朱 禮 何 浩 薛敏敏 陳文璋 程孟雅 袁列江 吳海智

(湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，湖南 長沙 410007)

肌醇又名環(huán)己六醇，廣泛分布于動物和植物體內(nèi)，是動物、植物和微生物的生長因子[1]。肌醇在嬰幼兒配方奶粉中是可選擇性成分指標(biāo)，可促進細(xì)胞新陳代謝、促進發(fā)育、增進食欲、促進毛發(fā)健康生長，預(yù)防濕疹等，其含量應(yīng)在1.0～9.0 mg/100 kJ[2]。目前，檢測食品中肌醇含量的方法有氣相色譜法[3-5]、微生物法[3,6]、液相色譜法[7-8]、氣質(zhì)聯(lián)用法[9]、液質(zhì)聯(lián)用法[10]、毛細(xì)管電泳法[11]、離子色譜法[12-13]、化學(xué)法[14]等。其中氣相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用法是利用硅烷化試劑與肌醇反應(yīng)，使肌醇反應(yīng)生成硅烷化肌醇衍生物，增加了肌醇的揮發(fā)性，以利于用氣相色譜或氣質(zhì)聯(lián)用儀進行分析。在適當(dāng)?shù)臈l件下，肌醇的6個羥基均被硅烷化試劑衍生，反應(yīng)產(chǎn)物單一，可以定量進行分析[15-16]。曾靜等[4]為了減少雜質(zhì)對肌醇含量測定的影響，采用固相萃取技術(shù)，樣品經(jīng)LC-Florisil小柱凈化處理，濃縮、硅烷化后以正己烷提取，以提高氣相色譜法檢測嬰幼兒配方奶粉中肌醇含量的準(zhǔn)確性。周瑋婧等[5]引入內(nèi)標(biāo)法減少了衍生過程給肌醇檢測帶來的誤差，并將該方法應(yīng)用于奶粉檢測中，利用肌醇在酸性條件下與乙酸酐生成不溶于水而溶于三氯甲烷的六乙酰肌醇，測定奶粉中肌醇的含量，該方法的定量限為6 mg/kg。以上氣相色譜法分別是研究通過優(yōu)化前處理方法減少雜質(zhì)對肌醇含量測定的影響，以及采用內(nèi)標(biāo)法減少衍生過程給肌醇檢測帶來的誤差。

目前，檢測嬰幼兒配方奶粉中肌醇含量的方法主要是GB 5009.270—2016的微生物法(第一法)和氣相色譜法(第二法)。微生物法是利用葡萄汁酵母菌對肌醇的特異性和靈敏性，定量測定食品中的肌醇含量，步驟繁瑣、檢測周期長、易受外部因素干擾。氣相色譜法靈敏度高，但樣品前處理過程中選擇的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方式、硅烷化等操作繁瑣耗時，反應(yīng)時間長，不利于批量樣品的檢測[17]。試驗擬在GB 5009.270—2016第二法的基礎(chǔ)上進行改進，通過優(yōu)化前處理步驟和儀器色譜條件，縮減前處理時間和批處理分析時間，以期實現(xiàn)實驗室間大批量樣品的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與試劑

肌醇(CAS號：87-89-8)：純度99.0%，上海安譜實驗科技有限公司；

嬰幼兒配方乳粉質(zhì)控樣品：肌醇特性值131.1 mg/100 g，中國檢驗檢疫科學(xué)研究院；

N,N-二甲基甲酰胺：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

三甲基氯硅烷：GC級，純度≥99.0%，上海麥克林生化科技有限公司；

六甲基二硅胺烷：分析純，純度98%，上海麥克林生化科技有限公司；

二水乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、無水乙醇：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜儀：Agilent-7890A型，配分流/不分流進樣口、FID檢測器，美國安捷倫科技有限公司；

