馬 科 吳貞貞 楊雪鵬

(鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450008)

吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)，是一種含有3個羧基的水溶性醌類化合物，是繼核黃素和煙酰胺后的第三類輔酶[1]，廣泛存在于母乳、植物、動物組織、某些單細(xì)胞真核生物和許多細(xì)菌中[2]。作為許多重要酶的輔基，PQQ對生物體具有多種生物功能，如調(diào)控基因表達(dá)和蛋白質(zhì)功能[3]、神經(jīng)保護作用[4]、調(diào)節(jié)機體自由基水平[5]和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、修復(fù)DNA功能[6]等。

在自然界中，吡咯喹啉醌存在醌型(PQQ，氧化態(tài))、半醌型(PQQH)和氫醌型(PQQH2，還原態(tài)) 3種可以互相轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定狀態(tài)(見圖1)[7-8]。氧化態(tài)PQQ呈醌形式，PQQH2呈鄰二酚形式。PQQ可以通過從底物轉(zhuǎn)移兩個質(zhì)子和兩個電子轉(zhuǎn)化為PQQH2[9]。作為氧化還原酶的輔基，PQQ 3種狀態(tài)的轉(zhuǎn)化在底物的氧化還原反應(yīng)中起到電子傳遞作用。

圖1 PQQ氧化態(tài)與還原態(tài)轉(zhuǎn)化及電子傳遞功能Figure 1 PQQ oxidation state and reduction state transformation and electron transfer function

已有研究[10]表明，PQQH2具有良好的抗氧化性，可以有效清除機體活性氧自由基。但是，PQQ對于活性氮(如：ABTS)自由基的清除作用，未見文獻(xiàn)報道?；钚缘杂苫菣C體內(nèi)氧化應(yīng)激過程的產(chǎn)物，在機體過多地積累會導(dǎo)致慢性炎癥，進(jìn)而引發(fā)很多疾病，例如癌癥、糖尿病、動脈粥樣硬化等[11-12]。試驗擬以ABTS自由基的清除能力為指標(biāo)對PQQH2的抗氧化性進(jìn)行研究，以期為其作為抗氧化劑在食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

PQQH2標(biāo)品：色譜純，阿拉丁試劑公司；

維生素C標(biāo)品：色譜純，鄭州派尼化學(xué)試劑公司；

ABTS：分析純，麥克林生物科技有限公司；

其余試劑均為分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備

分析天平：AB256-S型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

精密pH計：PHS-3D型，上海雷磁儀器廠；

紫外—分光光度計：2300型，尤尼克(上海)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 清除ABTS自由基的反應(yīng)動力曲線測定 分別配制PQQH2標(biāo)準(zhǔn)溶液10，30，50，70 mg/L。將PQQH2溶液與0.1 mmol/L的ABTS工作液進(jìn)行自由基反應(yīng)，間隔一定時間，測定吸光度，研究PQQH2清除ABTS自由基的速度與時間變化的關(guān)系，試驗重復(fù)3次，以時間為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)繪制反應(yīng)動力曲線圖，按式(1)計算ABTS自由基清除率。

(1)

式中：

a——ABTS自由基清除率，%；

A0——空白對照組的吸光度；

A1——1 mL PQQH2和 ABTS工作液的吸光度。

根據(jù)文獻(xiàn)[13]，建立反應(yīng)動力學(xué)模型：

(1) 準(zhǔn)一級反應(yīng)動力學(xué)方程：

(2)

式中：

Ct——ABTS自由基在t時刻的質(zhì)量濃度，mg/mL；

C0——ABTS自由基在t=0時的質(zhì)量濃度，mg/mL；

k1——一級反應(yīng)速率常數(shù)，mg/(mL·min)。

ABTS自由基剩余率：

(3)

式中：

w——ABTS自由基的剩余率，%。

結(jié)合式(2)和式(3)得準(zhǔn)一級反應(yīng)動力學(xué)方程式：

ln(1-a)=-k1t，

(4)

(2) 準(zhǔn)二級反應(yīng)動力學(xué)方程：

(5)

結(jié)合式(3)和式(5)得準(zhǔn)二級反應(yīng)動力學(xué)方程式：

(6)

