繆?？?單春蘭 耿樹香 寧德魯 王宣軍

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院1，昆明 650201)(云南省林業(yè)和草原科學(xué)院2，昆明 650201)

腸道是機體營養(yǎng)消化吸收的最大場所，在維持腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了重要作用，然而機體的腸道易受環(huán)境、飲食等因素的影響下極易引發(fā)腸道炎癥[1，2]。炎癥性腸病(IBD)是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，其發(fā)病機制尚未完全清楚[3]。細(xì)胞因子廣泛存在腸道黏膜中，其中腫瘤壞死因子α(TNF-α)屬重要的促炎因子，其在腸道中的表達水平直接影響腸道炎癥的變化[4]。目前用于治療IBD的主要臨床藥物包括糖皮質(zhì)激素、TNF-α抑制劑、5氨基水楊酸等，長期服用存在著價格昂貴、毒副作用大、易產(chǎn)生藥物依賴等問題[5]。由于近年來IBD的發(fā)病率越來越高，嚴(yán)重影響人類的健康，從天然產(chǎn)物中提取安全、低毒或無副作用的功能性成分已成為目前的研究熱點[6]。

核桃是我國傳統(tǒng)的藥食兩用佳品，由核桃仁提煉的核桃油，具有核桃仁大部分的營養(yǎng)保健及藥理功效成分[7，8]。核桃油具有良好的脂肪酸結(jié)構(gòu)(亞油酸∶α-亞麻酸比值接近于4∶1)，富含維生素E、磷脂、角鯊烯、黃酮類等脂溶性化合物，具有抗氧化、抗炎癥、降膽固醇、抗癌、健腦等功效[9-11]。補充α-亞麻酸可保護IBD患者腸壁的完整性，并通過恢復(fù)菌群平衡產(chǎn)生抗炎化合物[12]。

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是研究小鼠急性腸道損傷的常用方法之一，LPS經(jīng)腹腔注射后可透過腸壁引發(fā)腸道炎癥，激活Toll樣受體4/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Toll-like receptor 4/Nuclear factor kappa B，TLR4/NF-κB)信號通路，并釋放炎性因子，其小腸組織中炎癥最為明顯[13，14]。然而，核桃油對LPS誘導(dǎo)的小鼠小腸損傷是否會產(chǎn)生保護作用尚不清楚。因此，本研究利用LPS建立小鼠小腸急性損傷模型，通過檢測小鼠腸道TNF-α表達水平變化，評價核桃油對小鼠腸道損傷的發(fā)揮的保護作用。預(yù)期研究結(jié)果即可為核桃油在機體腸道健康及其疾病的預(yù)防治療提供新的思路，又可為后期產(chǎn)品深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠

昆明種雄性小鼠：5周齡，(22±2) g，許可證號SCXK(滇)K2015-0002。普通維持飼料(許可證號SCXK(京)2018-06073)，飼養(yǎng)條件(SYXK(滇)K2018-0008)：溫度為(25±2) ℃，濕度為(40±5)%，12 h日光燈明暗交替循環(huán)，自由進食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.1.2 核桃油

1.1.3 主要試劑

Mouse TNF-α ELISA檢測試劑盒、Trizol、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒、LPS、免疫組化試劑盒，TNF-α抗體。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備

6YY-280全自動液壓榨油機，ELx800TM酶標(biāo)儀，RM2135石蠟切片機，BX43F正置顯微鏡，CFX96Touch熒光定量PCR儀，Western blot成套設(shè)備。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥

將40只小鼠隨機為4組：對照組(Con)、LPS模型組(LPS)、LPS+核桃油保護組(LPS+WO)和核桃油組(WO)。其中LPS+WO組和WO組灌胃核桃油2.5 mL/kg·d，連續(xù)灌胃4周。灌胃后常規(guī)飼養(yǎng)，動物自由食水，保持飼養(yǎng)環(huán)境清潔。第29天，LPS組和LPS+WO組通過腹腔注射LPS造成急性腸道損傷，劑量為3 mg/kg，LPS溶于無菌生理鹽水。Con組和WO組按5 μL/g腹腔注射無菌生理鹽水。注射6 h后對各處理組小鼠摘眼球血并分離血清，小鼠脫臼處死后，迅速解剖取出結(jié)腸組織，進行后續(xù)實驗。所有程序遵循中國小動物保護協(xié)會的要求。

