丁 陽， 吳 瓊， 李 林

(南京工業(yè)大學(xué) 先進(jìn)材料研究院，江蘇 南京 210000)

1 背景

抗生素的誕生在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展史上具有里程碑的意義，也是最成功的藥物之一。這些小分子化合物在感染性疾病的治療中發(fā)揮著重要作用，挽救了數(shù)百萬人的生命。常用的抗生素包括β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類等。β-內(nèi)酰胺類為最典型、最常見的抗生素，其臨床醫(yī)療使用率超過50%。如圖1所示，常見的β-內(nèi)酰胺類抗生素根據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類和單環(huán)類等4類，不同的藥物結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)獨(dú)特的抗菌譜，β-內(nèi)酰胺抗生素的選擇取決于實(shí)際臨床感染疾病的病因和嚴(yán)重程度。β-內(nèi)酰胺類抗生素含有的β-內(nèi)酰胺四元環(huán)是藥物發(fā)揮活性的重要藥效基團(tuán)，但四元環(huán)的鍵角小、環(huán)張力大等特點(diǎn)容易受其他因素的影響，發(fā)生開環(huán)，失去藥物活性。

圖1 常見β-內(nèi)酰胺抗生素的結(jié)構(gòu)和分類

抗生素的濫用，導(dǎo)致部分致病菌產(chǎn)生了β-內(nèi)酰胺酶，最終產(chǎn)生對(duì)抗生素的嚴(yán)重耐藥性，降低了抗菌藥物療效。β-內(nèi)酰胺酶是一種水解酶，能破壞β-內(nèi)酰胺類抗生素的β-內(nèi)酰胺四元環(huán)，使藥物失效。自20世紀(jì)40年代首次發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)酰胺酶以來，到2018年為止已鑒定出近2 800種類型的β-內(nèi)酰胺酶。2018年，世界衛(wèi)生組織(WHO)的全球抗菌素監(jiān)測系統(tǒng)(GLASS)顯示，全球22 個(gè)國家由于抗生素耐藥導(dǎo)致的感染約有50萬人。針對(duì)不斷進(jìn)化和傳播的β-內(nèi)酰胺酶，科研人員開發(fā)了一系列特異性檢測和抑制酶的活性的方法。熒光探針是β-內(nèi)酰胺酶檢測和監(jiān)控的重要診斷工具。同時(shí)，β-內(nèi)酰胺酶抑制劑可以保護(hù)抗生素的藥物活性免受β-內(nèi)酰胺酶的水解。目前臨床常用的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑包括克拉維酸鉀、舒巴坦和他唑巴坦。然而，隨著β-內(nèi)酰胺酶的不斷變異，耐藥菌的威脅與日俱增。因此，有必要明確β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生活性的關(guān)鍵信號(hào)分子，探索新的臨床檢測方法和抑制劑，應(yīng)對(duì)日益惡化的耐藥情況。

2 β-內(nèi)酰胺酶的水解機(jī)理和分類

β-內(nèi)酰胺酶特異性產(chǎn)生于細(xì)菌中，可與青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)結(jié)合并進(jìn)行?；?，在抗生素到達(dá)適合的靶向位點(diǎn)前將其水解，從而使抗生素失活。β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生既可以通過染色體編碼，如銅綠假單胞菌；又可以通過質(zhì)粒傳播，如嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌等。大約有80%耐藥菌的耐藥類型都與β-內(nèi)酰胺酶有關(guān)。如圖2所示的青霉素水解過程，β-內(nèi)酰胺酶首先與抗生素形成非共價(jià)的Michaelis復(fù)合物，然后酶的空腔中絲氨酸的游離羥基入侵β-內(nèi)酰胺四元環(huán)，形成共價(jià)的?；ゲ⑵茐乃脑h(huán)，使得抗生素與β-內(nèi)酰胺酶形成了穩(wěn)定復(fù)合物。酶在水分子的進(jìn)攻使下脫落，最終形成沒有藥物活性的抗生素和恢復(fù)了活性的β-內(nèi)酰胺酶。

