shí)間窗采集到關(guān)聯(lián)的增強(qiáng)子離子碎片全譜信息，為物質(zhì)的準(zhǔn)確定性增加了一個(gè)維度。線性離子阱技術(shù)具有離子富集的作用，借助于此技術(shù)即使在低濃度下，也能打出高質(zhì)量的二級(jí)全譜信息。

法醫(yī)毒物關(guān)注的目標(biāo)物絕大多數(shù)是臨床治療藥物、毒品及新精神活性物質(zhì)，獸用麻醉劑在藥物輔助犯罪中并不多見，由于毒物種類非常多，獸用藥物很少進(jìn)入法醫(yī)毒物分析工作者的視野，當(dāng)遇到此類藥物時(shí)往往沒有現(xiàn)行有效的檢驗(yàn)方法。在本案例所遇到的唑拉西泮和替來他明為獸用麻醉劑舒泰的主要成分，此類藥物用于人類麻醉在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)鮮有報(bào)道。在動(dòng)物麻醉實(shí)驗(yàn)中為監(jiān)測(cè)其血藥濃度，多采用氣相色譜-質(zhì)譜法，該方法定性、定量能力強(qiáng)，但操作繁瑣，靈敏度差。在偵辦迷奸、麻醉?yè)尳俚劝讣邪l(fā)現(xiàn)被害人往往后知后覺，侵害行為發(fā)生三五天后才報(bào)警，此時(shí)被害人體內(nèi)的藥物濃度極低，氣相色譜-質(zhì)譜法的靈敏度已遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到檢驗(yàn)要求。

寵物用麻醉劑舒泰的主要成分為唑拉西泮和替來他明，二者通常為1∶1混合。從案例中可以看出替來他明的代謝速度比唑拉西泮快，故血中替來他明的濃度低于唑拉西泮，兩者都可經(jīng)尿液排出，替來他明經(jīng)尿液排泄的速率高于唑拉西泮。因這兩種藥物的代謝速率較快，在一些藥物輔助性犯罪案件的鑒定過程中常因被害人報(bào)警不及時(shí)，錯(cuò)過最佳的檢驗(yàn)時(shí)間窗口導(dǎo)致原藥在體內(nèi)檢不出，后續(xù)研究可關(guān)注其代謝物。

本研究所建立的UPLC-MRM-IDA-EPI-MS法兼具定性和定量的功能。EPI增強(qiáng)子離子掃描技術(shù)，能夠增加定性維度，有效避免假陽(yáng)性的發(fā)生；MRM選擇離子監(jiān)控則使方法具備出色的靈敏度，此方法能夠滿足辦案的需求。