石英毛細(xì)管柱：ZB-5ms型(15.0 m×0.25 mm×0.50 μm)，北京艾杰爾科技有限公司；

超純水儀：ELIX3 Essential+Reference型，廣東丹利科技有限公司；

臺式高速離心機：TG16-WS型，湖南湘儀離心機有限公司；

多通道平行濃縮儀(氮吹儀)：MV5型，萊伯泰科儀器股份有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH.S11-2型，天津泰斯特儀器有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9420A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

渦旋混合器：美國Talboys EOFO-945007基本型，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試樣處理與衍生 準(zhǔn)確稱取5 g試樣于50 mL小燒杯中，加入約40～50 ℃的超純水30 mL，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?。將試樣處理液轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，加入5 mL 亞鐵氰化鉀(106 g/L)溶液和5 mL乙酸鋅(220 g/L)溶液，加入超純水定容，充分振搖后靜置30 min，過濾。準(zhǔn)確吸取5 mL濾液至20 mL螺紋口比色管中，加入無水乙醇至約10 mL，渦旋混勻，氮吹剩至約2～3 mL，再加無水乙醇至約10 mL，氮吹至干后再加入5 mL 無水乙醇，繼續(xù)氮吹至干。在100 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中加熱30 min，冷卻后依次加入0.5 mL三甲基氯硅烷、1.0 mL六甲基二硅烷和4 mLN,N-二甲基甲酰胺，渦旋混勻2 min。將樣品處理液在80 ℃的水浴鍋中衍生20 min，衍生化反應(yīng)中其間振搖2～3次，衍生化反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫。用10 mL超純水分3次將衍生化反應(yīng)后的處理液水洗至50 mL離心管中，加入5.0 mL正己烷，渦旋混勻充分萃取，5 000 r/min離心3 min，取上清液進氣相色譜分析。

1.2.2 肌醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取101.0 mg經(jīng)105 ℃烘干2 h的肌醇標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用超純水定容后搖勻，配制成1.0 mg/mL的肌醇儲備液。吸取10.0 mL 肌醇儲備液，用超純水定容至100 mL容量瓶中，搖勻，得到100 μg/mL的肌醇使用液。分別吸取0.050，0.250，1.000，2.500，5.000，10.000 mL肌醇標(biāo)準(zhǔn)使用液至20 mL螺口比色管中，同1.2.1同步處理與衍生。

1.2.3 氣相色譜條件 色譜柱：ZB-5ms石英毛細(xì)管柱(15.0 m×0.25 mm×0.50 μm)；進樣口溫度260 ℃；進樣體積1.0 μL，分流比5∶1；色譜柱流速1.48 mL/min；程序升溫條件：120 ℃保持0 min，10 ℃/min升溫至190 ℃，保持7 min，然后50 ℃/min升溫至280 ℃，保持4.2 min，共20 min；檢測器溫度280 ℃；載氣：高純氮氣，純度≥99.999%；高純氫氣，純度≥99.999%，流量30 mL/min；高純空氣，流量400 mL/min。

1.2.4 方法學(xué)驗證 選擇測定低限、常規(guī)含量水平、最高殘留量(maximum residue limit，MRL)3個水平濃度進行三水平六平行的加標(biāo)回收率測定，同時選擇3個不同階段奶粉及中國檢驗檢疫科學(xué)研究院提供的奶粉質(zhì)控樣進行方法學(xué)驗證。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的改進

2.1.1 提取溶劑、提取方式和凈化方式對肌醇提取效率的影響 GB 5009.270—2016第二法用70%乙醇和30%超純水配制肌醇儲備液和標(biāo)準(zhǔn)使用液。試驗發(fā)現(xiàn)，肌醇儲備液在4 ℃存放10 d，將會有肌醇絮狀物析出?？紤]到肌醇在水中溶解度較好，在乙醇中只能微量溶解，試驗方法用超純水配制肌醇儲備液和標(biāo)準(zhǔn)使用液，存放時間3個月以上均無肌醇絮狀物析出。

