徐 磊 戴玉淇 王 心 許 歡 高 珊 陳曉明

(淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，淮安 223003)

薏米又名薏苡仁、六谷米等，禾本科，一種典型的藥食兩用資源，享有“禾本科之王”的美譽。薏米中不僅含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)[1]、膳食纖維[2]，還含有大量的多酚[3]、黃酮[4]、谷甾醇[5]等生物活性成分。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為薏米具有滋補、潤膚、祛濕、消痛等功效[5]。近年來的研究還表明，薏米具有抗炎[6]、抗腫瘤[7]等多種藥理活性。

菌酶協(xié)同發(fā)酵即在微生物發(fā)酵的同時加入一定量的蛋白酶、碳水化合物酶等酶制劑，可克服單一利用微生物發(fā)酵產(chǎn)酶不足的問題，現(xiàn)已在功能食品、生物飼料等行業(yè)得到廣泛的應(yīng)用[8, 9]。姚曉紅等[10]研究發(fā)現(xiàn)菜籽粕經(jīng)枯草芽孢桿菌和中性蛋白酶協(xié)同發(fā)酵后，其硫代葡萄糖苷、單寧和植酸的含量顯著降低，而多肽、鈣和磷的含量顯著提高。本課題組前期試驗結(jié)果表明，蛋白酶協(xié)同發(fā)酵可顯著提高脫脂薏米水提取液中生物活性成分含量，增強其功能活性[11]。碳水化合物酶是對一大類具有降解、修飾和生成糖苷鍵功能的酶的統(tǒng)稱[12]，研究發(fā)現(xiàn)碳水化合物酶可促進大米麩皮中酚類物質(zhì)的釋放[13]，提高碎玉米粒中蛋白的提取率[14]。Du等[15]研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯渣經(jīng)果膠酶和植物乳桿菌協(xié)同發(fā)酵后，可縮短其干燥時間，提高其防腐性。

脫脂薏米是薏米提油后的副產(chǎn)物，仍含有大量的蛋白質(zhì)、酚類等物質(zhì)，目前主要作為飼料使用或直接拋棄，此在一定程度上限制了加工企業(yè)的效益提升[3]。本研究以脫脂薏米為原料，在干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)發(fā)酵過程中分別添加木聚糖酶、纖維素酶、果膠酶和葡聚糖酶，考察了碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵對脫脂薏米水提取液pH、TTA、游離氨基酸、多肽、多酚、抗氧化活性及酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響，以期闡明碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵對脫脂薏米水提取液品質(zhì)的影響，為薏米加工副產(chǎn)物的高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

干酪乳桿菌(1011CFU/g)；木聚糖酶(600U/mg)、纖維素酶(400 U/mg)、果膠酶(500 U/mg)、葡聚糖酶(50 U/mg)；乙腈：色譜純；6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸(Trolox)、2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)等均為分析純。

脫脂薏米：本實驗室自制。新鮮薏米購自貴州鑫龍食品開發(fā)有限公司，去雜粉碎過60目篩，正己烷脫脂(1∶8)，40 ℃烘干24 h，粉碎過80目篩，4 ℃貯藏備用。

1.1.2 實驗儀器

HH-4恒溫水浴鍋，ZQLY-180V立式全溫振蕩培養(yǎng)箱，5810R冷凍離心機，SCIENTZ-18N普通型冷凍干燥機，TU-1810紫外可見分光光度計，Agilent 1100氨基酸自動分析儀，LC-20AT高效液相色譜儀。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵脫脂薏米及其水提液的制備

取30 g脫脂薏米置于100 mL燒杯，然后分別加入20 mL去離子水、0.6 g干酪乳桿菌和2 000 U糖化酶(木聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、葡聚糖酶)，攪拌均勻。于37 ℃恒溫密閉發(fā)酵48 h，之后將樣品冷凍干燥，粉碎過80目篩，4 ℃貯藏備用。單獨發(fā)酵時只接種干酪乳桿菌而不添加任何糖化酶。

準(zhǔn)確稱取3 g發(fā)酵脫脂薏米，按料液比1∶10加入去離子水，25 ℃恒溫振蕩提取2 h，3 500 g離心10 min，收集上清液，此即為脫脂薏米水提取液。

