張思遠，盧秀嫻，梁昭平，林舉攀，黃 芬

（1.華南農(nóng)大生物藥品有限公司，廣東廣州 510300；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東廣州 510642）

鵝星狀病毒（goose astroviruses，GoAstV）是近年危害我國養(yǎng)鵝業(yè)的重要病毒性傳染病病原之一[1]。GoAstV感染主要發(fā)生于3周齡以內(nèi)的小鵝，導(dǎo)致其出現(xiàn)食欲下降、精神萎靡、腳軟等臨床癥狀，以及腎臟等內(nèi)臟組織及關(guān)節(jié)腔發(fā)生白色尿酸鹽沉積，死亡率較高，可達50%[2]。星狀病毒（astroviruses，AstV）1975年首次被發(fā)現(xiàn)，是一種單股正鏈RNA病毒，無囊膜[3]，存在于多種動物體內(nèi)，對其感染宿主既有種屬特異性，也具有跨種間傳播能力，對新宿主、新環(huán)境適應(yīng)能力很強[4]。不同種屬的AstV基因組間長度差異較大，全長6.1～7.9 kb，含有5'端未翻譯區(qū)（untranslation region，UTR）、3個開放性閱讀框（ORF1a、ORF1b和ORF2）、3'UTR及多聚腺苷酸（PolyA）尾[5]。不同種屬AstV的3個ORFs中變異性最大的是ORF2，內(nèi)部容易出現(xiàn)氨基酸突變[6]。

近年來，我國部分地區(qū)商品雛鵝群陸續(xù)發(fā)生高度致死性內(nèi)臟痛風(fēng)病，其中AstV感染是主要病因之一，給養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。為進一步了解我國GoAstV的遺傳變異方向，對2019年山東、江蘇、廣東、安徽等省份分離到的10株新型GoAstV進行ORF2基因序列測定及遺傳進化分析，以期為該病防治提供流行病學(xué)數(shù)據(jù)，為深入研究該病致病特點奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒

毒株由華南生物公司動物疫病診斷中心實驗室從山東、江蘇、廣東、安徽等省份發(fā)病鵝病料中分離，經(jīng)RT-PCR鑒定為新型GoAstV。其中：AstV/Goose/GD35/2019、AstV/Goose/GD776/2019分離自廣東省，AstV/Goose/JS166/2019、AstV/Goose/JS343/2019、AstV/Goose/JS376/2019、AstV/Goose/JS944/2019分離自江蘇省，AstV/Goose/SD534/2019、AstV/Goose/SD1008/2019分離在山東 省，AstV/Goose/AH605-1/2019、AstV/Goose/AH605-2/2019分離自安徽省。

1.2 主要試劑及儀器

核酸自動提取試劑盒，購自天隆公司；pMD19-T載體、DL 2 000 DNA Marker，購自TAKARA公司；2×TaqPlus Master Mix，購自Vazyme公司；Fast King RT Kit With gDNase、瓊脂糖凝膠回收試劑盒以及核酸染料，購自天根公司產(chǎn)品。全自動樣品快速研磨儀，購自QIAGEN公司；核酸自動提取儀，購自西安天隆公司；PCR儀，購自伯樂公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

參照NCBI官網(wǎng)GenBank中登錄的GoAstV序列，采用Primer 6.0軟件設(shè)計ORF2基因全長擴增引物序列（表1）。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

表1 GoAstV ORF2基因全長引物序列

1.4 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

按照天隆公司的核酸自動提取試劑盒使用說明書提取病毒總RNA，根據(jù)天根公司的Fast King RT Kit With gDNase試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后置-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ORF2基因擴增及測序

以上述cDNA為模板進行GoAstV的ORF2基因擴增。RT-PCR反應(yīng)體系為50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s、53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；終延伸72 ℃ 5 min，4 ℃保存。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果；切下目的片段，按切膠回收試劑盒使用說明書進行目的片段回收，然后連接到 pMD19-T載體；將目的基因轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞宿主菌，37 ℃培養(yǎng)后，挑取單個菌落于LB液體培養(yǎng)基（含有氨芐青霉素）中振蕩培養(yǎng)14～16 h；經(jīng)PCR鑒定陽性克隆菌液后，提取陽性質(zhì)粒送至上海生工生物工程有限公司廣州測序部測序，測序結(jié)果用DNAstar軟件進行拼接分析。

