周若浩，呂岱竹，馬 晨，梁水連,3，相壇壇，王明月,3,*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，海南 ?？?571101；3.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南 ?？?570228）

氯苯胺靈是一種氨基甲酸酯類除草劑，其作用機理是抑制β-淀粉酶的活性、抑制植物RNA和蛋白質(zhì)的合成、干擾氧化磷酸化和光合作用、破壞細胞分裂，常用于防除一年生禾本科雜草和少數(shù)一年生闊葉雜草[1]。氯苯胺靈除草效力強、持效期長、對作物本身損害小，在提高果蔬作物產(chǎn)量、增加產(chǎn)品效益方面發(fā)揮了重要作用[2]。但是氯苯胺靈在果蔬種植中的不當或過量使用易造成果蔬食品中農(nóng)藥高殘留問題，并可隨著食物鏈和水循環(huán)影響草食性動物以及人體健康[3-4]。歐盟的一項消費者風(fēng)險評估指標表明，氯苯胺靈對消費者和非靶標節(jié)肢動物具有潛在的內(nèi)分泌干擾特性，且具有嚴重的慢性風(fēng)險，決定不再續(xù)展氯苯胺靈，但我國還未采取相應(yīng)措施[5-9]。因此，建立一種動植物源食品中氯苯胺靈殘留量的分析方法十分必要，可為完善氯苯胺靈的殘留限量標準、評估氯苯胺靈的膳食攝入風(fēng)險提供科學(xué)依據(jù)。

氣相色譜法以及氣相色譜-質(zhì)譜法作為農(nóng)藥殘留檢測手段在食品安全檢測方面發(fā)揮著越來越重要的作用[10-22]。目前氯苯胺靈的檢測方法主要為反相高效液相色譜法[23-25]、氣相色譜法[26]和氣相色譜-質(zhì)譜法[27]等，已有報道的檢測樣品主要為馬鈴薯、土壤和生活用水[28-34]等，尚鮮見其在動植物源食品中殘留檢測的相關(guān)報道。但現(xiàn)有的前處理技術(shù)實驗步驟繁瑣、費時費力，不適用于大批量樣品的檢測。本研究采用QuEChERS（quick, easy, cheap,effective, rugged, safe）及固相萃取法對動植物源食品中的氯苯胺靈進行提取凈化，使用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）進行分析，操作簡便、回收率高、重復(fù)性好，適用于大批量樣品檢測，以期為動植物源食品中氯苯胺靈的殘留檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香蕉、牛肉、純牛奶 海南海口市售。香蕉全果切段后用勻漿機勻漿至黏稠半固體狀，牛肉樣品用均質(zhì)機絞碎至無明顯肉塊程度，將處理好好的樣品置于-20 ℃冷凍保存，牛奶樣品常溫保存，待測。

99.5 %氯苯胺靈標準品 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈、正己烷、丙酮、甲醇（均為色譜純）賽默飛世爾科技有限公司；分散固相萃取填料N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）、C18，固相萃取C18柱、NH2柱和Florisil硅土柱 上海安譜實驗科技股份有限公司；實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

TRACE 1300氣相色譜儀、TSQ9000三重四極桿質(zhì)譜儀 賽默飛世爾科技有限公司；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng) 德國默克密理博公司；CR22N落地式高速冷凍離心機 日本日立公司；AL204電子天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UMV-2多管旋渦混合器 北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；R-210控溫控壓全自動旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海豫康科教儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

1.3.1.1 植物源樣品

稱取10 g勻漿好的樣品于50 mL塑料離心管，加入20 mL正己烷和2 g氯化鈉，以2 500 r/min渦旋6 min，以8 000 r/min離心5 min。取上清液5 mL，加入100 mg PSA凈化，以2 500 r/min渦旋10 min，以8 000 r/min離心5 min，將所有溶液轉(zhuǎn)移至50 mL圓底燒瓶中，于40 ℃水浴鍋中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用1 mL正己烷溶解，過0.22 μm濾膜，轉(zhuǎn)入進樣小瓶中待測。

1.3.1.2 動物源樣品

稱取10 g（牛奶取10 mL）勻漿好的樣品于50 mL塑料離心管，加入20 mL正己烷和2 g氯化鈉，以2 500 r/min渦旋6 min，以8 000 r/min離心5 min。取上清液5 mL，轉(zhuǎn)移至已被活化的NH2固相萃取柱中，待凈化完畢后用5 mL正己烷作為淋洗液洗柱，收集全部流出液于50 mL圓底燒瓶中，于40 ℃水浴鍋中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用1 mL正己烷溶解，過0.22 μm濾膜，轉(zhuǎn)入進樣小瓶中待測。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：HP-5MS毛細管柱（0.25 mm×60 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度100 ℃以10 ℃/min的速率升至200 ℃，保持1 min，以30 ℃/min的速率升至280 ℃，保持2 min；載氣（He）流速1.0 mL/min，進樣量1 μL；進樣口溫度：250 ℃：進樣方式：無分流進樣。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電子電離源，電離電壓：70 V；離子源溫度：300 ℃；傳輸線溫度溫度：280 ℃；定性離子m/z（碰撞能量）：213（14 eV）；定量離子：127（14 eV），171（6 eV）。

