潘 飛，趙 磊，陳艷麟，郝 帥，張會敏

（北京工商大學，食品營養(yǎng)與人類健康北京高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京 100048）

黑米花色苷，是一類天然多酚類色素，源于黑米種皮[1]，主要包括矢車菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，C3G）、芍藥素-3-葡萄糖苷、牽?；ㄋ?3-葡萄糖苷等，其中C3G含量最高，約占總色素含量的95%?；ㄉ站哂卸喾N生物活性，如抗氧化[2]、調解血脂[3]、改善腸道菌群[4]、抗炎[5]、預防肝損傷[6]等，對保健食品、醫(yī)藥加工和化妝品行業(yè)都具有重要意義。

花色苷極易受到溫度、金屬離子、光照等外界環(huán)境的影響，導致花色苷發(fā)生降解褪色，甚至失去生物活性[7]，極大限制了花色苷的開發(fā)和應用。此外，花色苷在體內的環(huán)境下穩(wěn)定性差，生物利用率低[1]。近年多項研究表明，添加輔色劑可提高花色苷的穩(wěn)定性，如兒茶素、迷迭香酸、丁香酸等酚酸類物質通過與花色苷分子結構相互作用，減少外界環(huán)境對花色苷的降解[8]，但在緩釋和生物利用度方面并沒有得到很好改善。相比較輔色劑而言，由多糖、蛋白質、脂質等生物可降解大分子構建的納米微膠囊載體更能有效解決這些問題[9-10]，這為花色苷作為功能性天然色素的開發(fā)和應用帶來了嶄新的市場前景。

殼聚糖（chitosan，CS），又稱脫乙酰甲殼素，是由幾丁質經過脫乙酰作用得到的產物，具有良好的生物相容性、血液相容性、可自行降解代謝、無毒安全性高等特點[11]，這些優(yōu)良的性能在納米醫(yī)藥、食品、化妝品、生物醫(yī)藥工程等領域已經得到廣泛的應用。γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，PGA），是一種陰離子天然聚合物，易溶于水，并且無毒、生物相容性好及可降解[12]。研究表明，CS和PGA可在pH驅動下通過離子凝聚法形成納米粒子[13]，對紫杉醇、硫酸鏈霉素、乳酸鏈球菌素等活性物質進行微膠囊化研究，結果表明，與微膠囊化前相比，膠囊化的產物在穩(wěn)定性、緩釋效果及生物利用率方面得到明顯改善[14-16]。此外，賀博[17]采用CS和羧甲基CS包埋藍莓花色苷，結果表明負載藍莓花色苷的納米粒在穩(wěn)定性和胃腸緩釋性方面均較包埋前顯著提高。Chen Tan等[18]采用硫酸軟骨素與CS制備的接骨木花色苷納米粒也表現出良好的穩(wěn)定性和抗氧化能力。然而，CS和PGA構建納米載體在天然色素的應用研究較少，尚不清楚CS-PGA納米載體對花色苷的穩(wěn)定性及緩釋性的影響，這些研究不僅有助于解決花色苷穩(wěn)定性差的問題，還利于提高其對胃腸環(huán)境的耐受性和緩釋性，極大拓寬了花色苷在食品領域的應用。

因此，本研究采用CS和PGA作為壁材，以C3G為代表的黑米花色苷作為活性物質進行納米微膠囊化，并采用超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）法對花色苷含量進行測定，分別進行單因素試驗和響應面試驗，以粒徑和包封率為指標，確定最佳制備條件。采用表征分析方法對納米粒的粒徑、多分散指數（polydispersity index，PDI）、Zeta電位及微觀結構進行測試分析。利用體外模擬胃腸消化系統(tǒng)對黑米花色苷納米粒進行緩釋研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米提取物（花色苷純度≥25%） 湖北紫鑫生物科技有限公司；C3G（純度≥98%） 成都曼斯特生物科技有限公司。

CS（脫乙酰度≥95%）、PGA 上海易恩化學技術有限公司；甲酸（色譜純） 美國Mreda公司；乙腈（色譜純） 美國Fisher Chemical公司；胃蛋白酶、豬胰液素 北京博奧拓達科技有限公司；冰乙酸 天津福晨化學試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