圖2 β-內(nèi)酰胺酶與青霉素反應(yīng)的水解機(jī)理

根據(jù)氨基酸的同源性，β-內(nèi)酰胺酶最常見的是通過Ambler 分類法分為A、B、C和D 4類。其中A、C 和D 類β-內(nèi)酰胺酶的催化中心是絲氨酸，B 類β-內(nèi)酰胺酶的催化中心是金屬離子，屬于金屬類β-內(nèi)酰胺酶。通過底物類型也可將β-內(nèi)酰胺酶分為青霉素酶、頭孢菌素酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和碳青霉烯酶。Bush 分類法是通過水解底物的特異性和對(duì)克拉維酸的敏感性對(duì)β-內(nèi)酰胺酶分類。如今，由于細(xì)菌的迅速傳播和β-內(nèi)酰胺酶的基因突變使耐藥菌引起的感染和疾病越來越難以治療。

3 β-內(nèi)酰胺酶的檢測

目前，β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性的檢測方法主要包括表型、基因和酶學(xué)檢測。表型檢測即檢測細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性，包括瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、最低抑菌濃度(MIC)試驗(yàn)、雙盤協(xié)同試驗(yàn)(DDST)和改良霍奇試驗(yàn)(MHT)?；驒z測方法主要通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行。實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄酶可以檢測細(xì)菌耐藥基因的定量表達(dá)。質(zhì)譜和氫譜也被用于檢測β-內(nèi)酰胺酶耐藥菌。近年來，生物環(huán)境內(nèi)的標(biāo)志物識(shí)別與檢測已成為化學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域的重要研究課題之一。

3.1 不同報(bào)告基團(tuán)的探針

1998年Zlokarnik等首次報(bào)道了一種基于頭孢菌素結(jié)構(gòu)的熒光探針(CCF2/AM)，如圖3a所示，該探針通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理成功監(jiān)測了β-內(nèi)酰胺酶活性。酶水解CCF2后，香豆素發(fā)出藍(lán)色熒光。由于FRET探針依賴于相對(duì)復(fù)雜和龐大的分子結(jié)構(gòu)，降低了其進(jìn)入細(xì)胞后與標(biāo)記物反應(yīng)的效率，因此2003年，Gao等開發(fā)了新型的小分子熒光底物CR2/AM，用于β-內(nèi)酰胺酶的活性檢測。如圖3b所示，在酶的作用下，頭孢菌素類熒光底物釋放出試鹵靈染料。該底物表現(xiàn)出對(duì)β-內(nèi)酰胺酶優(yōu)秀的特異性和靈敏度，可檢測和成像C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的β-內(nèi)酰胺酶活性。

圖3 (a) CCF2/AM與β-內(nèi)酰胺酶的反應(yīng)過程.(b)CR2和β-內(nèi)酰胺酶的反應(yīng)過程；CR2/AM在野生型(I)和轉(zhuǎn)染β-內(nèi)酰胺酶的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(II)中的細(xì)胞成像Fig.3 (a) Reaction process of CCF2/AM with β-lactamase; (b) Reaction process of CR2 and bioimaging of CR2/AM incubated (I) wild-type and (II) Bla stably transfected C6 glioma cells

然而，這種小分子熒光探針短的吸收和發(fā)射波長，限制了其在活體成像中的應(yīng)用。近年來，近紅外光譜在化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注。其具備較長的激發(fā)/發(fā)射波長，產(chǎn)生的自熒光背景較少，損傷較小，組織穿透性較高，在生物成像中顯示出良好的應(yīng)用前景。2005年，Xing等基于FRET設(shè)計(jì)出一系列近紅外探針CNIR，檢測C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的β-內(nèi)酰胺酶。如圖4a所示，Cy5.5通過氨基乙?；B接到頭孢菌素的氨基基團(tuán)上，QSY21通過四氨基噻吩和半胱氨酸連接到頭孢菌素的3′位點(diǎn)上，通過乙?；谀负松弦氚被咸烟穷愃莆?，增強(qiáng)探針在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的檢測穩(wěn)定性。CNIR在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的β-內(nèi)酰胺酶具有良好的檢測能力和實(shí)時(shí)成像功能。2014年，Li等將頭孢菌素與半花青素染料結(jié)合，開發(fā)了一種高靈敏度的近紅外熒光探針(Probe 1)檢測金黃色葡萄球菌中的β-內(nèi)酰胺酶，如圖4b所示。與CNIR相比，Probe 1不僅分子結(jié)構(gòu)更簡單，而且具有更好的光學(xué)性能。