式中：

a——ABTS自由基清除率，%；

k2——二級反應(yīng)速率常數(shù)，mg/(mL·min)。

1.2.2 清除ABTS自由基能力半數(shù)清除率(IC50)的測定

以維生素C為陽性對照，計算ABTS自由基清除率達(dá)到50%時樣品的質(zhì)量濃度。分別配制PQQH2標(biāo)準(zhǔn)溶液10，30，50，70，90 mg/L。將1 mL PQQH2溶液與3 mL 0.1 mmol/L 的ABTS自由基反應(yīng)，試驗重復(fù)3次。半數(shù)清除率濃度的計算，運用Oringin 9.1進(jìn)行。

1.2.3 熱穩(wěn)定性研究

(1) 加熱溫度對PQQH2穩(wěn)定性的影響：配制30，50，70 mg/L PQQH2標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在相同時間(4 h)、不同溫度(30，50，75，100 ℃)水浴下反應(yīng)，測定PQQH2對ABTS自由基的清除率。

(2) 加熱時間對PQQH2穩(wěn)定性的影響：配制30，50，70 mg/L PQQH2標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在相同溫度(100 ℃)、不同時間(4，8，12，24 h)下進(jìn)行水浴反應(yīng)，測定PQQH2對ABTS自由基的清除率。

試驗重復(fù)3次，測定方法參照1.2.1，以維生素C為陽性對照，對PQQH2各項指標(biāo)作出評價。

2 結(jié)果分析

2.1 清除ABTS自由基的反應(yīng)動力曲線

如圖2所示，反應(yīng)前10 min內(nèi)，ABTS自由基清除率隨反應(yīng)時間的延長顯著提高，PQQH2質(zhì)量濃度越高，清除效率越高，10 min后ABTS自由基清除速率降低，清除率無顯著變化，反應(yīng)逐漸趨于平衡。并且相同反應(yīng)條件下，提高PQQH2的質(zhì)量濃度，ABTS自由基清除率也顯著提高，70 mg/L PQQH2相較于10 mg/L PQQH2對ABTS自由基的清除率提升了約3倍，達(dá)到了95%左右。試驗結(jié)果表明，ABTS自由基清除率與PQQH2的質(zhì)量濃度呈正比。

圖2 不同濃度PQQH2清除ABTS自由基的反應(yīng)動力曲線Figure 2 Kinetic curves of scavenging effects of different concentrations of PQQH2 on ABTS radical

對不同質(zhì)量濃度PQQH2清除ABTS自由基反應(yīng)進(jìn)行準(zhǔn)一級、準(zhǔn)二級動力學(xué)方程擬合，結(jié)果見圖3、圖4，相應(yīng)動力學(xué)參數(shù)見表1。準(zhǔn)一級動力學(xué)模型擬合相關(guān)系數(shù)均在0.9以下，線性相關(guān)較差。而準(zhǔn)二級動力學(xué)模型擬合的線性相關(guān)系數(shù)為0.959～0.996，因此，PQQH2清除ABTS自由基采用準(zhǔn)二級動力學(xué)模型，二級反應(yīng)速率常數(shù)隨PQQH2質(zhì)量濃度的增加而增大。二級反應(yīng)速率常數(shù)能夠反映抗氧化物質(zhì)的自由基清除能力，其值越大，清除自由基的能力越強。

表1 動力學(xué)模型擬合參數(shù)Table 1 Kinetic parameters for PQQH2 to ABTS·

圖3 PQQH2清除ABTS自由基準(zhǔn)一級反應(yīng)動力學(xué)方程的擬合圖線Figure 3 Fitting curve of the kinetic equation of the quasi-first order reaction of PQQH2 clearing ABTS radical

圖4 PQQH2清除ABTS自由基準(zhǔn)二級反應(yīng)動力學(xué)方程的擬合圖線Figure 4 Fitting curve of the kinetic equation of the quasi-second order reaction of PQQH2 clearing ABTS radical