6 000 Da透析袋 北京酷來搏科技有限公司；Eclipse plus C18（RRHD 1.8 μm，2.1 mm×50 mm）色譜柱、1290 UPLC儀 美國Agilent公司；HJ-6多頭磁力攪拌器 北京天林恒泰科技有限公司；SU8020掃描電鏡日本日立公司；真空冷凍干燥機 美國Labconco公司；電位粒徑納米分析儀 英國Malvern公司；HNY-100B臺式溫室振蕩器 天津歐諾儀器有限公司；H1850臺式離心機 北京天林恒泰科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑米花色苷納米粒的制備

稱取一定量的CS溶解在1%體積分數乙酸溶液中，配制不同質量濃度的CS，攪拌2 h使溶液澄清透明，準確移取20 mL CS溶液于燒杯中，并加入不同質量的黑米花色苷提取物，使黑米花色苷達到一定濃度，攪拌1 h使其溶液澄清透明，用6 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)其pH值至4.5，然后慢慢滴加20 mL一定濃度的PGA水溶液，使PGA-CS呈一定質量比，滴加完畢后繼續(xù)攪拌一定時間即完成制備，此操作均避光進行。

1.3.2 花色苷含量的測定

使用UPLC對樣品中花色苷進行定量分析，色譜條件：色譜柱：Eclipse plus C18（RRHD 1.8 μm，2.1 mm×50 mm）；流動相：A為乙腈溶液（體積分數2%甲酸），B為水（體積分數2%甲酸）；梯度洗脫條件：0～2 min，5% A，95% B；2～10 min，5%～50% A，95%～50% B；10～12 min，50% A，50% B；12～14 min，50%～5% A，50%～95% B；14～16 min，5% A，95% B；流速0.2 mL/min；檢測波長520 nm；柱溫30 ℃；進樣量1 μL。采用C3G（6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL）按上述方法進行測定，以C3G質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線（y=21.422x-81.882，R2=0.999 4），并計算樣品中花色苷的含量。

1.3.3 包封率及載藥率的計算

將制備好的黑米花色苷納米粒溶液以12 000×g離心30 min，收集上清液，根據1.3.2節(jié)方法測定游離花色苷的含量，將沉淀物（黑米花色苷納米粒）進行干燥稱量，并代入公式計算包封率及載藥量：

式中：W0為初始黑米花色苷質量濃度/（mg/mL）；W1為游離黑米花色苷質量濃度/（mg/mL）；W總為黑米花色苷納米粒質量。

1.3.4 單因素試驗

為考察單一因素對黑米花色苷納米粒包封率的影響，在其他條件相同的情況下，分別選擇不同黑米提取物質量濃度（0.5、1、2、3、4 mg/mL）、CS質量濃度（0.1、0.5、1、2、3 mg/mL）、PGA-CS質量比（1∶10、1∶4、1∶2、3∶4、1∶1）、pH值（3、3.5、4、4.5、5、5.5）和攪拌時間（0、30、60、90 min）進行研究。

1.3.5 響應面試驗設計

采用SPSS 18.0對單因素試驗結果分析，選出對載藥納米粒包封率影響較大3 個因素CS質量濃度（A）、PGA-CS質量比（B）和黑米提取物質量濃度（C）。每個變量水平分別以-1、0、1進行編碼，因素和水平見表1。采用Design Expert 8.0.6對試驗數據進行回歸分析，對黑米花色苷納米粒包封率和粒徑的影響因素進行深入研究和條件優(yōu)化，并做出響應面圖，對響應值受多個變量影響的問題進行建模及分析預測。該模型通過最小二乘法擬合二次多項方程：

式中：Wi為響應值（包封率、粒徑）；β0為常數；βi為線性系數；βii為二次項系數；βij為2 個因素間的交互作用系數。Xi和Xj為參數變量（A、B、C）。

表1 響應面試驗因素水平設計Table 1 Code and level of independent variables used in response surface design

1.3.6 結構表征分析

1.3.6.1 粒徑、PDI和Zeta電位

取一定量制備好的黑米花色苷納米粒溶液，稀釋至原濃度的1/10，采用馬爾文激光粒度分析儀測定溶液狀態(tài)下納米粒平均粒徑、PDI和Zeta電位，在25 ℃測試6 次取平均值。