1.6 ORF2基因序列分析

將運用DNAstar和MEGA7.0等生物軟件獲得的GoAstV ORF2基因序列與GenBank下載的參考序列比對，進行同源性比較和基因序列分析。

2 結(jié)果

2.1 ORF2基因擴增

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，成功擴增到ORF2基因片段，與預(yù)期擴增長度一致，約2.2 kb（圖1）。

圖1 10株新型GoAstV ORF2基因PCR擴增結(jié)果

2.2 ORF2基因同源性分析

本試驗的10株毒株ORF2基因編碼區(qū)均由2 115個核苷酸組成，編碼705個氨基酸。10株GoAstV毒株間ORF2基因核苷酸同源性為96.2%～99.9%，氨基酸同源性為96.3%～99.9%；10株病毒與目前已公布的流行毒株序列同源性較高，核苷酸同源性為96.3%～99.2%，氨基酸同源性為96.3%～99.4%；與能導(dǎo)致雛鵝腸炎的AstV（FLX）及其他種屬禽源AstV的核苷酸及氨基酸同源性相對較低，僅為26.5%～57.3%。

2.3 ORF2氨基酸變異分析

將10株GoAstV與其他AstV分離株進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ORF2基因N端保守性較高，而C端存在差異性。本試驗以AstV/Goose/SDPY/1116/17為參考毒株進行氨基酸位點分析，發(fā)現(xiàn)10株毒株之間存在部分氨基酸位點差異，分別位于第26、225、229、268、284、376、379、424、456、464，540、587、610、614、695位氨基酸（表2）。這些突變位點主要集中在衣殼蛋白的纖突結(jié)構(gòu)。

表2 10株GoAstV ORF2蛋白主要氨基酸位點比較

2.4 ORF基因遺傳進化分析

將分離株與GenBank上下載的序列進行ORF2基因序列遺傳進化樹分析，發(fā)現(xiàn)10株分離毒株與近年報道的引起痛風(fēng)的新型病毒AstV/Goose/SDPY/1116/17等聚成1個分支，親緣關(guān)系最近，與其他AstV遺傳距離較遠，形成獨立的進化支（圖2）。

圖2 10株GoAstV與參考毒株ORF2基因序列遺傳進化樹

3 討論

新型GoAstV感染作為一種新發(fā)傳染病，2017年被我國研究人員首次報道[7]，隨后越來越多的感染病例被發(fā)現(xiàn)。感染AstV的鵝主要表現(xiàn)為精神沉郁、行動遲緩、關(guān)節(jié)腫脹、站立不穩(wěn)、單腳跛行等臨床癥狀[8]，以及關(guān)節(jié)腔及腎臟等內(nèi)臟器官的嚴重尿酸鹽沉積等病理變化。該病發(fā)病率和死亡率均較高，給養(yǎng)鵝業(yè)造成了重大經(jīng)濟威脅。AstV具有宿主多樣、跨種傳播以及適應(yīng)新宿主、新環(huán)境能力強等特點，能引起廣泛疾病，如雞感染AstV會導(dǎo)致腹瀉性腸炎和腎炎[9]，雛鴨感染則引起病毒性肝炎[10]等，不同宿主感染后所出現(xiàn)的臨床癥狀及病變差異性較大。AstV還可以通過胚胎垂直傳播，使得AstV凈化異常困難[11]。

