李丹倩，梁嘉怡，鐘曉晴，王潤東，彭元懷

（嶺南師范學院食品科學與工程學院，廣東湛江 524048）

炎癥是機體受細菌感染或氧化應(yīng)激后免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的防御反應(yīng)，其發(fā)生機制與炎性信號通路和促炎因子相關(guān)。當致炎介質(zhì)與免疫細胞膜上游信號響應(yīng)元件先天免疫受體4（toll-like reporter4，TLR4）結(jié)合，經(jīng)中游信號傳遞元件髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和下游信號釋放元件核因子-κB（nuclear factor-kaapa B，NF-κB）的轉(zhuǎn)導，可激活NF-κB通路，驅(qū)動腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白介素-6（IL-6）基因表達，形成炎癥反應(yīng)[1,2]。適度的炎癥有利于宿主抵御病原體感染，然而，不受控制的炎癥會誘發(fā)代謝綜合征和肝腎損傷[3]。目前，化學合成的抗炎藥物已廣泛用于治療炎癥，但長期使用引發(fā)臟器功能衰退和胃腸潰瘍[4]。因此，尋找低毒性的天然物質(zhì)，來避免合成藥物的毒副作用尤為迫切。

火龍果（Hylocereus undulatus）富含黃酮、多糖和多酚等物質(zhì)，具有較好的保健功能[5]。火龍果皮是果實加工的副產(chǎn)物，約占整果總重量33%，它通常被轉(zhuǎn)化為動物飼料或作為廢棄物丟棄[6]。有研究指出果皮中也含有大量的膳食功能因子，具有抗菌、抑炎和抗氧化作用[7]，但是由于果皮細胞壁的構(gòu)成，采用傳統(tǒng)的有機溶劑萃取和超聲輔助提取無法使得果皮中活性物質(zhì)充分溶出，造成提取率低和生物相容性差等問題[8,9]。目前，利用酵母、真菌和乳酸菌對食品原料進行發(fā)酵的研究正在興起，微生物發(fā)酵是提高食品工業(yè)副產(chǎn)物再利用的一種綜合、環(huán)保的新方法[10,11]。

微生物發(fā)酵的本質(zhì)是利用菌體生長繁殖中釋放的多種胞外酶，促進食品的營養(yǎng)功能成分降解，使得原本沒有生物活性或活性較弱的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)橛行С煞?，從而增加提取物中有效物質(zhì)的含量[11]。據(jù)報道，乳酸菌發(fā)酵大麥[12]、鐵皮石斛[13]、石榴皮[14]可促進原料中大分子蛋白質(zhì)和結(jié)合態(tài)物質(zhì)的分解，獲得新型小肽和游離態(tài)物質(zhì)。Cheng等[15]發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌發(fā)酵的藍莓渣對肥胖誘導炎癥的緩解作用顯著高于未發(fā)酵果渣，且具有更高的生物利用率。李倩[16]通過植物乳桿菌發(fā)酵辣木葉制備富含γ-氨基丁酸，大幅提高辣木葉水提物的抗炎和抗氧化活性。由此可見，果蔬及其下腳料的乳酸菌發(fā)酵具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，發(fā)酵火龍果皮側(cè)重于果醋和釀酒工藝的研究，未見關(guān)于火龍果皮發(fā)酵物中功能組分及抗氧化/抗炎作用的報道。

本文以干酪乳桿菌CICC20280發(fā)酵火龍果皮，檢測發(fā)酵前后提取物中總酚和黃酮的變化、抗氧化活性的差異，基于脂多糖（LPS）誘導的RAW264.7細胞炎癥模型，探究火龍果皮發(fā)酵物（FermentedHylocereus undulatuspeel，F(xiàn)HP）對炎癥的緩解作用和機制，旨在為火龍果皮資源的綜合利用和抗炎功能產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮火龍果，購于廣東省湛江市火龍果產(chǎn)區(qū)。整果洗凈和晾干后，分離果肉與果皮，把果皮切成3～5 cm小塊，經(jīng)冷凍干燥后粉碎過100目篩，1 ℃下貯藏備用。乳酸菌菌株：干酪乳桿菌CICC20280由廣東省微生物研究所丁郁教授饋贈。

