王 娟 魏春紅 王維浩,2 趙姝婷 劉德志王一飛 武云嬌 蘇有韜 曹龍奎,2

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319)(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)國家雜糧工程技術(shù)研究中心2，大慶 163319)

小米是糖尿病患者的理想食物，其碳水化合物含量低于大米、小麥和玉米，多酚含量、VB1、VB2含量高于小麥和大米[1]，且其膳食纖維(DF)含量是大米的2.5倍[2]。DF包括水溶性膳食纖維(SDF)和不溶性膳食纖維(IDF)[3]，SDF在防治心血管疾病[4]、糖尿病[5]、動脈硬化等方面具有良好的作用且優(yōu)于IDF[6]，但是天然DF中的SDF含量較低，口感粗糙，阻礙了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。因此，對DF進行改性提高SDF的含量成為很多學(xué)者研究的重點[7]。目前對DF的改性方法有物理方法、生物方法、化學(xué)方法或聯(lián)合幾種方法進行改性[8]，但考慮到生物方法成本高、反應(yīng)條件苛刻，化學(xué)方法安全性低、污染高，綜合考慮對小米進行物理改性?，F(xiàn)階段，對于小米SDF的研究還停留在提取工藝、理化性質(zhì)研究及加工方式對結(jié)構(gòu)的影響[9，10]，而在小米SDF改性方面的研究涉及較少。

目前對于DF功能性質(zhì)的研究主要集中在吸水性、吸油性、膽固醇吸附能力等方面[11]，而其對微量元素的影響鮮有報道。硒是人體的必需微量元素，可以抗氧化、促進免疫、參與基因表達[12]。自然界中的硒大多以無機硒存在，其吸收率較低，且對人體有一定的毒副作用，有機硒毒性小、安全指數(shù)高、體內(nèi)轉(zhuǎn)化率高，但有機硒含量相對較少[13]，所以有機硒的開發(fā)利用至關(guān)重要。研究表明，將無機硒與多糖結(jié)合不僅可以降低無機硒毒性，還可以增加多糖的生物活性[14]，而SDF與多糖具有相似的結(jié)構(gòu)，如C—H、C—O等基團[15]，這些基團在多糖與硒的結(jié)合中起著重要作用。因此，本實驗研究改性前后的SDF的結(jié)構(gòu)并研究其硒化修飾能力，以篩選出一種可使SDF硒化能力增強的改性方法，為進一步開發(fā)有機硒新產(chǎn)品、拓寬小米及小米SDF的應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小米品種為東方亮谷，顆粒飽滿均勻，色金黃，無霉爛碎米；蛋白酶(水解酶類，60 000 U/mL)，耐高溫α-淀粉酶(水解酶類，40 000 U/mL)，淀粉葡糖苷酶(水解酶類，100 000 U/mL)；溴化鉀，光譜級；95%乙醇等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GDE-CSF6膳食纖維測定儀，LHL型流化床式氣流粉碎機，Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀，LC20+RID20A凝膠滲透色譜儀，D8 ADVANCEX射線粉末衍射儀，SU8020場發(fā)射掃描電子顯微鏡，CW-2000A超聲-微波協(xié)同萃取反應(yīng)儀。

1.3 方法

1.3.1 小米前處理

小米粉的制備：取適量小米，經(jīng)粉碎過60(D50=250.00 μm)目篩，進行脫脂處理，備用。

超微粉碎小米粉的制備：取適量小米，進行超微粉碎(D50=13.29 μm)后脫脂，備用。

流化床氣流粉碎系統(tǒng)設(shè)有3個噴嘴，噴嘴間平面角度為120°，以潔凈壓縮空氣為粉碎工質(zhì)，空氣溫度不高于45 ℃。粉碎操作參數(shù)：持料量1.0 kg；進料頻率3 Hz；粉碎工質(zhì)壓力0.8 MPa，分級機轉(zhuǎn)速3 600 r/min；引風(fēng)機流速15 m3/min；粉碎時間30 min。

脫脂：利用索氏提取法對小米粉進行脫脂處理[16]。

1.3.2 小米SDF的制備

1.3.2.1 超聲-微波(U-M)萃取改性小米SDF的制備

稱取5.00 g經(jīng)普通粉碎的脫脂小米粉，在U-M萃取儀中按照微波功率550 W，料液比1∶25 (V∶V)，微波溫度55 ℃，微波時間20 min進行處理，將溶液轉(zhuǎn)至500.00 mL燒杯中，加入250.00 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.08 mol/L，pH=6)，分別加入耐高溫α-淀粉酶、中性蛋白酶、淀粉葡萄糖苷酶進行酶解，期間用碘液檢測淀粉含量，硫酸銨使蛋白質(zhì)充分沉淀，之后滅酶，濾液經(jīng)濃縮后，4倍體積的95% (體積分數(shù))乙醇溶液醇沉、離心、干燥得U-M萃取改性小米SDF (SDF1)。同時去除空白、未消化蛋白質(zhì)、灰分的影響。