AstV的衣殼蛋白主要由ORF2基因編碼，是其主要結(jié)構(gòu)蛋白，其中衣殼內(nèi)側(cè)的殼體蛋白由第73～256位氨基酸組成，而第425～665位氨基酸則構(gòu)成殼體外側(cè)的纖突蛋白[12]；纖突蛋白是AstV主要的抗原決定蛋白，病毒的主要中和抗體表位于此蛋白上，并且能介導(dǎo)細胞表面受體與病毒粒子的結(jié)合[13]。AstV的ORF2基因編碼的衣殼蛋白也是AstV種屬、基因分型的劃分依據(jù)[14]。衣殼蛋白作為AstV的結(jié)構(gòu)屏障，可與宿主抗體、補體發(fā)生相互作用，激發(fā)宿主免疫應(yīng)答，在病毒粒子組裝以及入侵宿主細胞等過程發(fā)揮極大作用[15]。AstV的ORF2基因N端保守性較高，其編碼的蛋白位于病毒粒子外表面，富含堿性氨基酸，參與識別細胞表面相關(guān)受體及機體的免疫應(yīng)答，并參與病毒基因組的包裝與衣殼芯的形成；C端屬于高變區(qū)，其編碼的蛋白是病毒主要的抗原決定性蛋白，在病毒粒子表面形成纖突結(jié)構(gòu)，參與病毒與宿主細胞膜融合，在病毒感染和致病過程中產(chǎn)生重要影響[16]。

本試驗對2019年我國部分地區(qū)分離到的10株新型GoAstV進行ORF2基因序列測定及遺傳進化分析，發(fā)現(xiàn)毒株與近年新型GoAstV流行毒株遺傳關(guān)系最近，10株毒株之間的氨基酸同源性介于96.3%～99.4%。與參考毒株AstV/Goose/SDPY/1116/17相比較，10株毒株的ORF2基因編碼氨基酸序列差異主要集中在衣殼蛋白的纖突結(jié)構(gòu)；由于纖突蛋白在病毒致病過程中起到重要作用，相關(guān)氨基酸位點差異可能會導(dǎo)致病毒致病性不同，但能否對蛋白的構(gòu)象、功能以及病毒毒力構(gòu)成影響，仍需進一步研究。本試驗中有4株出現(xiàn)了E456D以及L540Q突變。這兩個位點氨基酸易接觸抗體，以至于受到的抗體壓力較強。另外有4株Q229P、1株T376A、1株A614N氨基酸發(fā)生突變。這些位點與病毒遺傳進化有關(guān)，可激發(fā)易感宿主產(chǎn)生特異性抗體，在外界環(huán)境及抗體作用壓力下加快病毒進化，從而累積更多的變異點。病毒不同傳代代次全基因組序列分析[17]表明，在病毒連續(xù)傳代過程中，衣殼蛋白出現(xiàn)了6個氨基酸位點突變，分別位于衣殼蛋白的第26、284、489、610、650和660位。本試驗中只有1株E610G發(fā)生突變，有可能促使改變其編碼蛋白構(gòu)象，對雛鵝的致病力變?nèi)酢ｑT崇倫等[18]對衣殼蛋白晶體結(jié)構(gòu)進行解析，發(fā)現(xiàn)GoAstV衣殼蛋白P2結(jié)構(gòu)域內(nèi)第489、610、650、660位氨基酸的變異，可能會改變其編碼蛋白VP27的相關(guān)構(gòu)象，對病毒粒子在雛鵝體內(nèi)的增殖造成影響，從而降低病毒對雛鵝的致病力。

GoAstV感染是導(dǎo)致鵝痛風(fēng)的主要原因之一。另外造成鵝痛風(fēng)的原因還有其他內(nèi)外源性因素，如長時間攝入高蛋白質(zhì)飼料引發(fā)的蛋白質(zhì)代謝障礙和腎臟損傷等[19]，因此需要注意與新型GoAstV引起痛風(fēng)病的鑒別診斷。本試驗對我國部分地區(qū)分離到的10株新型GoAstV進行ORF2基因序列分析比較，發(fā)現(xiàn)毒株之間存在氨基酸位點突變，這為后續(xù)深入研究新型GoAstV的分子生物學(xué)特性及其疫苗研制提供了數(shù)據(jù)參考。