圖4 (a)CNIR的結(jié)構(gòu),CNIR4在野生型(I)和轉(zhuǎn)染β-內(nèi)酰胺酶的C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(II)中的細(xì)胞成像;(b)Probe 1與β-內(nèi)酰胺酶的反應(yīng)過程；Probe 1在不同金黃色葡萄球菌中的成像:(III)ATCC BAA44；(IV)ATCC 11632；(V)ATCC 29213

3.2 不同特異性的探針

以上報(bào)道的探針結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)均基于第一代頭孢菌素。然而由于β-內(nèi)酰胺酶的進(jìn)化，第一代頭孢菌素會(huì)被所有類型的β-內(nèi)酰胺酶水解，因此根據(jù)第一代所設(shè)計(jì)的探針也會(huì)與所有類型的β-內(nèi)酰胺酶反應(yīng)，不具有選擇性。2012年，Zhang等基于FRET機(jī)制在第三代頭孢菌素頭孢噻肟的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出檢測ESBLs的對(duì)照組熒光探針C-1和C-2。如圖5(a)所示，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在頭孢菌素核心空間位阻較小的探針能被β-內(nèi)酰胺酶TEM-1快速水解，而C-2水解非常緩慢。該方法在一定程度上可以防止抗生素的一些不合理使用。2017年，Aw等通過在頭孢菌素母核的7位上引入一個(gè)大的位阻甲氧巰基，設(shè)計(jì)了一種用于檢測AmpC的特異性探針ERM-1。如圖5b所示，ERM-1利用聚集誘導(dǎo)發(fā)射(AIE)機(jī)制選擇性熒光標(biāo)記AmpC，并直接觀察到耐藥菌生物膜的形成。

圖5 (a)探針C-1和C-2的結(jié)構(gòu)；(b)探針ERM-1的結(jié)構(gòu)和與AmpC的反應(yīng)過程Fig.5 (a) Structures of probe C-1, C-2；(b) Structure and the process of probe ERM-1 reaction with AmpC

所有金屬類β-內(nèi)酰胺酶都屬于碳青霉烯酶。2008年，新德里金屬類β-內(nèi)酰胺酶 (NDM)的出現(xiàn)將碳青霉烯耐藥細(xì)菌的研究推向了高潮。碳青霉烯酶對(duì)碳青霉烯類抗生素構(gòu)成嚴(yán)重威脅，幾乎可以水解所有β-內(nèi)酰胺類抗生素。因此，有必要設(shè)計(jì)和合成能夠高選擇性檢測含碳青霉烯酶病原體的試劑。Rao等根據(jù)碳青霉烯類抗生素的6,7反式結(jié)構(gòu)，將頭孢菌素母核上的順式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為反式結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了系列探針(S)-CC，首次實(shí)現(xiàn)了選擇性檢測腸桿菌科中的碳青霉烯酶，如圖6(a)所示。然而，探針(S)-CC熒光染料的發(fā)射波長短，檢測靈敏度低等限制了在臨床上的應(yīng)用。2017年，Xie等受(S)-CC結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，合成出能夠準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定地鑒定碳青霉烯酶的底物，同時(shí)利用BODIPY 作為熒光染料設(shè)計(jì)出具有良好的光學(xué)性質(zhì)和臨床應(yīng)用前景的探針CB-1，如圖6(b)所示。

圖6 (a)探針(S)-CC的設(shè)計(jì)路線和被碳青霉烯酶水解的過程；(b)碳青霉烯酶特異性探針CB-1的設(shè)計(jì)路線

4 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑

β-內(nèi)酰胺酶抑制劑能夠抑制導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的β-內(nèi)酰胺酶活性。它與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用，以保護(hù)其不被水解，從而有效地對(duì)抗耐藥細(xì)菌。Drawz和Bonomo總結(jié)了過去30年里β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的研究。目前，商業(yè)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑主要由克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦和阿維巴坦克拉維酸主導(dǎo)，前三種均為β-內(nèi)酰胺酶經(jīng)典抑制劑，其結(jié)構(gòu)如圖7所示。這些經(jīng)典的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑與β-內(nèi)酰胺酶發(fā)生不可逆反應(yīng)，形成共價(jià)化合物，在臨床上經(jīng)常與抗生素聯(lián)合使用。