1.3.2.2 小米SDF的制備

稱取5.00 g經(jīng)普通粉碎脫脂小米粉，加入125.00 mL蒸餾水，加入250.00 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.08 mol/L，pH=6)，分別經(jīng)耐高溫α-淀粉酶、中性蛋白酶、淀粉葡萄糖苷酶進行酶解，期間用碘液檢測淀粉含量，硫酸銨使蛋白質(zhì)充分沉淀，滅酶，濾液濃縮后，用4倍體積的95% (體積分數(shù))乙醇溶液醇沉、離心、干燥得小米SDF (SDF2)。同時去除空白、未消化蛋白質(zhì)、灰分的影響。

1.3.2.3 超微粉碎協(xié)同U-M萃取改性小米SDF的制備

稱取5.00 g經(jīng)超微粉碎的脫脂小米粉，在U-M萃取儀中按照微波功率550 W，料液比1∶25 (V∶V)，微波溫度55 ℃，微波時間20 min進行處理，后續(xù)過程同(1)，得超微粉碎協(xié)同U-M萃取改性小米SDF (SDF3)。

1.3.2.4 超微粉碎改性小米SDF的制備

稱取5.00 g經(jīng)超微粉碎的脫脂小米粉，后續(xù)過程同1.3.1，得超微粉碎改性小米SDF (SDF4)。

1.3.3 小米SDF的傅里葉變換紅外光譜測定

參照張艷榮等[17]方法，稱取干燥樣品2.00 mg與溴化鉀粉末200.00 mg于研缽中，充分混勻，研磨，制片。在4 000～400 cm-1進行紅外光譜掃描。

1.3.4 小米SDF超微結(jié)構(gòu)的觀察

參照Park等[18]方法，將樣品干燥至恒質(zhì)量，取適量進行黏臺、鍍金，對樣品進行5 000、10 000、20 000、50 000倍微觀結(jié)構(gòu)觀察拍照。

1.3.5 小米SDF分子質(zhì)量分布的測定

稱取適量樣品于容量瓶中，用流動相溶解，定容。色譜條件：色譜柱：TSKgel GMPWXL，流動相：水相，少量硝酸鈉、疊氮化鈉，流速：0.5 mL/min，柱溫：30 ℃，進樣量：20 μL。

1.3.6 小米SDF的X射線衍射測試

取適量干燥后的SDF于樣品槽中用玻璃板壓平，將其置于自動X射線衍射儀中[19]。參數(shù)設(shè)置：λ=0.156，管壓36 kV，管流20 mA，Cu靶，掃描速率2 (°)/min，衍射角度2θ，掃描范圍2°～40°，掃描頻率0.02 (°)/步。

1.3.7 陽離子交換能力的測定

參照Chau等[20]的方法測定4種SDF的陽離子交換能力，稱取小米SDF 1.00 g于250.00 mL三角燒瓶中，加入1 mol/L HCl溶液50.00 mL，攪拌均勻后密封，靜置24 h，加入5 g/100 mL的NaCl溶液50.00 mL，攪拌均勻，加入2滴酚酞指示劑，用1 mol/L NaOH溶液滴定至終點，記錄滴定體積。同時做空白實驗，陽離子交換能力按式(1)計算。

(1)

式中：V1為滴定樣品消耗氫氧化鈉溶液體積/mL；V0為滴定空白樣消耗氫氧化鈉溶液體積/mL；m為樣品干質(zhì)量/g；1為滴定所用氫氧化鈉溶液濃度/mol/L。

1.3.8 硒化能力的測定

準確稱取500.00 mg SDF，緩慢滴加0.5%的HNO350 mL，邊加邊攪拌，均勻后加入0.65 g BaCl2固體粉末，然后滴加5 mg/mL Na2SeO3溶液4.00 mL，50 ℃恒溫下攪拌反應(yīng)6 h，冷卻至室溫，無水碳酸鈉調(diào)節(jié)pH=5～6，加入一定量硫酸鈉固體粉，離心得上清液用流水透析1 d，透析液減壓蒸餾至10～20 mL，之后再用蒸餾水透析1 d，透析液冷凍干燥得硒化小米SDF。