1.3.6.2 掃描電鏡觀察

為了觀察樣品的表面形態(tài)，對凍干后的載藥納米粒進行掃描電鏡測試。使用導電雙面膠將樣品固定在樣品臺上，噴鍍鉑金后進行觀察。測試條件為放大倍率400 倍，加速電壓3.0 kV，在電子顯微鏡下觀察、拍照。

1.3.7 緩釋研究

參考Hu Qiaobin等[19]的研究方法配制模擬胃腸液。將裝有10 mg凍干黑米花色苷納米粒的透析袋置于盛有50 mL的新鮮胃液（2.0 g/L氯化鈉、2.917 g/L鹽酸及1 mg/mL胃蛋白酶，pH（2.0±0.1）的錐形瓶中，然后使其在37 ℃、150 r/min的搖床上振蕩，在固定時間取樣。2 h后，向錐形瓶中加入90 mL新鮮腸液（0.616 g/L氫氧化鈉、6.8 g/L磷酸二氫鉀及10 mg/mL豬胰液素，pH（7.2±0.1），使其繼續(xù)在37 ℃、150 r/min的搖床上振蕩，在固定時間取樣，采用未包封的黑米花色苷提取物作為對照，按照1.3.2節(jié)方法檢測黑米花色苷含量，計算黑米花色苷釋放率。

式中：Wt為黑米花色苷在消化液中的釋放量/（mg/mL）；W0為初始黑米花色苷總添加量/（mg/mL）。

1.4 數據分析

采用SPSS 19.0和Design Expert 8.0.6軟件對結果進行分析，數據以表示，采用t檢驗，P＜0.05，差異顯著；P＜0.01，差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 制備條件單因素試驗

黑米提取物質量濃度對包封率的影響結果表明（圖1A），當黑米提取物質量濃度為2 mg/mL時，包封率最高為29.9%，之后黑米提取物質量濃度繼續(xù)增加包封率降低，這可能是因為黑米提取物中存在一些電解質雜質影響著納米粒的形成，過大的質量濃度不利于花色苷的包埋。

CS質量濃度及PGA-CS質量比對包封率的影響結果表明（圖1B、C），隨著CS質量濃度及PGA-CS質量比的增大，包封率呈現先升高后下降的趨勢，在CS質量濃度為1 mg/mL和PGA-CS質量比為1∶2時包封率達到最大，分別為41.76%和42.45%，這是因為合適的壁材濃度和PGACS質量比反映2 種壁材離子交聯的強度和穩(wěn)定性，直接影響納米粒包封率和性能[20]。

pH值對包封率的影響結果如圖1D所示，包封率隨著pH值的升高呈現先升后降的趨勢，在pH 5.0時包封率最高，可達49.51%。這可能是因為在pH 5.0時所形成的納米粒表面電荷相對穩(wěn)定，有利于聚谷氨酸和CS通過離子交聯，當pH值增大時，所形成的交聯聚合物表面電荷降低，出現凝聚影響黑米花色苷的包埋[21-22]。

攪拌時間對包封率的影響結果表明（圖1E），適當的攪拌時間有利于黑米花色苷的包埋，攪拌時間為30 min時包封率最高，可達49.78%。因為黑米花色苷納米粒的形成是一個動態(tài)過程，適當攪拌有利于溶質的分散和納米粒的粒徑的均一，攪拌時間過長破壞了納米粒之間的相互作用，發(fā)生碰撞和聚集導致包埋后黑米花色苷釋放出來。從5 個單因素的結果顯示，pH值和攪拌時間對包封率的影響相對較小，而黑米提取物質量濃度、CS質量濃度及PGA-CS質量比對包封率影響顯著，因此，后續(xù)實驗選擇pH 5.0和攪拌時間30 min作為固定參數，對黑米花色苷的包埋條件進一步優(yōu)化。

圖1 包埋條件對黑米花色苷包封率的影響Fig.1 Effect of preparation conditions on the encapsulation rate of black rice anthocyanin-loaded nanoparticles

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應面結果與分析

根據單因素試驗結果，以CS質量濃度（A）、PGACS質量比（B）、黑米提取物質量濃度（C）為自變量，粒徑（W1）和包封率（W2）為因變量進行響應面試驗，Box-Benhken試驗設計及結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Box-Benhken design with response variables

采用Design Expert 8.0.6軟件對表2試驗數據進行多元回歸擬合，得到CS質量濃度（A）、PGA-CS質量比（B）和黑米提取物質量濃度（C）與粒徑（W1）和包封率（W2）的二次多項回歸模型方程為：