脂多糖（LPS，Escherichia coliO55:B5）、噻唑藍（MTT），美國Sigma公司；二甲基亞砜（DMSO）、地塞米松（DEX），青島海博有限公司；RAW264.7細胞株，中國科學院（上海）細胞庫；RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、青鏈霉素混液、胎牛血清（FBS）和磷酸鹽緩沖液，美國Gibco公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測試劑盒，美國 Promega公司；TNF-α/IL-1β/IL-6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒、ABTS試劑盒、FRAP試劑盒、2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）熒光試劑、Trizol RNA提取劑、HiScriptⅡ Q-RT SuperMix for RT-PCR、AceQ Universal SYBR RT-PCR Master Mix，廣州齊云生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備工程有限公司；SCIENTZ-12N真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)儀器公司；Microfuge 20R低溫高速離心機，美國Beckman公司；Thermo311 CO2細胞培養(yǎng)箱、MK3型全自動多功能酶標儀，美國Thermo公司；CFX96型熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 FHP制備及活性組分測定

干酪乳桿菌CICC20280的活化，將菌株凍干粉接入MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后，12000 r/min離心10 min，收集沉淀，用無菌生理鹽水調(diào)整菌液濃度至107CFU/mL作為發(fā)酵劑。按照質(zhì)量：體積=1:1.5，將火龍果皮粉末與蒸餾水混合，采用80 ℃，15 min巴氏殺菌法除去火龍果皮培養(yǎng)基中原始雜菌，冷卻至室溫備用。將上述發(fā)酵劑以體積分數(shù)5%添加到無菌的火龍果皮培養(yǎng)基，37 ℃厭氧靜置培養(yǎng)42 h后，4000 r/min，4 ℃，離心5 min，收集上清液。以蒸餾水為流動相，應(yīng)用聚酰胺柱層析法對上清液初分離純化，于真空冷凍干燥，制成FHP[17]。對照組樣品的制備除不接種發(fā)酵劑外，其余操作同上。試樣中總酚和黃酮的測定參照Sun等[18]建立的方法。

1.3.2 FHP抗氧化活性測定

通過DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和鐵離子還原能力[18]，對FHP的抗氧化活性進行評估。

1.3.3 FHP抗炎活性測定

1.3.3.1 RAW264.7細胞培養(yǎng)

取凍存RAW264.7細胞，37 ℃水浴1 min，在無菌操作臺內(nèi)將其移入含10%胎牛血清、1%雙抗（100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素）的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，每隔24 h更換培養(yǎng)基，當細胞融合率達到80%～90%對細胞進行傳代，細胞傳至3代，用于后續(xù)試驗。

1.3.3.2 FHP對RAW264.7細胞活力的影響

利用RPMI-1640完全培養(yǎng)液將RAW264.7細胞濃度調(diào)整至106個/mL，按照每孔100 μL接種于96孔細胞培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育18 h。待細胞貼壁后，棄掉孔內(nèi)培養(yǎng)液，隨后每孔加入100 μL液體，依據(jù)添加液體的種類，將細胞分為：對照組、陽性組和不同質(zhì)量濃度FHP處理組，分別添加：完全培養(yǎng)液、0.5 μg/mL DEX溶液和50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL和800 μg/mL FHP溶液，每組設(shè)5個復孔。培養(yǎng)24 h后，向各孔內(nèi)加入100 μL MTT工作液（5 mg/mL），作用4 h后棄上清液，每孔加100 μL MTT終止液（0.1% DMSO），避光振蕩混勻，于490 nm處測定OD值，計算細胞存活率，確定FHP安全濃度。細胞存活率計算公式，如下：