稱取50.00 mg硒化小米SDF，加入3.00 mL混酸(V硝酸∶V高氯酸=4∶1) 浸泡過夜，次日加熱消解至消化液出現(xiàn)淺棕色，冷卻至室溫；加入0.50 mL的雙氧水，加熱到出現(xiàn)白煙，冷卻至室溫；用10.00 mL蒸餾水沖洗瓶壁，然后加熱趕酸至剩余體積為1～2 mL，然后加入6 mol/L混酸，定容至10.00 mL；取2.00 mL溶液，加6.00 mL蒸餾水，1.0 mol/L的鹽酸溶液調(diào)至pH=2～3，加入4.00 mL體積分數(shù)為2%的鄰苯二胺溶液，放置暗處20 min，質(zhì)量分數(shù)5% 的NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性，加入5.00 mL甲苯振蕩2 min，靜置分層，甲苯層在334 nm處測吸光度，得其含量為x[21，22]，硒含量按式(2)計算。

(2)

式中：Se為硒多糖中硒的含量/mg/g；Cx為甲苯萃取溶液中硒的濃度/μg/mL；V1為待測水溶液的體積/mL；V2為甲苯萃取液的總體積/mL；V3為用于絡(luò)合測試的待測水溶液的體積/mL；m為多糖亞硒酸酷的質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗均進行3次平行，取其平均值，SPSS 22軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析(P<0.01)，Excel 2019對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用Origin 8.0軟件進行繪圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 改性小米SDF的紅外光譜分析

小米SDF的紅外光譜圖如圖1所示，4種SDF具有相似的光譜模式，但改性后部分纖維素類多糖特征吸收峰強度發(fā)生變化[23]。4種SDF在2 984 cm-1處出現(xiàn)飽和的C—H伸縮振動，峰強較弱，這可能是烷烴類的C—H振動峰；2 192～2 204 cm-1處的特征吸收峰由炔烴C—H的伸縮振動所致；1 467 cm-1處可能是O—H的變形振動引起；1 400～1 200 cm-1范圍內(nèi)為C—H或C—O的變角振動吸收峰，這些區(qū)域的吸收峰為糖類的特征吸收峰[24]，SDF2和SDF3在1 361 cm-1處出現(xiàn)特征吸收峰，SDF1和SDF4在1 358 cm-1處出現(xiàn)特征吸收峰，這是甲基的C—H對稱彎曲振動引起的，由此可知小米SDF與糖類存在相似的結(jié)構(gòu)；指紋區(qū)在1 300～650 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，分別在1 279、869、855、753 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，分別對應(yīng)C—O、C—C伸縮振動峰和C—H面外彎曲振動吸收峰[25]，其中869 cm-1處的特征吸收峰，是糖分子中次甲基的橫向振動吸收，表明小米SDF中有甘露糖苷鍵存在[26]。4種SDF雖然改性方法不同，但峰型及出峰位置無明顯變化，說明物理改性不會改變物質(zhì)結(jié)構(gòu)，但由于官能團含量或結(jié)合方式不同，所以導(dǎo)致峰的吸收強度不同，且這些基團對SDF理化性質(zhì)如持水力、油能力、陽離子吸附和金屬螯合等起著重要作用[27]。

圖1 小米SDF的傅里葉變換紅外光譜圖

2.2 改性小米SDF的顯微結(jié)構(gòu)

4種小米SDF的微觀形態(tài)如圖2所示，2萬倍放大倍數(shù)下，小米SDF表面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)被破壞，組織結(jié)構(gòu)疏松，放大倍數(shù)增大后，小米SDF微觀結(jié)構(gòu)為大小不一的顆粒圓球狀，分布較密集。當(dāng)放大倍數(shù)為2萬倍時，SDF3較其他3種SDF出現(xiàn)明顯的片層結(jié)構(gòu)，而放大倍數(shù)為5萬倍時，SDF1微觀結(jié)構(gòu)似葡萄串狀，中間有較大孔隙，SDF2結(jié)構(gòu)分布較均勻，SDF3結(jié)構(gòu)為顆粒圓球狀，有較明顯的片層存在，SDF4孔隙較大?？赡苁且驗槲锪辖?jīng)過處理后粒度更加均勻，使其微觀結(jié)構(gòu)和分子大小改變[28]，或者超微粉碎協(xié)同U-M作用極大程度地破壞了纖維的糖苷鍵及分子間氫鍵作用力，使得SDF降解，分子質(zhì)量降低，聚合度變小[29]。超微粉碎協(xié)同U-M萃取改性可破壞SDF的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使SDF表面粗糙，出現(xiàn)片層結(jié)構(gòu)，而且超微粉碎極大的剪切力可以使SDF的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使包裹在內(nèi)部的基團暴露出來，與傅里葉紅外光譜的結(jié)果也一致[30]。

