陳鳳霞，楊天偉，李杰慶，劉鴻高，范茂攀,*，王元忠

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650200；3.云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南 景洪 666100；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

云南地處云貴高原，地形地貌復(fù)雜多樣，山區(qū)面積比例大且高溫高濕的氣候孕育了豐富的野生菌資源[1]。美味牛肝菌是一種可食用的大型真菌，其肉質(zhì)鮮美、芳香四溢，具有較高的食用藥用價(jià)值，廣受消費(fèi)者喜愛[2-3]。菌類中富含多種礦質(zhì)元素，其富集能力與土壤中礦質(zhì)元素含量具有相關(guān)性[4-6]。礦質(zhì)元素是維持人體健康的必需營養(yǎng)元素[7]，如Ca是人體所需的基本營養(yǎng)素，99%存在于牙齒和骨骼中[8]；Fe主要用于氧運(yùn)輸，是多種人體代謝的重要物質(zhì)[9-10]；K和Na協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)外液量平衡，是人體中非常重要的電解質(zhì)[11]。野生食用菌對礦質(zhì)元素的富集能力通常高于其他微生物和植物類群，研究美味牛肝菌礦質(zhì)元素的富集能力，可為消費(fèi)者合理膳食與野生菌資源開發(fā)提供理論依據(jù)。

數(shù)據(jù)融合是將多個(gè)不同來源、不同種類的數(shù)據(jù)信息進(jìn)行優(yōu)化重組，分為低、中、高3 種融合方式，主要用于藥用植物研究及食品質(zhì)量評價(jià)[12-13]。光譜分析技術(shù)作為一種低成本、易操作、簡單快捷的新興技術(shù)，常用于野生食用菌品質(zhì)研究[14-16]。光譜分析結(jié)合數(shù)據(jù)融合策略可以實(shí)現(xiàn)不同信息間的優(yōu)勢互補(bǔ)，對多種光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行整合優(yōu)化，提高數(shù)據(jù)的有效性和整體性，在食品種類鑒別、質(zhì)量評價(jià)、產(chǎn)地溯源、摻假等研究中較為廣泛。裴藝菲等[17]在重樓產(chǎn)地鑒別研究中采用多光譜數(shù)據(jù)融合與化學(xué)計(jì)量學(xué)。Wang Ye等[18]融合了近紅外和紫外-可見光譜數(shù)據(jù)鑒定石斛屬植物。李秀萍等[19-20]在野生牛肝菌鑒別中使用光譜信息數(shù)據(jù)融合。Li Yang等[21]利用近紅外、中紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)與數(shù)據(jù)融合對橄欖油摻假問題進(jìn)行研究。張鈺等[22]結(jié)合礦質(zhì)元素與紅外光譜對美味牛肝菌進(jìn)行產(chǎn)地鑒別，結(jié)果表明中級融合是一種有效方法。Qi Luming等[2]對美味牛肝菌產(chǎn)地溯源研究中使用了元素?cái)?shù)據(jù)、多光譜信息進(jìn)行數(shù)據(jù)融合。Yao Sen等[23]對牛肝菌進(jìn)行產(chǎn)地鑒別中使用了傅里葉變換紅外光譜學(xué)、紫外-可見光譜數(shù)據(jù)融合與多元統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，數(shù)據(jù)融合鑒別效果比單一光譜更佳。

本實(shí)驗(yàn)測定了云南6 個(gè)產(chǎn)地美味牛肝菌及土壤中的9 種礦質(zhì)元素含量，結(jié)合傅里葉變換近紅外光譜與紫外-可見光譜，根據(jù)礦質(zhì)元素富集系數(shù)（bioaccumulation factor，BCF）與偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）對美味牛肝菌進(jìn)行礦質(zhì)元素、富集能力研究，建立準(zhǔn)確快速的產(chǎn)地鑒別模型，以期為促進(jìn)云南高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)及合理開發(fā)持續(xù)利用資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

