趙魚扉，史政榮

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，重慶）

0 引言

原發(fā)性肝癌是全球致死率第三的惡性腫瘤，在亞洲地區(qū)大多因乙型肝炎病毒感染導(dǎo)致，其好發(fā)于中年人群，且男性發(fā)病率更高[1]。原發(fā)性肝癌病因尚未明確，而肝硬化、肝炎病毒復(fù)制活躍被認(rèn)為與其發(fā)病相關(guān)，且大多數(shù)肝癌早期患者臨床癥狀不典型，常常錯(cuò)過了最佳診療時(shí)機(jī)[2]。ki67 是一種反應(yīng)細(xì)胞增殖活躍程度的相關(guān)抗原，有研究表明在惡性腫瘤患者中，其表達(dá)率越高，預(yù)后越差[3]。有研究表明ki67 在肝癌患者中的表達(dá)水平能一定程度上預(yù)測肝細(xì)胞癌（HCC）的術(shù)后復(fù)發(fā)[4]。高通量藥物敏感性篩選是一種確定藥物敏感性的新方法，具有藥物覆蓋范圍廣、效率高和個(gè)性化強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。與其他藥物敏感性篩選方法相比，它具有經(jīng)濟(jì)、檢測迅速、易于推廣的優(yōu)點(diǎn)[5]。本項(xiàng)研究通過使用高通量藥物敏感性篩選來鑒定個(gè)體患者的HCC 細(xì)胞敏感藥物，再比較這些藥物在ki67 高表達(dá)組與低表達(dá)組中對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率，根據(jù)其結(jié)果在一定程度上指導(dǎo)臨床用藥。目前國內(nèi)外關(guān)于ki67 與體外藥敏實(shí)驗(yàn)的研究甚少，本課題組之前已經(jīng)證明了體外高通量藥敏實(shí)驗(yàn)?zāi)茉谝欢ǔ潭壬现笇?dǎo)臨床用藥，本次實(shí)驗(yàn)擬評(píng)估其與免疫組化指標(biāo)ki67 之間的關(guān)系，也在一定程度上指導(dǎo)臨床用藥[6]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013 年1 月至2017 年6 月于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科接受根治性腫瘤切除術(shù)的64 例肝癌患者，手術(shù)過程中取病灶組織進(jìn)行高通量藥敏實(shí)驗(yàn)，并使用免疫組織化學(xué)法測定各標(biāo)本ki67 表達(dá)率，將ki67 高表達(dá)（ki67＞25%）的患者設(shè)為觀察組，將ki67 低表達(dá)（ki67＜25%）的設(shè)為對(duì)照組。共64 例肝癌患者，其中ki67 高表達(dá)組患者36 例，ki67低表達(dá)組患者28 例，各組臨床資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。納入研究的所有患者術(shù)前均顯示HCC，術(shù)中腫瘤完全切除，術(shù)后經(jīng)病理檢查發(fā)現(xiàn)HCC，膽管癌或混合細(xì)胞癌，并具有特定的免疫組化結(jié)果。所有患者均提供書面知情同意書，該研究得到重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（第2019-021 號(hào)），并符合1975 年修訂的《赫爾辛基宣言》倫理準(zhǔn)則。已在中國臨床試驗(yàn)中心（https://www.chictr.org.cn）注冊，注冊號(hào)為ChiCTR1900022193。