GB 5009.270—2016第二法規(guī)定，用40 ℃溫水溶解奶粉后超聲10 min，用95%的乙醇定容。靜置20 min后用4 000 r/min離心5 min。試驗用40 ℃溫水浸泡奶粉后，渦旋充分混勻，加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液，定容、搖勻，靜置30 min后過濾。肌醇在水中溶解度顯著優(yōu)于在乙醇中的溶解度，因此，推測試驗方法提取效率應(yīng)優(yōu)于國標(biāo)方法。該推測在方法學(xué)試驗中得到了驗證。

2.1.2 濾液除水干燥方式對衍生結(jié)果的影響 GB 5009.270—2016第二法規(guī)定，取5 mL待干燥濾液至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮瓶中，加入5 mL無水乙醇旋轉(zhuǎn)濃縮至干，轉(zhuǎn)移至烘箱中100 ℃烘干1 h。加入10.0 mLN,N-二甲基甲酰胺，超聲溶解5 min后轉(zhuǎn)移至25 mL有螺紋蓋的離心管中，加入硅烷化試劑3.0 mL，在80 ℃水浴中衍生75 min。

試驗方法取5 mL待干燥濾液于20 mL螺口比色管中，加入無水乙醇至10 mL，渦旋混勻，氮吹至約1～2 mL刻度處，補加無水乙醇至10 mL，氮吹至干后于100 ℃烘干0.5 h。冷卻后加入0.5 mL三甲基硅烷、1 mL六甲基二硅烷和4 mLN,N-二甲基甲酰胺，渦旋混勻2 min，于80 ℃水浴中衍生20 min。

試驗方法與GB 5009.270—2016第二法相比，干燥方式由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥改為氮吹干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥只能小批量進行處理，樣品數(shù)量多則耗時較長，而氮吹干燥可實現(xiàn)大批量樣品的同時干燥。試驗方法使用多通道可調(diào)節(jié)氮吹儀可同時干燥處理54個樣品，極大地降低了大批量樣品的干燥時間，同時省去了干燥后的樣品由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮瓶轉(zhuǎn)移至離心管的步驟。試驗采用添加乙酸鋅和亞鐵氰化鉀的方式凈化，該方法較國標(biāo)方法能除去更多蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)，通過觀察試驗現(xiàn)象，試驗方法氮吹后剩下的固體要顯著少于國標(biāo)方法旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后剩下的固體物質(zhì)。

試驗方法通過在GB 5009.270—2016第二法基礎(chǔ)上進行改進，減少了在烘箱中的干燥時間，干燥時間縮短0.5 h；同時，試驗方法也縮短了在水浴鍋中的衍生時間，衍生時間縮短了55 min。肌醇標(biāo)準(zhǔn)樣品衍生物氣相色譜圖見圖1，嬰幼兒配方奶粉肌醇衍生物氣相色譜圖見圖2。試驗結(jié)果表明，在烘箱中烘干0.5 h已能完全去除水分，通過圖2可知肌醇衍生反應(yīng)產(chǎn)生的色譜峰無鼓包峰，且試驗方法測定得到的奶粉質(zhì)控樣結(jié)果與其特性值十分接近。表明水分去除干凈，衍生反應(yīng)完全。試驗表明，試驗方法即使縮短了干燥及衍生時間，仍能達到較好的干燥及衍生效果。

圖1 肌醇標(biāo)準(zhǔn)樣品衍生物氣相色譜圖Figure 1 Gas chromatogram of the standard derivative of inositol (100 μg/mL)