1.2.2 pH和TTA測定

采用pH計測定水提取液的pH值；采用酸堿滴定法測定水提取液的TTA，結(jié)果表示為mg/mL(以乳酸計)[16]。

1.2.3 游離氨基酸組成測定

參考GB/T 5009.124—2016的方法略作修改，取適當(dāng)體積的水提取液與10%三氯乙酸等體積混合，10 000 g離心15 min，取上清液過0.45 μm的微孔濾膜后上氨基酸自動分析儀進行游離氨基酸組成測定。

1.2.4 多肽分子質(zhì)量分布測定

參照Zhao等[17]的方法略有修改，選用分離柱為TSK gel G2000 SWXL凝膠柱(300 mm×7.8 mm)，流動相為10%乙腈(含0.1%三氟乙酸)檢測器波長為220 nm。取適當(dāng)體積的水提取液與流動相等體積混合，10 000 g離心15 min，取上清液過0.45 μm的微孔濾膜后上機進行多肽分子質(zhì)量分布測定。

1.2.5 總酚含量測定

采用福林酚法測定總酚含量[18]，取0.2 mL水提取液到10 mL離心管中，然后分別加入1.3 mL去離子水和0.25 mL福林酚試劑，搖勻。靜置6 min后再分別加入0.75 mL 20% Na2CO3溶液和2.5 mL 去離子水，充分混勻。40 ℃水浴避光放置2 h后于760 nm處測定吸光值。以沒食子酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，總酚含量以μg GAE/mL表示。

1.2.6 抗氧化活性測定1.2.6.1 鐵離子還原能力(FRAP)

參照Benzie等[19]的方法略有修改，分別吸取180 μL水提取液、540 μL去離子水和5.4 mL新鮮配制的FRAP試劑于10 mL離心管中，振蕩混勻，室溫避光反應(yīng)30 min后于593 nm處測定吸光值。以Trolox繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，F(xiàn)RAP以μg TE/mL表示。

1.2.6.2 ABTS+·清除能力

參照Erel等[20]的方法略有修改，分別吸取0.2 mL水提取液和3.9 mL新鮮配制的ABTS工作液于10 mL離心管中，振蕩混勻，室溫避光反應(yīng)15 min后于734 nm處測定吸光值。以Trolox繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，ABTS+·清除能力以μg TE/mL表示。

1.2.7 酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性測定

參照Xu等[21]的方法進行水提取液的酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性測定，以去離子水作為空白對照，繪制反應(yīng)開始3 min內(nèi)的酶促反應(yīng)進程曲線。按照公式計算抑制率：

式中：S0和S1分別為空白對照組和樣品組的進程曲線斜率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗均平行測定3次，采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行oneway ANOVA分析(P<0.05表示差異顯著)，用Origin 2018軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵對脫脂薏米水提取液pH和TTA的影響

不同碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵對脫脂薏米水提取液的pH和TTA的影響如圖1所示。脫脂薏米經(jīng)干酪乳桿菌發(fā)酵后其水提取液pH顯著降低(P<0.05)，而TTA則顯著升高(P<0.05)。這主要是由于干酪乳桿菌在發(fā)酵過程中可通過糖酵解途徑快速分解碳水化合物產(chǎn)生多種有機酸[22]。相較于單獨發(fā)酵，不同碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵對水提取液的pH和TTA均無顯著性影響(P>0.05)。Du等[15]報道在植物乳桿菌發(fā)酵馬鈴薯渣時添加果膠酶可以使體系pH下降而TTA升高。導(dǎo)致這種差異性可能是由于脫脂薏米單獨發(fā)酵時已可為干酪乳桿菌的生長提供充足碳源，碳水化合物酶酶解提供的碳源并不能進一步促進干酪乳桿菌的代謝產(chǎn)酸。

注：同一指標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。圖1 碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵后脫脂薏米水提取液pH和TTA的變化