1.2.2 血清和小腸組織中炎性因子TNF-α檢測

小鼠腸道選取十二指腸組織，根據(jù)Mouse TNF-α ELISA檢測試劑盒說明書檢測血清中炎性因子的含量。

1.2.3 腸道組織TNF-α mRNA相對表達檢測

TNF-α引物序列(F-GGCAGGTTCTGTCCCTTTCA；R-CTGTGCTCATGGTGTCTTTTC TG)由某公司合成。根據(jù)RNA提取說明書提取十二指腸組織RNA，并檢測OD260/OD280值。根據(jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。熒光定量PCR反應(yīng)體系為：SYBR 10 μL、引物各1 μL、cDNA模版2 μL、ddH2O 6 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，(95 ℃變性10 s、Tm退火20 s)，40×循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

1.2.4 腸道組織TNF-α蛋白Westen blot檢測

取十二指腸組織經(jīng)液氮研磨后加入RAPI裂解液，并置于組織破碎儀提取蛋白，離心獲得上清液，經(jīng)BCA定量檢測蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳(60 V，30 min；120 V，80 min)，轉(zhuǎn)膜(250 mA，50 min)，封閉(5%脫脂奶粉，60 min)，一抗孵育(1∶1 000，4 ℃搖擺過夜)，二抗(1∶5 000，60 min)工序后，在凝膠成像儀中拍照觀察。

1.2.5 腸道組織病理的檢查

取各處理組小鼠十二脂腸組織0.5 cm于4%多聚甲醛固定，經(jīng)酒精脫水和石蠟包埋后用徠卡切片機進行切片，厚度5 μm。常規(guī)脫蠟復(fù)水、經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.6 腸道組織TNF-α蛋白免疫組化檢測

十二指腸石蠟切片1.2.5方法制備。根據(jù)免疫組化試劑盒說明書進行染色，用兔抗TNF-α多克隆抗體(1∶200)室溫孵育1 h，加入二抗(1∶400)，放置15 min，DAPI復(fù)染胞核，甘油封片。組織學(xué)觀察采用400倍放大，每張切片連續(xù)觀察5個視野，采用Image Pro-Plus 6.0軟件(Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)統(tǒng)計各組TNF-α的表達面積。

1.3 統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用 SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件的 ANOVA 程序進行單因素方差分析。采用鄧肯(Duncan)氏法進行多重比較檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃油對小鼠血清TNF-α的影響

首先檢測了經(jīng)LPS誘導(dǎo)后各處理組小鼠血清中TNF-α的含量。由圖1可知，與Con組相比，LPS組小鼠血清炎性因子TNF-α含量極顯著升高(P<0.01)。與LPS相比，LPS+WO組TNF-α、含量顯著下降(P<0.05)。WO組中小鼠血液炎性因子水平下調(diào)，但與Con組無顯著差異(P>0.05)。表明核桃油能降低LPS誘導(dǎo)的小鼠血清炎性因子TNF-α的水平。

注：不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；尾標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，下同。圖1 小鼠血清中TNF-α水平

2.2 核桃油對小鼠小腸TNF-α mRNA表達的影響

LPS誘導(dǎo)的小鼠腸道急性損傷在小腸組織中最為明顯，研究了核桃油對小鼠十二指腸TNF-α炎性因子mRNA表達的影響。如圖2所示，與Con組相比，LPS能極顯著上調(diào)十二脂腸組織中TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.01)。與LPS組相比，LPS+WO組十二指腸組織中TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平極顯著降低(P<0.01)。WO組TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平與Con相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。表明核桃油能下調(diào)小鼠小腸組織中炎性因子TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。

圖2 小鼠十二指腸TNF-α mRNA表達水平

2.3 核桃油對小鼠小腸TNF-α蛋白表達的影響

為進一步驗證核桃油對LPS誘導(dǎo)的小鼠小腸組織中TNF-α蛋白表達水平的影響，分別采用免疫組化和免疫印跡方法檢測了各處理組小鼠十二指腸中TNF-α蛋白水平。免疫組化結(jié)果見圖3所示，與Con組相比，LPS組小鼠十二指腸組織中TNF-α蛋白表達面積極顯著增高(P<0.01)。與LPS相比，LPS+WO組TNF-α蛋白表達面積極顯著下降(P<0.01)。WO組與Con組無顯著差異(P>0.05)。