2.2 氣相色譜條件的優(yōu)化

GB 5009.270—2016第二法采用填料為50%氰丙基-甲基聚硅氧烷的60 m毛細(xì)管柱(DB-23)，試驗方法采用5%苯基-甲基聚硅氧烷(ZB-5ms)的15 m毛細(xì)管柱。GB 5009.270—2016第二法與試驗方法程序升溫條件比較見表1。由表1可知，試驗方法單個樣品分析時間縮短了43 min。這主要是因為試驗方法采用的色譜柱比GB 5009.270—2016第二法采用的色譜柱長度短了3倍，因此出峰時間較快；同時由于肌醇衍生物極性較小，試驗方法采用的5%苯基-甲基聚硅氧烷(ZB-5ms)為弱極性色譜柱，而GB 5009.270—2016第二法采用填料為50%氰丙基-甲基聚硅氧烷的60 m毛細(xì)管柱(DB-23)為中等極性色譜柱，因此試驗方法肌醇衍生物出峰時間較快，程序升溫時間減短。試驗方法即使大大縮短了分析時間，但由奶粉質(zhì)控樣的肌醇衍生物色譜圖可知(見圖2)，肌醇衍生物與其他雜質(zhì)色譜峰分離較好，分離度都在1.5以上。試驗方法極大地縮短了分析時間延長了色譜柱的使用壽命，大大地提高了檢驗效率。

表1 試驗方法與國標(biāo)方法色譜柱分析程序?qū)Ρ萒able 1 Thecomparison of chromatographic column’s analytical procedure between this paper and the national standard method

圖2 嬰幼兒配方奶粉肌醇衍生物氣相色譜圖Figure 2 Gas chromatogram of the inositol derivative of infant formula sample

2.3 方法學(xué)驗證

以肌醇質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(pA·s)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，試驗方法在1～200 μg/mL范圍內(nèi)線性范圍良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，線性方程為y=3.023x-0.518，對應(yīng)樣品的檢測范圍為1～200 mg/100 g。試驗方法中肌醇衍生物的3倍平均信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限(LOD)，10倍平均信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限(LOQ)，平行測定3次，取平均值獲得該方法的LOD及LOQ，對應(yīng)質(zhì)量濃度分別為1，3 μg/mL。按照前處理方法可知，樣品檢出限為1.0 mg/100 g，定量限為3.0 mg/100 g。分別取一、二、三段陰性奶粉，進行三水平六平行加標(biāo)試驗。加標(biāo)水平分別為測定低限水平、常規(guī)含量水平、MRL水平，加標(biāo)量分別為3，100，190 mg/100 g。由表2可知，三水平加標(biāo)回收平均回收率為97.4%～100.5%，符合GB/T 27404—2008要求。

表2 準(zhǔn)確度和精密度試驗Table 2 Accuracy and precision tests (n=6) %

3個奶粉樣品和1個質(zhì)控樣品分別用試驗方法和GB 5009.270—2016第二法測定，檢驗結(jié)果見表3。由表3可知，試驗方法測定樣品肌醇含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)<2.1%，運用試驗方法和國標(biāo)方法測定同一奶粉肌醇含量的相對偏差為1.2%～2.2%，奶粉質(zhì)控樣6次平行試驗數(shù)據(jù)的平均值(131.9 mg/100 g)與質(zhì)控樣品特性值(131.1 mg/100 g)的相對偏差為0.6%。由此可知，試驗方法檢測結(jié)果與國標(biāo)方法相近，質(zhì)控樣結(jié)果與真值十分接近。

表3 試驗方法與國標(biāo)方法檢驗結(jié)果比較?Table 3 The test results of this paper and the national standard method (n=6)

3 結(jié)論

通過對GB 5009.270—2016第二法進行前處理步驟及儀器色譜條件的優(yōu)化，建立了可用于實驗室大批量嬰幼兒配方奶粉中肌醇含量快速檢測的氣相色譜方法。該方法各項指標(biāo)均符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢驗》要求。將該方法運用到嬰幼兒配方奶粉肌醇含量的檢測中，其檢測結(jié)果與國標(biāo)方法相近，相對偏差為1.2%～2.2%；質(zhì)控樣檢測結(jié)果與真值十分接近，相對偏差為0.6%。該方法與已有的氣相色譜方法相比，前處理時間和上機時間短、前處理簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、可重復(fù)性好，可實現(xiàn)批量化樣品檢測。