79 份美味牛肝菌樣品采自云南6 個(gè)不同產(chǎn)地，每個(gè)產(chǎn)地均收集子實(shí)體附近的土壤樣品。詳細(xì)情況見表1。將采集的土壤樣品放置于室內(nèi)通風(fēng)處進(jìn)行風(fēng)干并去除植物殘?bào)w及石塊，粉碎過100 目篩，使用磨口塞廣口瓶保存?zhèn)溆?。美味牛肝菌樣品采集后，用陶瓷刀刮去表面泥土、雜草、枯葉等雜物并清洗干凈，50 ℃至12 h烘干，粉碎過100 目篩至粒度為1 mm后置于自封袋。

表1 不同產(chǎn)地美味牛肝菌樣品信息Table 1 Information about B. edulis samples tested in this study

茶葉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW07605） 地礦部物化探研究所；土壤成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW07406）、菠菜標(biāo)準(zhǔn)（GBW10015） 地球物理地球化學(xué)勘查研究所；65%硝酸（優(yōu)級純）、30%過氧化氫（分析純）、氯仿（分析純）、48%氫氟酸（分析純）、高氯酸（分析純）、鹽酸（優(yōu)級純）、9 種礦質(zhì)元素標(biāo)準(zhǔn)溶液 濟(jì)南眾標(biāo)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

傅里葉變換近紅外光譜儀 美國Thermo Fisher公司；ICPE-9000電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀、TU-1901紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；Mars6微波消解儀 美國CEM公司；AR1140型萬分之一分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 美味牛肝菌子實(shí)體礦質(zhì)元素含量測定

用萬分之一天平準(zhǔn)確稱取已烘干打粉后的美味牛肝菌樣品（300±0.10）mg，置于消解罐中，加入5 mL硝酸和2 mL過氧化氫，常溫消解1 h后放入微波消解儀，消解分為4 步驟，調(diào)至升溫時(shí)間均為5 min、溫度在20～110、110～140、140～160、160～180 ℃，維持時(shí)間5 min，功率為1 800 kW。消解后冷卻定容至25 mL，待測。相同方法制備空白溶液，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.2 土壤礦質(zhì)元素含量測定

稱取（100±0.10）mg土壤樣品置于燒杯，加入5 mL硝酸和1 mL高氯酸并進(jìn)行加熱，待出現(xiàn)大量白煙時(shí)開始冷卻。冷卻后加入8 mL氫氟酸和0.5 mL高氯酸繼續(xù)加熱直至白煙消失，加入10 mL鹽酸，待完全溶解后定容至25 mL，待測。每個(gè)樣品重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用10%硝酸溶液配制成0.00、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00 μg/mL的Mn、Cu、Fe、Zn、Mg、K、Na、P、Ca元素標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，建立茶葉標(biāo)準(zhǔn)物元素曲線和土壤標(biāo)準(zhǔn)物元素曲線。

1.3.4 近紅外光譜采集

稱取（20.00±0.50）g樣品混合均勻，置于玻璃器皿進(jìn)行壓縮，用傅里葉變換近紅外光譜儀進(jìn)行掃描，采集范圍10 000～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，信號累計(jì)掃描64 次，重復(fù)3 遍取平均值。

1.3.5 紫外光譜采集

稱取（100.00±0.20）mg樣品與10 mL氯仿溶劑，搖勻后超聲40 min，使用3 層濾紙過濾，提取清液待測。TU-1901紫外-可見分光光度計(jì)自檢預(yù)熱1 h后通過空白對照扣除背景值，并采集200～400 cm-1范圍的光譜。每個(gè)樣品掃描3 遍并取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用OMNIC8.0光譜處理軟件對近紅外光譜進(jìn)行自動(dòng)基線校正和吸光度轉(zhuǎn)換，UVProbe 2.34紫外光譜處理軟件對紫外光譜進(jìn)行處理，SIMCA13.0對近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑（Savitzky-Golay，SG）+二階導(dǎo)數(shù)（second derivatives，2D）、SG+標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換（standard normal variables，SNV）；對紫外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行多元散射校正（multiple scattering correction，MSC）+2D、SG+2D、SG+MSC、SNV+2D等預(yù)處理，將最佳預(yù)處理后的數(shù)據(jù)用Matlab2018a進(jìn)行Kennard-Stone算法篩選2/3訓(xùn)練集和1/3預(yù)測集。通過SIMCA13.0建立PLS-DA單光譜分類模型和數(shù)據(jù)融合分類模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 礦質(zhì)元素的測定