表3 獨立變量響應面模型方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface quadratic polynomial models

從表3可以看出，所獲得的回歸模型均極顯著（P＜0.01），失擬項均不顯著（P＞0.05），R2＞0.95，說明模型有效且得到較好的預測值。一次項B、C對載藥納米粒的粒徑和包封率影響均顯著（P＜0.05），且B、C對粒徑影響極顯著（P＜0.01），一次項A對粒徑影響顯著（P＜0.05），而對包封率不顯著；二次項B2和C2對粒徑和包封率影響顯著（P＜0.05），A2則不顯著（P＞0.05）；交互相中除BC對粒徑影響極顯著（P＜0.01）外，其他均不顯著（P＜0.05），可以看出這些因素影響著粒徑大小和包封率的高低，而B和C的交互作用對粒徑影響比較大。因此，通過對試驗因素優(yōu)化有利于設計形成粒徑小且高封率高的納米粒。此外，工藝參數對粒徑和包封率影響大小依次為：B＞C＞A。

圖2 響應面圖為兩兩因素交互對粒徑和包封效率的綜合影響Fig.2 Response surface plots showing the individual and interactive effects of variables on the particle size and encapsulation efficiency

在模型中，當任一因素向響應曲線中點靠近時，粒徑尺寸從754 nm降至342.57 nm。當因素超過中點時，粒徑受到負向影響逐漸增大（圖2、表2），較低濃度的PGA有利于形成小的粒徑[23]。這可能是載藥納米粒在形成之前CS溶液呈連續(xù)凝膠狀，隨著PGA的加入，CS逐漸與PGA進行離子交聯形成納米粒，但PGA濃度升高，使PGA支鏈與CS進行橫向結合產生較大的納米粒[24]。

黑米花色苷納米粒的包封率隨所選3 種因素向響應曲線中點靠近而升高，包埋率在38.84%～52.11%范圍內增大，當3 種因素逐漸超過中點時，包封率開始降低，這與其影響粒徑的趨勢相同。PGA-CS質量比和黑米提取物質量濃度分別在2∶5和2 mg/mL附近時，可以獲得高包封率的載藥納米粒，隨著黑米提取物質量濃度升高則包封率降低[25]。然而，CS質量濃度與包封率之間并未呈現正相關性，這與Feng Chao等[23]的結論不同，這可能是CS分子質量不同導致的，低分子質量更有利于包封，而高分子質量載藥量高[26]。

此外，這些參數的用量也影響著粒徑與包封率之間的關系，如PGA-CS質量比決定粒徑的大小，但影響著包封率，而黑米提取物質量濃度決定包封率，也改變粒徑。粒徑較小時，隨著黑米提取物質量濃度的增大導致黑米花色苷納米粒的粒徑增大，包封率也相應提高，但濃度過高時不利于納米粒的穩(wěn)定反而影響包封率。因此，選取了粒徑最小、包封率最高為最佳優(yōu)化條件，最終選擇了CS質量濃度為0.8 mg/mL、PGA-CS質量比為7∶20和黑米提取物質量濃度為1.98 mg/mL作為后續(xù)研究的制備條件，粒徑預測值為341.9 nm，包封率預測值為51.55%。

2.2.2 響應面模型驗證

為了驗證模型的有效性，在最優(yōu)條件進行試驗預測。所得制備載藥納米粒的結果：平均粒徑為352.95 nm，包封率為50.90%，載藥量為4.77%，與預測值相符。預測值與實驗值之間的誤差均小于5%。因此，從響應面回歸模型可以準確地預測黑米花色苷納米粒的粒徑大小和封裝效率。

2.3 表征學分析

粒徑、Zeta電位和PDI是衡量納米粒性能評價的重要標準，理想情況下，制備納米粒應具有小的尺寸。Zeta電位值和PDI與分子穩(wěn)定性有關，Zeta電位值越小，越容易發(fā)生凝聚至有溶質析出，多分散系數PDI值越小，表明納米粒在溶液中分散效果越好，越穩(wěn)定[27-28]。在最優(yōu)制備條件，即CS質量濃度0.8 mg/mL、PGA-CS質量比7∶20、黑米提取物質量濃度1.98 mg/mL、pH 5.0和攪拌時間30 min時，測定黑米花色苷納米粒的平均粒徑為（352.95±6.42）nm，PDI為0.23±0.02，Zeta電位為（29.56±1.09）mV，這表明所制備的黑米花色苷納米粒尺寸小，在溶液中分散效果良好，電位較高且穩(wěn)定性好。