圖3 小鼠十二指腸TNF-α免疫組化及蛋白表達

免疫印跡結(jié)果見圖4所示，與Con組相比，LPS能極顯著誘導(dǎo)小鼠十二指腸中TNF-α蛋白的表達水平(P<0.01)。與LPS相比，LPS+WO組能極顯著抑制小鼠十二指腸中TNF-α蛋白表達水平(P<0.01)。WO組與Con組無顯著差異(P>0.05)。表明核桃油能抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠十二指腸TNF-α蛋白的表達，與TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果一致。

圖4 小鼠十二指腸TNF-α免疫印跡及定量表達

2.4 核桃油對小鼠小腸病理的影響

采用HE染色觀察了各處理組小鼠十二指腸組織病理學(xué)變化(圖5)，Con組和WO組小鼠十二指腸組織結(jié)構(gòu)正常，絨毛結(jié)構(gòu)完整，排列緊密，無組織學(xué)病變。LPS組十二指腸絨毛萎縮，上皮細(xì)胞脫落，絨毛有斷裂現(xiàn)象，固有層炎性細(xì)胞浸潤，提示小鼠腸道炎癥模型建立成功。與LPS組相比，LPS+WO組小腸損傷較輕，腸絨毛恢復(fù)、炎性細(xì)胞浸潤減輕。表明核桃油能減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠急性腸道炎癥的形態(tài)損傷。

圖5 小鼠十二指腸病理變化

3 討論

攝入n-3/n-6較高比率的多不飽和脂肪酸對IBD具有明顯的預(yù)防作用[9]。腸道是機體消化吸收的最大場所，本研究評估在LPS誘導(dǎo)的小鼠急性腸道損傷過程中，核桃油對十二脂腸中TNF-α的影響。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的特有的一種化學(xué)成分，由脂質(zhì)和多糖組成，經(jīng)腹腔注射進入機體后導(dǎo)致腸道黏膜通透性增加，引發(fā)腸道氧化應(yīng)激，活化TLR4/NF-κB炎癥通路，并釋放炎性因子TNF-α，進而誘導(dǎo)腸道細(xì)胞的壞死和凋亡，促使腸道發(fā)生炎癥[15]。在本研究中，LPS能顯著增加小鼠腸道組織中TNF-α水平，說明LPS誘導(dǎo)了小鼠腸道中TNF-α表達。

隨著對核桃油生物活性研究的深入，核桃油具有顯著的抗炎活性。Willis等[16]研究表明核桃油的抗炎作用通過磷脂酶D2(Phospholipase D2，PLD2)的活化降低小膠質(zhì)細(xì)胞BV-2中TNF-α的表達水平，從而提高細(xì)胞的抗炎能力。Yolanda等研究表明核桃油可降低機體外周血單核細(xì)胞中炎性因子TNF-α和IL-6 mRNA的表達水平[18]。核桃油顯著的抗炎作用機制可能是通過調(diào)控機體腸道菌群組成及多樣性水平[增加腸道柔嫩梭菌屬(Faecalibacterium)、羅氏菌屬(Roseburia)和梭菌屬(Clostridium)的相對豐度]相關(guān)，這3類菌可以產(chǎn)生丁酸鹽，作為一種短鏈脂肪酸(Short chain fatty acids，SCFAs)具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)的功能[20]。此外，核桃油中多酚類化合物主要為鞣質(zhì)、黃酮類和酚酸成分，經(jīng)腸道微生物菌群代謝生成尿石素(Urolithin)A和尿石素B，尿石素在機體內(nèi)可抑制相關(guān)炎性因子的表達減輕炎癥反應(yīng)，如NF-κB、誘導(dǎo)型iNOS、TNF-α、IL-1β等[19，20]。核桃油在IBD非藥物防控研究中具有較高參考價值，但其在腸道炎癥中確切作用機制仍需進一步探索。

4 結(jié)論

本研究利用LPS建立小鼠小腸急性損傷模型，檢測了小鼠十二指腸中關(guān)鍵促炎因子TNF-α表達水平的變化。結(jié)果表明：核桃油可顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的小鼠小腸組織中TNF-α表達水平，并改善小腸組織病理形態(tài)。核桃油可能通過抑制小鼠小腸組織中炎性因子TNF-α的表達對LPS誘導(dǎo)的急性腸道損傷發(fā)揮保護作用。