2.2 碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵對脫脂薏米水提取液游離氨基酸組成的影響

表1為不同碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵后脫脂薏米水提取液游離氨基酸組成的比較。發(fā)酵前、后及添加碳水化合物酶后水提取液的游離氨基酸組成均發(fā)生顯著變化(P<0.05)。單獨發(fā)酵后水提取液總氨基酸濃度相比未發(fā)酵前提高了233.56%(P<0.05)。添加碳水化合物酶后，水提取液總氨基酸濃度進一步提高(P<0.05)，其中添加葡聚糖酶組變化最為明顯(P<0.05)，較單獨發(fā)酵提高了32.42%。此外，添加葡聚糖酶組水提取液中必須氨基酸和非必需氨基酸濃度也顯著高于其他碳水化合物酶組(P<0.05)，分別較單獨發(fā)酵提高了35.60%和30.71%。相較單獨發(fā)酵，碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵后各游離氨基酸濃度也均顯著增加(P<0.05)，其中葡聚糖酶組的絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸和組氨酸濃度分別提高了71.48%、55.97%、47.79%、41.88%。碳水化合物酶的加入可促進干酪乳桿菌代謝過程中產(chǎn)生更多的蛋白酶，同時還可以促進發(fā)酵過程中薏米蛋白質(zhì)的溶出，使蛋白酶更易作用于薏米蛋白質(zhì)，因而可產(chǎn)生更多的游離氨基酸[14]。

表1 碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵后脫脂薏米水提取液游離氨基酸的變化/μg/mL

2.3 碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵對脫脂薏米水提取液多肽分子質(zhì)量分布的影響

多肽類物質(zhì)因具有多種生物活性，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品和化妝品等領(lǐng)域，研究表明多肽分子質(zhì)量分布對其生物活性的發(fā)揮起著重要作用[23]。表2為不同碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵后脫脂薏米水提取液多肽分子質(zhì)量分布的比較。未發(fā)酵薏米水提取液中88.36%的多肽屬于分子質(zhì)量小于5 000 u的小分子多肽，單獨發(fā)酵后其面積和比例均顯著提高(P<0.05)，而分子質(zhì)量大于5 000 u的大分子多肽所占比例為11.65%，其在單獨發(fā)酵后面積和比例均顯著降低(P<0.05)。相較于單獨發(fā)酵，碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵后水提取液多肽分子質(zhì)量分布發(fā)生明顯變化，果膠酶協(xié)同發(fā)酵后分子質(zhì)量小于500 u的多肽比例顯著提高(P<0.05)，而纖維素酶和葡聚糖酶發(fā)酵后分子質(zhì)量在15 000～10 000 u的多肽比例顯著提高(P<0.05)。此外，絕大多數(shù)多肽分子質(zhì)量分布區(qū)間的面積均顯著增加(P<0.05)，其中葡聚糖酶組顯著高于其他碳水化合物酶組(P<0.05)。協(xié)同發(fā)酵后各多肽分子質(zhì)量分布區(qū)間顯著增加的面積表明碳水化合物酶的加入促進了薏米蛋白質(zhì)的降解，這與游離氨基酸變化的趨勢是一致的。

表2 碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵后脫脂薏米水提取液多肽分子質(zhì)量分布的變化

2.4 碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵對脫脂薏米水提取液多酚含量的影響

酚類物質(zhì)廣泛存在于多種植物體中，是植物體的一種重要次生代謝產(chǎn)物，因其獨特的生理功效和藥用價值已廣泛應(yīng)用于食品、藥品和化妝品行業(yè)中[24]。研究表明，脫脂薏米中含有多種酚類物質(zhì)，具有較高的抗氧化活性和抗癌細胞增殖作用[3, 25]。不同碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵對脫脂薏米水提取液的多酚含量的影響如圖2所示。單獨發(fā)酵后水提取液多酚含量提高了27.52%(P<0.05)。碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵后水提取液總酚含量達到88.75～102.91 μg GAE/mL，較單獨發(fā)酵組顯著增加(P<0.05)，其中葡聚糖酶組增加比例最高，達到了25.27%，而木聚糖酶組增加比例最低，僅為8.03%。Qi等[9]研究發(fā)現(xiàn)纖維素酶協(xié)同處理可提高發(fā)酵燕麥可溶性多酚的含量，與本研究結(jié)論一致。酚類物質(zhì)以結(jié)合態(tài)和游離態(tài)的形式存在于植物體內(nèi)，不溶性結(jié)合酚可以多種共價鍵結(jié)合與植物細胞壁上的蛋白質(zhì)、纖維素等大分子物質(zhì)，碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵可在一定程度上促進這些大分子物質(zhì)的降解，從而釋放與之結(jié)合的酚類物質(zhì)[26]。