采用掃描電鏡對凍干后的黑米花色苷納米粒表面微觀結構進行觀察，并與空載納米粒比較。由圖3A可知，CS與聚谷氨酸通過離子凝膠作用形成，表面相對光滑平整，這是因為在凍干過程中內部中空的納米粒發(fā)生團聚效應從而緊密排列，與Liang Tisong等[29]采用CS和硫酸軟骨作為壁材制備納米粒在掃描電鏡下形態(tài)一致。在CS與PGA交聯過程中，黑米花色苷被包裹在多聚物內部，形成黑米花色苷納米粒，此外，由于離子交聯是個動態(tài)過程，有部分黑米花色苷可能吸附在多聚物表面，從而在掃描電鏡下其微觀結構表面粗糙、呈現多顆粒、不規(guī)則形狀（圖3B），這表明負載黑米花色苷的納米粒已經形成。

圖3 掃描電鏡下的空載納米粒（A）和黑米花色苷納米粒（B）Fig.3 Observation of nanoparticles (A) and black rice anthocyaninloaded nanoparticles (B) under SEM

2.4 黑米花色苷納米粒體外緩釋性研究

緩釋實驗能夠模擬生物活性物質在人體消化道中釋放情況，一方面衡量生物活性物質在胃腸液的穩(wěn)定性、耐受性，另一方面衡量生物活性物質在胃腸液中的釋放率，這對研究生物活性物質的運送及代謝至關重要，也是衡量納米粒性能及穩(wěn)定性的評價標準[30]。采用優(yōu)化后的工藝進行制備納米粒，按照1.3.3節(jié)方法進行離心，隨后將沉淀物放入真空冷凍干燥機處理獲得凍干的納米粒，分別對凍干后的黑米花色苷納米粒粉末及未包埋的黑米提取物進行胃腸液緩釋作用研究，結果如圖4所示。

圖4 黑米花色苷在禁食狀態(tài)下模擬胃腸道環(huán)境的釋放率Fig.4 Anthocyanins release percentage during incubation in simulated gastrointestinal fluids under fasting condition

在胃液中，未包埋的黑米花色苷釋放率為65.13%，而包埋后的黑米花色苷納米粒中花色苷釋放率顯著降低，僅為30.84%。這說明由CS和PGA通過靜電離子作用形成的聚合物，對包埋的黑米花色苷具有較好的緩釋能力，延緩黑米花色苷在胃中的釋放。在腸液中，黑米花色苷包埋前后的釋放率均出現了顯著下降，從花色苷的保留率上來看，未包埋的黑米花色苷遠低于黑米花色苷納米粒，這是因為花色苷在堿性條件容易發(fā)生降解[31]，而采用CS與PGA所構成的納米載體恰好可以改善這一劣勢。綜合來看，相比較未包埋的黑米花色苷，黑米花色苷納米粒在胃、腸液中釋放率分別減少52.65%、36.69%，這表明所制備的黑米花色苷納米粒具有明顯的緩釋效果，可以延緩黑米花色苷在胃腸液的釋放。

3 結 論

本研究通過單因素試驗和響應面試驗優(yōu)化CS/PGA包埋黑米花色苷的工藝，以包埋率和粒徑為指標，確定最佳工藝為CS質量濃度0.8 mg/mL、PGA-CS質量比7∶20、黑米提取物質量濃度1.98 mg/mL、pH 5.0和攪拌時間30 min，所制備的黑米花色苷納米粒包埋率為50.90%，載藥量為4.77%，粒徑為（352.95±6.42）nm，PDI為0.23±0.02，Zeta電位為（29.56±1.09）mV。采用二次模型擬合和驗證實驗表明該模型顯著且相關性高。通過掃描電鏡觀察黑米花色苷納米粒呈球形顆粒狀；模擬胃腸緩釋實驗顯示，黑米花色苷納米粒具有明顯的緩釋作用，這表明所制備的納米粒粒徑較小、分散穩(wěn)定、緩釋性能較好，具有較好的應用前景。