注： 圖b、圖d、圖f和圖h分別為圖a、圖c、圖e和圖g的局部放大圖。圖2 小米SDF的掃描電子顯微鏡圖

2.3 改性小米SDF的相對分子質(zhì)量分布

采用凝膠滲透色譜法測定4種SDF分子質(zhì)量繪制出的分布圖，結(jié)果如表1所示。從重均相對分子質(zhì)量角度分析，SDF2的重均分子質(zhì)量大于其他3種SDF，說明SDF2較其他3種SDF分子鏈長，分析可能是由于酶法提取的反應(yīng)條件較溫和，作用于物料細胞壁釋放SDF，而未對SDF大分子進行降解[31]，而其他3種SDF的分子鏈被切斷，聚合度降低，從而使其重均相對分子質(zhì)量降低[32]。4種SDF的分散指數(shù)均大于1，說明分子質(zhì)量呈多分散，有自由基產(chǎn)物存在，其中SDF2分散指數(shù)大于3，說明SDF2的分子質(zhì)量較大且分布范圍廣[33]。超微粉碎協(xié)同U-M萃取改性會使小米SDF分子鏈被切斷，聚合度降低，分子質(zhì)量降低。

表1 小米SDF分子質(zhì)量測試結(jié)果

2.4 改性小米SDF的X射線衍射結(jié)果

圖3為4種SDF的X-衍射圖譜， SDF1在2θ為14.08°、19.85°和32.19°處有明顯的結(jié)晶衍射峰，SDF2在2θ為21.02°處有明顯的結(jié)晶衍射峰，這表明SDF1的晶體為纖維素Ⅰ型和纖維素Ⅱ型，SDF2的晶體為纖維素Ⅰ型[34]，根據(jù)Segal[35]的計算方法，可計算兩者的結(jié)晶度分別為24.50%、20.19%，說明U-M萃取處理使小米SDF表面結(jié)構(gòu)被破壞，結(jié)晶區(qū)暴露，從而結(jié)晶度增大[36]；SDF3和SDF4在2θ范圍內(nèi)衍射強度較弱，無明顯的結(jié)晶衍射峰。李楊等[37]研究發(fā)現(xiàn)物料粒度對DF衍射峰的位置無明顯影響，但是衍射峰的強度卻隨著物料粒度的減小而減小，而且衍射峰寬度增加；王秋陽等[38]分析造成這種現(xiàn)象的原因是超聲波使結(jié)晶區(qū)纖維素分子間的氫鍵破壞，纖維素分子發(fā)生部分降解，進而使得衍射峰不明顯，本結(jié)果與前人研究結(jié)果相同，證明物料粒度及超聲波對物料結(jié)構(gòu)具有一定影響。超微粉碎對小米SDF結(jié)晶區(qū)造成破壞，但不會改變晶體結(jié)構(gòu)。

圖3 小米SDF的X-衍射圖譜

2.5 改性小米SDF的陽離子交換能力的比較

膳食纖維的羧基、羥基等離子型官能團的暴露量是判斷其陽離子交換能力強弱的關(guān)鍵影響因素[39]。由圖5可知，4種SDF的陽離子交換能力強弱依次為SDF3>SDF1>SDF4>SDF2，說明物料經(jīng)超微粉碎協(xié)同U-M萃取改性可以提高小米SDF陽離子交換能力，這可能是由于超微粉碎減小了物料粒度，使其表面暴露出許多糖醛酸結(jié)合位點[40]，增加了交換的概率，再加上U-M萃取具有超聲波的空化作用及微波的高能作用[41]，可以使SDF表面積增大，基團暴露，與傅里葉紅外光譜測定結(jié)果一致。本研究表明超微粉碎協(xié)同U-M萃取改性對小米SDF的陽離子交換能力具有顯著的增強作用，有助于SDF與硒的結(jié)合能力的提高。

圖5 小米SDF的陽離子交換能力的比較

2.6 改性小米SDF硒化能力的測定

圖6 小米SDF硒化能力的比較

3 結(jié)論

利用3種物理方法對小米進行改性處理，并對4種小米SDF與硒元素的結(jié)合能力進行考察，實驗結(jié)果表明物理改性對小米SDF官能團、結(jié)晶度無明顯影響，而對于小米SDF微觀結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量大小及分布范圍具有一定影響，其中超微粉碎協(xié)同U-M萃取可使小米SDF呈現(xiàn)較明顯的特征吸收峰，分子質(zhì)量減小，X-衍射峰寬度增加，并且使SDF具有較強的陽離子交換能力和硒化能力。本研究僅對小米中的SDF進行了物理改性，后續(xù)可利用生物方法或物理生物相結(jié)合的方法對其進行改性。