1.2 方法

所有肝癌患者標(biāo)本均運(yùn)輸并保存在4 ℃下。通過用消化酶消化獲得原代癌細(xì)胞。在體外擴(kuò)增癌細(xì)胞后將細(xì)胞懸浮液（10 μL）加入RPMI 1640 培養(yǎng)基（80 μL）中并與臺(tái)盼藍(lán)染料充分混合。然后將混合物的等分試樣（10 μL）放在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，對(duì)四個(gè)大正方形中的細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)胞濃度（細(xì)胞數(shù)/1 mL 細(xì)胞懸液）的計(jì)算公式為：4 個(gè)大方塊中的細(xì)胞總數(shù)/4×104×10（稀釋倍數(shù)）。通過比較死細(xì)胞（染色為藍(lán)色）和活細(xì)胞（未染色）的數(shù)量來評(píng)估原代細(xì)胞的生存能力。為了評(píng)估藥物敏感性，將原代癌細(xì)胞接種到臨床藥物篩選板上，用臨床實(shí)踐中使用的藥物（單一療法或聯(lián)合療法，共14 種藥物）進(jìn)行治療。其中單一藥物有表柔比星、氟尿嘧啶、索拉非尼等，藥物組合的例子是阿霉素+奧沙利鉑和吉西他賓+奧沙利鉑。這些濃度是臨床實(shí)踐中使用的濃度，符合國際藥物標(biāo)準(zhǔn)。將抑制率＞40%的結(jié)果設(shè)置為藥物有效。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，采用率（%）表示，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 使用單藥如表柔比星、氟尿嘧啶等在ki67 不同表達(dá)組中的比較

在體外藥敏實(shí)驗(yàn)中使用表柔比星、氟尿嘧啶等單一藥物，ki67 高表達(dá)組與低表達(dá)組在腫瘤增殖抑制率上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表1、表2。

表1 表柔比星在ki67 不同表達(dá)組中的比較[n(%)]

表2 氟尿嘧啶在ki67 不同表達(dá)組中的比較[n(%)]

2.2 聯(lián)合用藥如吉西他賓+奧沙利鉑等在ki67 不同表達(dá)組中的比較

在體外藥敏實(shí)驗(yàn)中使用吉西他賓+奧沙利鉑聯(lián)合用藥，ki67 高表達(dá)組與低表達(dá)組在腫瘤增殖抑制率上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表3。

表3 吉西他賓+奧沙利鉑在ki67 不同表達(dá)組中的比較[n(%)]

2.3 使用阿霉素+奧沙利鉑在ki67 不同表達(dá)組中的比較

在體外藥敏實(shí)驗(yàn)中使用阿霉素+奧沙利鉑聯(lián)合用藥，ki67 高表達(dá)組中陽性率明顯高于ki67 低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表4。

表4 阿霉素+奧沙利鉑在ki67 不同表達(dá)組中的比較[n(%)]

3 討論

在本項(xiàng)研究中，我們通過體外高通量藥物敏感性來評(píng)估，對(duì)于個(gè)體患者的腫瘤細(xì)胞，哪些藥物能有效抑制其增殖[7-8]。再通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，分析ki67 表達(dá)不同的患者與體外高通量藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系，得出結(jié)論：在ki67 高表達(dá)肝癌患者的體外藥敏實(shí)驗(yàn)中，使用阿霉素+奧沙利鉑能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。由于本科研組已在之前研究中證明了，體外高通量藥敏實(shí)驗(yàn)?zāi)茉谝欢ǔ潭壬现笇?dǎo)臨床用藥[9-10]。所以本次研究的結(jié)果，我們認(rèn)為也能在一定程度上指導(dǎo)臨床用藥，即術(shù)后病檢提示ki67 高表達(dá)的肝癌患者，使用阿霉素+奧沙利鉑聯(lián)合用藥，更有利于患者預(yù)后。

細(xì)胞核ki67 蛋白與細(xì)胞增殖有關(guān)，其在G2/M 期高表達(dá)。而阿霉素等化療藥物的藥理作用為進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)干擾轉(zhuǎn)錄過程，阻止mRNA 的合成，在細(xì)胞分裂的G2 期阻斷細(xì)胞周期及抑制腫瘤生長，筆者推測，這可能是ki67 高表達(dá)患者使用阿霉素+奧沙利鉑聯(lián)合用藥后腫瘤細(xì)胞抑制更有效的原因[11]。本研究為單中心、小樣本的研究，存在一定的局限性，且此次研究僅為體外藥敏實(shí)驗(yàn)與免疫組化間的對(duì)照，并未結(jié)合患者在臨床上的復(fù)發(fā)及總體生存率，一項(xiàng)多中心的、前瞻性的臨床研究是下一步研究的方向。