1.3.3.3 FHP對LPS誘導RAW264.7細胞活力的影響

按照1.3.3.2操作進行細胞接種，根據(jù)FHP安全濃度范圍，設(shè)置7個試驗組：對照組、陽性組、LPS模型組和低中高濃度FHP組，分別添加100 μL：完全培養(yǎng)液、0.5 μg/mL DEX、1 μg/mL LPS、100 μg/mL、200 μg/mL和400 μg/mL FHP。陽性組和FHP組在添加對應(yīng)溶液處理細胞1 h后，加入100 μL 1 μg/mL LPS。各組培養(yǎng)24 h后，按照1.3.3.2操作檢測FHP對LPS刺激的RAW264.7細胞保護效應(yīng)。

1.3.3.4 FHP對LPS誘導RAW264.7細胞分泌NO、ROS、細胞因子及NF-κB通路關(guān)鍵基因的影響

細胞接種、試驗分組和受試物添加同1.3.3.3操作。

①格里斯（Griess）法檢測RAW264.7細胞上清中NO含量

干預(yù)細胞24 h后，4000 r/min，4 ℃離心5 min，收集各組上清50 μL。向上清中添加等體積Griess A和Griess B溶液，37 ℃孵育10 min。在540 nm處測定各孔OD值，用NaNO2建立標準曲線，計算樣品中亞硝酸鈉濃度，推算細胞培養(yǎng)液中NO釋放量。

②DCFH-DA熒光法檢測RAW264.7細胞上清液中ROS含量

同上述操作收集上清后，在黑暗條件下加入終濃度100 μmol/L DCFH-DA熒光試劑，避光孵育30 min后，以激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm，測定上清熒光強度。

③ELISA檢測RAW264.7細胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10含量

同上述操作收集上清。按照ELISA試劑盒說明書測定各組上清中細胞因子的濃度。

④RT-PCR檢測RAW264.7細胞NF-κB通路TLR4/MyD88/NF-κB及炎癥因子基因的表達

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-PCR

干預(yù)細胞4 h后，4000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清，收集細胞。使用Trizol RNA提取細胞總RNA，RNA經(jīng)純度和質(zhì)量濃度檢測后，保留高品質(zhì)RNA樣本。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用10 μL反轉(zhuǎn)錄體系，反轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃、10 min；95 ℃、8 s。利用特異性引物進行RT-PCR擴增，以小鼠β-actin為內(nèi)參基因，構(gòu)建20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95 ℃、25 s；95 ℃、10 s，60 ℃、15 s，循環(huán)40次；融解曲線分析：95 ℃、15 s；60 ℃、30 s，循環(huán)1次。引物序列如下表1。通過2-ΔΔCt法計算待測基因的相對表達量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行處理，以平均值±標準差表示，滿足正態(tài)分布和方差齊性的多組之間均數(shù)比較運用單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD法，方差不齊者采用Dunnett"s T3檢驗。p＜0.05存在顯著差異，p＜0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 FHP總酚、黃酮和抗氧化活性

火龍果皮發(fā)酵物中總酚含量達169.26 mg CAE/(g DW)、黃酮為81.74 mg CAE/(g DW)，不僅顯著高于（p＜0.05）未發(fā)酵火龍果皮中的含量，還遠超已報道的榴蓮殼[19]、葡萄皮[20]和芒果皮[21]等下腳料中的提取量，有研究指出乳酸菌通過脫羧和還原反應(yīng)將食品原料中結(jié)合態(tài)酚和黃酮轉(zhuǎn)化為游離態(tài)[22]。因此，乳酸菌發(fā)酵果蔬渣的工藝更適合天然產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)?；瘕埞ぐl(fā)酵物具有更高的DPPH/ABTS自由基清除能力和Fe3+金屬離子螯合能力，本研究中干酪乳桿菌CICC20280菌株在生長穩(wěn)定的后期也能產(chǎn)生具有抗氧化活性的物質(zhì)，但火龍果皮發(fā)酵時長為42 h，此時菌體生長剛達到穩(wěn)定期，因此，菌體代謝產(chǎn)生的抗氧化物質(zhì)量遠遠低于火龍果皮發(fā)酵后的釋放量，可以忽略其影響。此外，有研究指出炎癥反應(yīng)釋放的促炎因子可以活化巨噬細胞和白細胞等分泌大量的過氧化物自由基，加重炎癥程度，因此，天然活性物質(zhì)通過清除自由基發(fā)揮抗氧化作用具有潛在的緩解炎癥的功能[23,24]，據(jù)此推斷具有抗氧化活性的FHP可通過淬滅氧自由基發(fā)揮抗炎功效。