圖2 碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵后脫脂薏米水提取液多酚含量的變化

2.5 碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵對脫脂薏米水提取液抗氧化活性的影響

目前評價抗氧化活性的方法有很多，因不同評價方法的機制和特性不同，所得結(jié)論會有所差異[27]。本研究采用FRAP法和ABTS法對脫脂薏米水提取的抗氧化活性進行測定，不同碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵對脫脂薏米水提取液抗氧化活性的影響如圖3所示。未發(fā)酵薏米水提取液的FRAP和ABTS+·清除能力分別為45.38和44.88 μg TE/mL，單獨發(fā)酵后水提取液的FRAP和ABTS+·清除能力較未發(fā)酵前分別增加了37.33%和29.61%。碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵后水提取液的FRAP和ABTS+·清除能力分別達到66.56～86.97、62.02～75.88 μg TE/mL，相較單獨發(fā)酵組顯著增加(P<0.05)，其中葡聚糖酶組增加比例最高，分別達到了39.55%和30.44%，而果膠酶組增加比例最低，僅分別為7.01%和6.62%。脫脂薏米在協(xié)同發(fā)酵后水提取液中多酚和多肽類物質(zhì)增加，這些物質(zhì)都具有鰲合金屬離子、淬滅單線態(tài)氧和清除自由基等功能，因而水提取液的抗氧化活性增加。

圖3 碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵后脫脂薏米水提取液抗氧化活性的變化

2.6 碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵對脫脂薏米水提取液酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響

酪氨酸酶是黑色素合成的限速酶，普遍存在于生物體中，其過量表達可引發(fā)人體色素沉著性疾病，而黃嘌呤氧化酶是人體內(nèi)催化次黃嘌呤和黃嘌呤產(chǎn)生尿酸的關(guān)鍵酶，尿酸的大量生成可引發(fā)痛風(fēng)、糖尿病、高尿酸血癥等疾病[28]。研究表明，部分來源于植物體內(nèi)的多酚、多肽類物質(zhì)具有較強的酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性，可作為天然的酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制劑使用[18, 29]。圖4為不同碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵對脫脂薏米水提取液酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性的影響。未發(fā)酵薏米水提取的酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性分別為23.56%和13.82%，單獨發(fā)酵后水提取液的酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性顯著增強(P<0.05)，分別達到了48.03%和32.56%。碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵后水提取液的酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性分別達到54.34%～59.87% 和40.12%～49.12%，相較單獨發(fā)酵組顯著增強(P<0.05)，其中葡聚糖酶組的酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性顯著高于其他碳水化合物酶組(P<0.05)。協(xié)同發(fā)酵后水提取液顯著增加的多肽和酚類物質(zhì)可能促進了其酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性的提高。與此相似，Wang等[30]報道雙歧桿菌發(fā)酵提高了草藥提取物的酪氨酸酶抑制活性。

圖4 碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵后脫脂薏米水提取液酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性的變化

3 結(jié)論

研究碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵對脫脂薏米水提取液營養(yǎng)品質(zhì)的影響。與單獨發(fā)酵相比，協(xié)同發(fā)酵后脫脂薏米水提取液的pH和TTA未發(fā)生顯著變化(P>0.05)，但其游離氨基酸和多肽的含量顯著提高(P<0.05)。同時，碳水化合物酶協(xié)同發(fā)酵顯著提高了水提取液的多酚含量(P<0.05)，增強了水提取液的抗氧化活性(P<0.05)。此外，相較于單獨發(fā)酵，協(xié)同發(fā)酵后水提取液具有更高的酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶抑制活性(P<0.05)。葡聚糖酶相較于其他碳水化合物酶具有更好的協(xié)同增效作用。