1.3.4 基質(zhì)標準溶液的配制及標準曲線繪制

基質(zhì)效應(yīng)在農(nóng)藥殘留分析中不可避免，不同農(nóng)藥在不同的基質(zhì)中效應(yīng)不同，可能會影響農(nóng)藥殘留量的測定。本實驗通過對溶劑曲線和基質(zhì)曲線進行比較，發(fā)現(xiàn)以溶劑曲線作為定量標準時，氯苯胺靈在植物源性食品中的加標回收率在118.3%～127.4%范圍內(nèi)，在動物源性食品中的加標回收率在55.6%～71.3%范圍內(nèi)，這說明氯苯胺靈在植物源性食品基質(zhì)中呈現(xiàn)基質(zhì)增強效應(yīng)，在動物源性食品中呈現(xiàn)基質(zhì)減弱效應(yīng)。以基質(zhì)標準曲線進行定量時，氯苯胺靈的加標回收率在80.6%～107.8%范圍內(nèi)，滿足農(nóng)藥殘留檢測要求，因此均需以基質(zhì)標準曲線進行定量。

稱取適量氯苯胺靈標準品，用正己烷定容至10 mL，得到1 000 μg/mL的氯苯胺靈標準儲備液，用正己烷逐級稀釋至質(zhì)量濃度為1 μg/mL，再用空白基質(zhì)提取液分別稀釋至0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL，以氯苯胺靈質(zhì)量濃度為橫坐標，對應(yīng)的質(zhì)譜峰面積為縱坐標，繪制基質(zhì)標準曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化

氯苯胺靈為弱極性化合物，故選用弱極性的HP-5MS毛細管柱（0.25 mm×60 mm，0.25 μm）進行分離。色譜條件優(yōu)化的主要目的是在獲得良好化合物峰形的基礎(chǔ)上盡量縮短分析時間，對柱子的升溫程序進行選擇，實驗得出：初始溫度100 ℃，以10 ℃/min速率升至200 ℃，保持1 min，以30 ℃/min的速率升至280 ℃，保持2 min條件能得到良好的氯苯胺靈峰形，為了提高檢出限又要防止進樣飽和，選擇進樣量為1 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用單離子檢測掃描（single ion monitoring，SIM）和選擇反應(yīng)監(jiān)測（selective reaction monitoring，SRM）兩種模式對氯苯胺靈進行檢測分析。通過比較，發(fā)現(xiàn)采用SRM模式比采用SIM模式靈敏度更高、擇性更好，抗干擾能力更強，更適合于復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥殘留的檢測。在SRM模式下，進行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。設(shè)定不同的碰撞能量對母離子進行轟擊得到子離子二級質(zhì)譜掃描圖，從中選擇響應(yīng)值最高的2 個碎片離子作為子離子，改變碰撞電壓優(yōu)化各組母離子和子離子。最后選擇響應(yīng)最好的組合，確定氯苯胺靈SRM的最佳質(zhì)譜條件，見表1。

表1 氯苯胺靈質(zhì)譜條件Table 1 Mass spectrometric conditions for chlorpheniramine

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化

本研究通過比較不同提取溶劑（正己烷、丙酮、乙腈）下氯苯胺靈的回收率，以確定檢測氯苯胺靈的最優(yōu)提取溶劑，結(jié)果見圖1。本研究考察不同提取溶劑對于動植物源食品中氯苯胺靈回收率的影響，發(fā)現(xiàn)采用丙酮進行提取時回收率在74%～81%之間，可能是由于氯苯胺靈在丙酮中溶解度較小。利用正己烷和乙腈作為提取溶劑時回收率分別在98%～102%之間及89%～97%之間，穩(wěn)定性較好，均可作為提取溶劑，考慮到正己烷回收率更準確，因此選擇正己烷作為提取溶劑。

圖1 提取溶劑對氯苯胺靈回收率的影響Fig.1 Recoveries of chlorpheniramine using different extraction solvents

2.2.2 提取時間的優(yōu)化

樣品經(jīng)溶劑提取，提取時間不同也會影響農(nóng)藥的回收率。本研究比較同一種溶劑不同提取時間下對氯苯胺靈回收率的影響，結(jié)果如圖2所示。在分別加標量為0.1、0.2、0.3 μg/mL氯苯胺靈的情況下，在提取時間為2 min時，樣品回收率偏低，表明樣品中的農(nóng)藥未被充分提取。隨著提取時間延長，氯苯胺靈的回收率先上升后趨于平緩，約在6 min達到最大回收率，因此選擇提取時間為6 min。

圖2 提取時間對氯苯胺靈回收率的影響Fig.2 Recoveries of chlorpheniramine at different extraction times