2.2 FHP對RAW264.7細胞活力的影響

細胞增殖試驗是評估外源化合物細胞毒性的重要依據(jù)。由表3可知，以DEX組細胞存活率為100%，F(xiàn)HP濃度在100～400 μg/mL時，RAW264.7細胞存活率隨濃度增加而上升，細胞最高存活率達到99.01%。然而，F(xiàn)HP濃度低于100 μg/mL或高于400 μg/mL時細胞活力會明顯下降，這表明高濃度FHP能導致細胞損傷，具有細胞毒性。最新研究也證實，攝入過量的兒茶素（多酚類）會對肝臟細胞造成不可逆損傷[25]，因此，質(zhì)量濃度100～400 μg/mL是研究FHP抗炎功效的安全劑量范圍。

表2 火龍果皮提取物的總酚、黃酮和抗氧化活性Table 2 Main antioxidant components and antioxidant activities in Hylocereus undulatus peel extract

表3 火龍果皮發(fā)酵物對RAW264.7細胞活力的影響Table 3 Effects of fermented Hylocereus undulatus peel on the proliferation of RAW264.7 cells

2.3 FHP對LPS誘導的RAW264.7細胞分泌NO和ROS影響

圖1 火龍果皮發(fā)酵物對LPS誘導RAW264.7細胞分泌NO和ROS的影響Fig.1 Effects of fermented Hylocereus undulatus peel on NO and ROS in LPS-induced RAW264.7 cells

NO作為重要的促炎介質(zhì)，其釋放量是評價炎癥的首要指標[26]。ROS伴隨炎癥反應(yīng)而產(chǎn)生，其誘導的細胞氧化損傷會加速炎癥進程[27]。如圖1所示，與陰性對照NC組相比，炎癥模型LPS組RAW264.7細胞NO和ROS的釋放量極顯著升高（p＜0.01）。與LPS組相比，經(jīng)不同質(zhì)量濃度FHP（100～400 μg/mL）預(yù)處理的細胞NO釋放量均顯著減少（p＜0.05或p＜0.01），且呈劑量依賴性；FHP濃度高于200 μg/mL才能顯著抑制（p＜0.05）ROS生成。此外，F(xiàn)HP濃度為400 μg/mL，其抑制NO和ROS釋放的效果分別達到陽性對照PC組85.63%和88.90%。有研究指出，NO可與炎性因子相互作用，其分泌量決定細胞內(nèi)炎性因子的生物合成能力[28]。因此，推測FHP先抑制細胞中NO生成，減少NO與炎性因子的互作，進而降低炎性因子活性。

2.4 FHP對LPS誘導RAW264.7細胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的影響

圖2 火龍果皮發(fā)酵物對LPS誘導的RAW264.7細胞因子生成的影響Fig.2 Effects of fermented Hylocereus undulatus peel on cytokines in LPS-induced RAW264.7 cells

圖2a～d顯示，與NC組相比，LPS組RAW264.7細胞分泌炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6極顯著（p＜0.01）升高，而抗炎因子IL-10濃度極顯著降低（p＜0.01），表明炎癥造模成功。與LPS組相比，添加不同濃度FHP均極顯著抑制（p＜0.01）TNF-α和IL-6的釋放，最大抑制率為68.92%和62.15%。當FHP濃度高于200 μg/mL時，可顯著抑制細胞分泌IL-1β，并提升IL-10的釋放，最大提高率為173.72%。與PC組相比，隨著FHP濃度的增加，組間的抗炎功效的差異逐漸減少。此結(jié)果與前面促炎介質(zhì)NO和ROS對FHP的響應(yīng)規(guī)律一致。這也進一步驗證了FHP是通過抑制NO釋放、降低ROS氧化損傷和提升抗炎因子的多重作用，緩解細胞炎癥反應(yīng)。