采用茶葉標(biāo)準(zhǔn)物（GBW07605）、菠菜標(biāo)準(zhǔn)物（GBW10015）和土壤成分分析標(biāo)準(zhǔn)物（GBW07406）對方法準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。由表2可知，茶葉標(biāo)準(zhǔn)物和土壤標(biāo)準(zhǔn)物與茶葉測定值和土壤測定值接近，其中茶葉中元素回收率在94%～101%之間，部分菠菜中元素回收率在96%～99%之間，土壤中元素回收率在94%～107%之間，表明測定的礦質(zhì)元素在國家標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)，此方法具有可靠性。

表2 茶葉標(biāo)準(zhǔn)物（GBW07605）、菠菜標(biāo)準(zhǔn)物（GBW10015）和土壤成分分析標(biāo)準(zhǔn)物（GBW07406）的元素測定結(jié)果Table 2 Measured mineral element contents of tea standard GBW07605 and spinach standard GBW10015 and soil component analysis standard GBW07406

2.2 礦質(zhì)元素分析

BCF也稱生物富集因子，是植物與土壤中礦質(zhì)元素含量的比值，用于評價(jià)植物對礦質(zhì)元素的富集能力[24]。表3為6 個(gè)產(chǎn)地土壤和美味牛肝菌的9 種元素含量平均值以及美味牛肝菌對土壤中元素的BCF。美味牛肝菌中礦質(zhì)元素的BCF為子實(shí)體中元素含量的平均值除以土壤中同一元素的含量，BCF＞1表明子實(shí)體中元素的富集能力較強(qiáng)。表3中，6 個(gè)產(chǎn)地土壤中Fe含量最高，來自文山市東山鄉(xiāng)的土壤中Fe含量已達(dá)到48 323.75 mg/kg，可能與云南富含F(xiàn)e金屬離子的酸性土壤有關(guān)。美味牛肝菌中K和P含量最高，范圍在10 204.71～13 734.32 mg/kg和4 773.35～6 240.71 mg/kg，表中除了云南省昆明市安寧八街鎮(zhèn)Zn的BCF小于1外，5 個(gè)產(chǎn)地K、P、Zn的BCF值均大于1，文山市東山鄉(xiāng)美味牛肝菌P的BCF值最高，為4.63，結(jié)果顯示美味K、P、Zn比其他元素更易富集在美味牛肝菌中。如表所示，6 個(gè)產(chǎn)地Cu和Na的BCF值基本小于1，來自云南省大理市彌渡和云南省文山市東山鄉(xiāng)的美味牛肝菌對土壤中Cu或Na的富集能力較強(qiáng)，BCF＞1。說明不同產(chǎn)地美味牛肝菌對土壤中礦質(zhì)元素的富集能力有所差異。美味牛肝菌中富含多種人體所需的常量元素與微量元素，K、P、Fe含量最為豐富，在10 204.71～13 734.32、4 773.35～6 240.71、411.93～1 536.50 mg/kg范圍之間，其中來自昆明市安寧八街鎮(zhèn)與保山市隆陽區(qū)的美味牛肝菌樣品中P、Fe和K含量最高。其次是Mg、Na、Ca、Zn、Cu、Mn。含量較少的元素為Mn和Cu，范圍在23.14～37.24、33.54～43.43 mg/kg之間。云南省文山市東山鄉(xiāng)的美味牛肝菌中Na含量是來自云南省昆明市安寧八街鎮(zhèn)的美味牛肝菌Na含量的20.70 倍，不同產(chǎn)地美味牛肝菌樣品相同元素之間具有差異顯著性，可能與不同產(chǎn)地的土壤與生長環(huán)境有關(guān)。