2.2.3 分散固相萃取填料的選擇

圖3 凈化劑種類和用量對氯苯胺靈回收率的影響Fig.3 Recoveries of chlorpheniramine as a function of purifier dosage using different purifiers

各種分散固相萃取填料對樣品的凈化作用各不相同，本研究比較不同分散固相萃取填料凈化對果蔬中氯苯胺靈回收率的影響。由圖3可知，隨著各種不同填料用量的增加，氯苯胺靈的回收率基本保持先增加后減少的規(guī)律。C18及GCB填料用量過大時，氯苯胺靈回收率較低，這可能是對目標物也產(chǎn)生了一定的吸附作用。因此選擇PSA填料作為凈化劑，經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)PSA填料在100 mg用量時效果最佳，故選擇100 mg PSA填料作為凈化劑。

2.2.4 固相萃取柱的選擇

固相萃取柱具有靈敏度高、重復(fù)性好、可批量處理等優(yōu)點，比較C18柱、NH2柱和Florisil柱凈化對動物食品中氯苯胺靈回收率的影響，結(jié)果如圖4所示，C18柱對于氯苯胺靈的吸附能力過強，導(dǎo)致氯苯胺靈回收率偏低，在3 種固相萃取柱的凈化下，氯苯胺靈回收率在85.8%～103.5%，NH2柱對氯苯胺靈凈化效果好，回收率高，因此選用NH2柱進行凈化。

圖4 固相萃取柱對氯苯胺靈回收率的影響Fig.4 Recoveries of chlorpheniramine using different SPE columns

2.3 線性范圍、方法檢出限及定量限

為了消除基質(zhì)效應(yīng)對定量結(jié)果的影響，實驗采用空白樣品提取液配制基質(zhì)匹配標準溶液。在以上條件下，以氯苯胺靈質(zhì)量濃度為橫坐標（x），質(zhì)譜峰面積（y）為縱坐標，線性關(guān)系為y=2.39×108x-1.885×106，R2=0.999 7，在0.01～0.5 μg/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好；以空白的牛肉基質(zhì)提取液配制基質(zhì)標準溶液，線性關(guān)系為y=1.29×105x-6.23×105，R2=0.999 3，在0.03～1 μg/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好；以空白的牛奶基質(zhì)溶液配制基質(zhì)標準溶液，線性關(guān)系為y=1.50×105x-1.50×105，R2=0.999 5，在0.03～1 μg/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。分別以最低限加標樣品的基線噪音值，當加標量為1.0 μg/kg時，氯苯胺靈特征峰峰高為27 491，基線噪音峰高為18 575，計算得出信噪比RSN=1.48，按照RSN=3計算得氯苯胺靈的檢出限為2.0 μg/kg，按照RSN=10計算得氯苯胺靈定量限為6.7 μg/kg。

2.4 回收率與相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）實驗結(jié)果

稱取不含目標物的動植物源食品樣品，在植物源食品香蕉中分別添加0.02、0.04、0.4 mg/kg 3 個添加量的氯苯胺靈標準溶液，在動物源食品中分別添加0.01、0.02、0.1 mg/kg 3 個添加量水平的氯苯胺靈標準溶液，按照所建立的方法進行前處理以及GC-MS/MS測定。每份樣品平行測定5 次，考察方法的回收率和精密度。3 種基質(zhì)中方法回收率和RSD如表2所示，其在植物源食品香蕉中方法回收率為96.1%～105.7%，RSD為2.3%～6.5%；在動物源食品牛肉中方法回收率為80.6%～102.8%，RSD為5.7%～8.5%；在動物源食品牛奶中方法回收率在95.0%～107.8%，RSD為7.5%～8.4%，可見該方法具有良好的可靠性。

表2 動植物源食品中氯苯胺靈的回收率和精密度（n=5）Table 2 Recoveries and precision of chlorpheniramine from actual food samples (n= 5)

2.5 實際樣品檢測結(jié)果

從海南海口本地農(nóng)貿(mào)市場分別隨機抽取20 份動植物源食品樣品，對其進行氯苯胺靈殘留檢測。在一份植物源樣品中檢出氯苯胺靈，含量為19.4 μg/kg；在一份動物源性樣品中檢出氯苯胺靈，含量為12.6 μg/kg，其余樣品均未檢出氯苯胺靈。

3 結(jié) 論

本研究開發(fā)動植物源食品中氯苯胺靈的檢測分析方法，以動植物源食品基質(zhì)提取液配制的氯苯胺靈標準溶液作為定量標準，減少了基質(zhì)效應(yīng)對實驗結(jié)果的影響，基質(zhì)標準溶液在檢測范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)高于0.999。同時優(yōu)化前處理過程中的提取和凈化方法，回收率在80.6%～107.8%之間，RSD為2.3%～8.5%，操作簡便、重復(fù)性好，適用于批量樣品檢測，可很好滿足動植物源食品中氯苯胺靈殘留的檢測分析，為完善氯苯胺靈的殘留限量標準、評估氯苯胺靈的膳食攝入風(fēng)險提供了科學(xué)依據(jù)。