2.5 FHP對LPS誘導的RAW264.7細胞NF-κB通路及炎性因子合成基因表達的影響

NF-κB通路是由關(guān)鍵元件TLR4/MyD88/NF-κB介導的細胞感知、轉(zhuǎn)導和表達致炎信號的經(jīng)典通路，能夠引發(fā)TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥物質(zhì)的 “ 瀑布樣 ” 釋放，造成機體炎性損傷，所以長期以來NF-κB通路相關(guān)的功能元件被認為是抗炎物質(zhì)的主要靶點[29]。為明確FHP抗炎作用機制，采用RT-PCR檢測NF-κB通路的信號轉(zhuǎn)導元件及下游炎性因子合成基因的表達。由圖3可知，LPS組細胞中TLR4/MyD88/NF-κB及TNF-α/IL-1β/IL-6的相對表達量極顯著（p＜0.01）高于NC組。然而，經(jīng)不同質(zhì)量濃度FHP預(yù)處理后，與LPS組相比，細胞NF-κB通路的信號轉(zhuǎn)導基因及下游炎性因子的表達均顯著減少（p＜0.05或p＜0.01），且濃度為400 μg/mL FHP對細胞NF-κB通路的信號轉(zhuǎn)導功能抑制最佳。有文獻指出，多酚和黃酮類物質(zhì)可與細胞表面Toll樣受體競爭結(jié)合，減少致炎物與炎性信號響應(yīng)元件的接觸，沉默炎性因子合成基因表達[30]，因此，F(xiàn)HP抗炎機制可能是其功能組分中的總酚和黃酮結(jié)合TLR4，抑制NF-κB通路的信號轉(zhuǎn)導功能，下調(diào)炎性因子基因的表達，從而減少炎性因子的分泌，緩解機體炎性損傷。炎癥對機體的危害主要通過炎性損傷和氧化損傷實現(xiàn)，其發(fā)生機制與NF-κB通路和氧自由基有關(guān)[1,2,29]，PC組地塞米松可與胞內(nèi)的糖皮質(zhì)受體結(jié)合，轉(zhuǎn)位至細胞核后干擾NF-κB通路，緩解炎癥的機制已被學者闡明，且在圖3中得到驗證，F(xiàn)HP也可影響NF-κB通路，說明FHP與地塞米松有共同的抗炎機制。然而，這不代表二者抗炎機制完全一致，在2.1研究中證實的FHP具有較強抗氧化活性，能夠淬滅活性氧，減輕了炎癥反應(yīng)中的氧化損傷，綜上FHP的抗炎機制與沉默NF-κB通路功能和抗氧化作用密切相關(guān)。此外，最新研究[17]表明多酚類物質(zhì)通過 “ 腸道菌群-NF-κB通路 ” 的級聯(lián)途徑緩解機體炎癥，因此更多關(guān)于FHP的抗炎信息可在體內(nèi)研究中被挖掘。

圖3 火龍果皮發(fā)酵物對LPS誘導的RAW264.7細胞NK-κB通路元件和炎性因子表達的影響Fig.3 Effects of fermented Hylocereus undulatus peel on the genes expression of NF-κB pathway and pro-inflammatory factor in LPS-induced RAW264.7 cells

3 結(jié)論

本研究比較了火龍果發(fā)酵前后，提取物中總酚、黃酮和抗氧化活性的變化，并基于RAW264.7細胞炎癥模型探究FHP抗炎作用及機制。結(jié)果表明，火龍果皮經(jīng)干酪乳桿菌CICC20280發(fā)酵后，總酚、黃酮含量和抗氧化活性顯著升高，且能夠有效抑制促炎介質(zhì)NO和ROS生成，減少過氧化物引發(fā)的早期炎癥損傷。FHP在蛋白分泌和基因表達兩個層次上顯著抑制炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6，其作用機制是多酚和黃酮類物質(zhì)通過下調(diào)NF-κB通路的關(guān)鍵元件TLR4/MyD88/NF-κB的表達，沉默通路功能實現(xiàn)。文中探討了FHP功能組分和體外抗炎作用，而FHP物質(zhì)分離、結(jié)構(gòu)表征和體內(nèi)抗炎有待后續(xù)的研究。