2.2 清除ABTS自由基的IC50值

如圖5所示，ABTS自由基清除率與PQQH2和維生素C在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，ABTS自由基清除率與PQQH2、維生素C的質(zhì)量濃度呈正比。當(dāng)PQQH2質(zhì)量濃度為0～90 mg/L時，對ABTS自由基的清除率隨著質(zhì)量濃度的增大而升高，清除率可高達(dá)95%左右，但之后隨著PQQH2質(zhì)量濃度的增加，清除率雖然也在增加，但增長速率顯著降低，清除率最終保持平穩(wěn)不變。PQQH2清除ABTS自由基IC50值約為30 mg/L，即90 μmol/L，而維生素C清除ABTS自由基的IC50值約為38 mg/L，即176 μmol/L。PQQH2的IC50值是維生素C的51.14%，說明PQQH2比維生素C更適合作為一種快速清除自由基的抗氧化劑。

圖5 PQQH2、維生素C對ABTS自由基清除能力的變化Figure 5 ABTS radical scavenging capacity of PQQH2,VC

2.3 PQQH2與維生素C清除ABTS自由基的反應(yīng)動力學(xué)比較

通過研究相同質(zhì)量濃度(70 mg/L)的PQQH2與維生素C清除ABTS自由基的反應(yīng)動力學(xué)，結(jié)果見圖6。由圖6 可知，相同質(zhì)量濃度時，PQQH2的抗氧化性要高于維生素C的。反應(yīng)25 min時，PQQH2對ABTS自由基的清除率可達(dá)到90%以上，而維生素C對ABTS自由基的清除率僅能達(dá)到78%。

圖6 PQQH2和維生素C清除ABTS自由基的反應(yīng)動力曲線Figure 6 Kinetic curves of scavenging effects of PQQH2 and VC on ABTS radical

2.4 熱穩(wěn)定性研究

2.4.1 加熱溫度對PQQH2穩(wěn)定性的影響 如圖7所示，在加熱時間相同的條件下，隨著加熱溫度的升高，PQQH2和維生素C對ABTS自由基的清除能力均呈下降趨勢，可能是由于加熱導(dǎo)致抗氧化活性基團損失。加熱溫度由30 ℃升高到100 ℃，相同質(zhì)量濃度的維生素C對ABTS自由基清除能力損失比PQQH2多2～3倍。說明PQQH2表現(xiàn)出的熱穩(wěn)定性要高于維生素C，當(dāng)加熱時間相同時，PQQH2的穩(wěn)定性更高，對ABTS自由基清除能力損失更小，PQQH2即使在高溫條件下，也依然能夠保持自身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而展現(xiàn)突出的抗氧化特性。

圖7 加熱溫度對清除率的影響Figure 7 The effect of heating temperature on removal rate

2.4.2 加熱時間對PQQH2穩(wěn)定性的影響 如圖8所示，當(dāng)加熱溫度一定，隨著加熱時間的延長，維生素C表現(xiàn)出的抗氧化活性能力的降低幅度顯著高于PQQH2，約為PQQH2的3～7倍。相較于維生素C，PQQH2具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，在高溫條件下，依然能夠保持優(yōu)良的抗氧化性能。維生素C因其具備的抗氧化特性被廣泛應(yīng)用于食品中，但基于自由基清除能力、熱穩(wěn)定性等指標(biāo)，PQQH2比維生素C更適合作為食品抗氧化劑。

圖8 加熱時間對清除率的影響Figure 8 Effect of heating time on removal rate

3 結(jié)論

研究檢測了10，30，50，70 mg/L 4種質(zhì)量濃度下還原態(tài)吡咯喹啉醌對ABTS自由基的清除能力，結(jié)果表明，濃度越高，清除能力就越強。當(dāng)還原態(tài)吡咯喹啉醌的質(zhì)量濃度為70 mg/L時，反應(yīng)25 min，ABTS自由基的清除率可達(dá)到90%以上，說明還原態(tài)吡咯喹啉醌具有一定的抗氧化能力。根據(jù)反應(yīng)動力學(xué)模型，二級動力學(xué)擬合方程更能描述還原態(tài)吡咯喹啉醌對ABTS自由基的清除能力，相關(guān)系數(shù)為0.959～0.996。還原態(tài)吡咯喹啉醌比維生素C具有更好的抗氧化活性，有望將其開發(fā)為一種天然的抗氧化劑。