2.3 光譜分析

圖1為6 個(gè)產(chǎn)地美味牛肝菌的近紅外和紫外平均光譜圖，圖1a是近紅外光譜圖，波數(shù)范圍在4 005～5 388 cm-1和5 780～8 461 cm-1之間有吸收峰，在強(qiáng)吸收峰范圍內(nèi)，4 358 cm-1附近可能為—CH2多糖伸縮振動(dòng)，4 628～4 981 cm-1范圍附近可能與N之間H、C＝O、O之間H有關(guān)[22]。6 個(gè)產(chǎn)地的美味牛肝菌近紅外光譜峰形大致相似，但吸收強(qiáng)度明顯且可進(jìn)行產(chǎn)地區(qū)分。圖1b為紫外光譜圖，根據(jù)光譜吸收峰特征，截取200～450 nm范圍內(nèi)的波長，提高紫外數(shù)據(jù)對產(chǎn)地鑒別的準(zhǔn)確性。紫外光譜范圍在300～450 nm之間無光譜明顯吸收峰，表明樣品大致成分相同。強(qiáng)吸收峰范圍在255～300 nm之間，具有指紋及化學(xué)成分差異，能有效進(jìn)行產(chǎn)地分類鑒別。

表3 不同產(chǎn)地美味牛肝菌和土壤礦質(zhì)元素含量及BCFTable 3 Contents and enrichment coefficients of mineral elements in B. edulis and soil from different producing areas

圖1 6個(gè)產(chǎn)地美味牛肝菌的近紅外平均光譜（a）和紫外平均光譜（b）圖Fig.1 Near infrared (a) and UV-visible (b) spectra of B. edulis from six producing areas

2.4 光譜預(yù)處理結(jié)果

表4 近紅外光譜與紫外光譜預(yù)處理結(jié)果Table 4 Pretreatment of near infrared and UV-visible spectra

校正均方根誤差（root mean square error of calibration，RMSEC）、交叉驗(yàn)證均方根誤差（root mean square error of cross validation，RMSECV）為模型參數(shù)，參數(shù)值越接近0說明模型效果越好。表4為近紅外和紫外光譜的數(shù)據(jù)預(yù)處理PLS-DA結(jié)果。選取特征值＞1的主成分個(gè)數(shù)，表中顯示近紅外最佳預(yù)處理方法為SG+2D，RMSEC與RMSECV分別為0.074 07和0.261 92，訓(xùn)練集正確率為100.00%，預(yù)測集正確率為88.46%。紫外最佳預(yù)處理方法為SG+MSC，提取5 個(gè)主成分，RMSEC與RMSECV為0.261 70和0.275 83。訓(xùn)練集正確率為84.91%，預(yù)測集正確率為96.15%。將最佳近紅外、紫外光譜預(yù)處理結(jié)果進(jìn)行保留，作為建立單一光譜產(chǎn)地分類3D模型的數(shù)據(jù)。

2.5 美味牛肝菌PLS-DA光譜產(chǎn)地分類

PLS-DA是一種高維數(shù)據(jù)分析方法。此方法對不同處理樣本的特性進(jìn)行訓(xùn)練，對照其訓(xùn)練集與預(yù)測集檢驗(yàn)可信度，常結(jié)合光譜分析技術(shù)用于食品安全檢測[25-26]。Yulia等[27]在咖啡摻假研究中使用了紫外光譜與PLS-DA方法，結(jié)果顯示，此方法能準(zhǔn)確、有效的鑒別摻假咖啡。Wang Ye等[28]采用傅里葉紅外光譜、礦質(zhì)元素結(jié)合PLS-DA對牛肝菌進(jìn)行種類與產(chǎn)地分析。李運(yùn)等[29]在三七產(chǎn)地鑒別溯源研究中使用紅外光譜信息結(jié)合PLS-DA，為三七質(zhì)量控制提供方法。圖2為6 個(gè)產(chǎn)地PLS-DA產(chǎn)地分類3D模型圖，由圖2a可知，來自云南省保山市隆陽區(qū)的美味牛肝菌樣品可以很好地聚在一起，其他產(chǎn)地美味牛肝菌樣品大致可以進(jìn)行區(qū)分，來自云南省玉溪市易門銅廠的樣品聚為兩類，云南省昆明市安寧八街鎮(zhèn)與云南省文山市東山鄉(xiāng)的樣品聚成一團(tuán)，無法進(jìn)行產(chǎn)地區(qū)分。云南省大理市彌渡采集的9 個(gè)樣品基本聚為一類，云南省迪慶藏族自治州采集的17 個(gè)樣品基本聚為一類，但個(gè)別樣品比較零散。由圖2b可知，相同產(chǎn)地美味牛肝菌樣品不能很好的聚在一起，云南省玉溪市易門銅廠一部分樣品聚類在云南省保山市隆陽區(qū)，云南省昆明市安寧八街鎮(zhèn)樣品聚類在其他幾個(gè)產(chǎn)地，云南省迪慶藏族自治州采集的樣品較為分散，部分樣品分類錯(cuò)誤，云南省大理市彌渡采集的樣品基本可以聚在一起，但存在個(gè)別聚團(tuán)分散。表明紫外光譜不能作為理想的產(chǎn)地鑒別數(shù)據(jù)。圖2c為近紅外光譜和紫外光譜的低級數(shù)據(jù)融合，其中提取主成分12 個(gè)，RMSEE和RMSECV分別為0.054 621和0.233 757，模型訓(xùn)練集正確率為100.00%，預(yù)測集正確率為88.46%，與單一光譜中近紅外分類效果相同，由圖2c可知，云南省保山市隆陽區(qū)的美味牛肝菌樣品聚類效果最好，但其他產(chǎn)地聚類效果不佳，其中云南省玉溪市易門銅廠、云南省昆明市安寧八街鎮(zhèn)、云南省文山市東山鄉(xiāng)分類聚為一團(tuán)，產(chǎn)地區(qū)分不明顯。來自云南省迪慶藏族自治州部分樣品分類錯(cuò)誤。圖2d為近紅外光譜和紫外光譜的中級數(shù)據(jù)融合，提取5 個(gè)主成分，RMSEE和RMSECV分別為0.199 75和0.291 536，模型訓(xùn)練集正確率100.00%，預(yù)測集正確率為92.31%，模型經(jīng)過HottellingT2檢測法進(jìn)行準(zhǔn)確性檢驗(yàn)，其中為13.046 1，模型均未超過置信區(qū)間，表明模型準(zhǔn)確可靠。圖2d中6 個(gè)產(chǎn)地的不同樣品聚類明顯，其中3 個(gè)產(chǎn)地的樣品聚為一類，并與其他產(chǎn)地樣品聚團(tuán)隔離。云南省玉溪市易門銅廠的樣品中有少數(shù)樣品聚類在云南省昆明市安寧八街鎮(zhèn)，云南省文山市東山鄉(xiāng)和云南省昆明市安寧八街鎮(zhèn)樣品聚團(tuán)靠近，但相同產(chǎn)地樣品形成聚團(tuán)。根據(jù)圖2分析表明，中級數(shù)據(jù)融合是進(jìn)行美味牛肝菌產(chǎn)地溯源研究的最佳方法。

圖2 PLS-DA的單一光譜與數(shù)據(jù)融合后的產(chǎn)地分類3D圖Fig.2 3D map showing geographical origin classification using monospectral data fusion combined with PLS-DA

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用6 個(gè)產(chǎn)地美味牛肝菌及土壤樣品，對美味牛肝菌中礦質(zhì)元素與土壤中礦質(zhì)元素進(jìn)行富集規(guī)律研究及礦質(zhì)元素分析，結(jié)合近紅外光譜和紫外光譜建立PLS-DA的3D模型產(chǎn)地分類圖。結(jié)果表明，文山市東山鄉(xiāng)土壤Fe含量最高，可能與云南高溫高濕環(huán)境導(dǎo)致的酸性土壤有關(guān)；美味牛肝菌中含有大量K和P；6 個(gè)產(chǎn)地的Zn、K、P平均BCF為1.05、2.14、3.70，顯示土壤中的Zn、K、P元素更易富集在美味牛肝菌內(nèi)，不同產(chǎn)地美味牛肝菌對土壤中相同元素的富集能力不同；單一光譜中，近紅外光譜的產(chǎn)地分類效果比紫外光譜更佳；中級數(shù)據(jù)融合中模型訓(xùn)練集正確率100%，預(yù)測集正確率92.31%，分類效果明顯，可以作為美味牛肝菌產(chǎn)地分類的最佳方法。