圖7 三種經(jīng)典的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑

4.1 基于β-內(nèi)酰胺四元環(huán)的經(jīng)典β-內(nèi)酰胺酶抑制劑

克拉維酸是臨床上第一種對(duì)β-內(nèi)酰胺酶具有高度特異性的抑制劑。不同于頭孢菌素，雖然克拉維酸的抗菌活性較弱，但無論是在體內(nèi)還是體外，它都對(duì)革蘭氏陽性和陰性耐藥菌有抑制作用。如圖8所示，其與β-內(nèi)酰胺酶反應(yīng)的主要機(jī)理是丙烯酸酯的形成。絲氨酸70打開β-內(nèi)酰胺環(huán)后，惡唑通過重排形成酮衍生物。最后，在絲氨酸130的作用下，通過多步重排產(chǎn)生酰化復(fù)合物使酶失活。盡管克拉維酸是一種廣譜、強(qiáng)效、不可逆的抑制劑，但是對(duì)C類β-內(nèi)酰胺酶無效。注射用替卡西林二鈉和克拉維酸鉀的聯(lián)合使用對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、克雷伯氏菌等多種細(xì)菌感染有效。

圖8 克拉維酸和TEM-1的反應(yīng)機(jī)理

舒巴坦是一種臨床上用作β-內(nèi)酰胺酶半合成的青霉烷基砜抑制劑。與克拉維酸相比，舒巴坦具有相似的抑制菌譜、反應(yīng)機(jī)制，并且對(duì)C類β-內(nèi)酰胺酶無效。抑菌能力略低于克拉維酸，但穩(wěn)定性較好，抑菌效果較好。臨床上舒巴坦鈉鹽主要用于注射，口服藥多為復(fù)合制劑。舒巴坦相關(guān)復(fù)合制劑的出現(xiàn)擴(kuò)大了舒巴坦的抗菌譜，但有研究報(bào)道氨芐西林與舒巴坦對(duì)銅綠假單胞菌的聯(lián)合治療無明顯協(xié)同作用。他唑巴坦屬于舒巴坦衍生物，是一種廣譜β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，對(duì)C類β-內(nèi)酰胺酶有較好的抑制作用，且不產(chǎn)生誘導(dǎo)酶。由于他唑巴坦因其毒性低、對(duì)酶的抑制作用強(qiáng)、穩(wěn)定性好，是目前最有前途的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑。

4.2 無β-內(nèi)酰胺四元環(huán)的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑

阿維巴坦、瑞來巴坦和法硼巴坦是非β-內(nèi)酰胺四元環(huán)抑制劑開發(fā)的主要進(jìn)展對(duì)象。2015年2月25日，美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了一種新的抗生素/抑制劑組合AVYCAZ?(Ceftazime-Avibactam)，該藥物由阿特維斯(Actavis)和阿斯利康(AZN)聯(lián)合開發(fā)。頭孢他啶-阿維巴坦主要用于治療成人并發(fā)尿路感染、并發(fā)腹膜內(nèi)感染等疾病。阿維巴坦屬于重氮雜-2-環(huán)辛烷類化合物，抗菌活性較弱，但可被β-內(nèi)酰胺酶酰化。如圖9a所示的機(jī)理，最初是酶的活性中心形成Michaelis復(fù)合物，絲氨酸-OH親核攻擊阿維巴坦的β-內(nèi)酰胺環(huán)，導(dǎo)致酰胺鍵斷裂。此時(shí)酶處于抑制狀態(tài)。然后環(huán)閉合表現(xiàn)出抑制活性。與經(jīng)典的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑相比，阿維巴坦具有更廣泛的抑菌活性和更有效的抑菌活性?？山档虯、C類和部分D類β-內(nèi)酰胺酶的復(fù)活率。瑞來巴坦和阿維巴坦均具有二氮雜環(huán)辛烷結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)如圖9b所示。瑞來巴坦對(duì)A類和C類β-內(nèi)酰胺酶有顯著抑制作用，亞胺培南聯(lián)合瑞來巴坦可使亞胺培南對(duì)表達(dá)AmpC的耐藥菌的最小抑菌濃度降低4倍。然而，瑞來巴坦并不能抑制D類β-內(nèi)酰胺酶中的碳青霉烯酶。如圖9c所示，法硼巴坦是一種廣譜抑制劑，屬于有機(jī)硼酸類，通過與絲氨酸殘基相互作用發(fā)揮抑制作用。法硼巴坦對(duì)多種A、C類及部分D類β-內(nèi)酰胺酶均有顯著抑制作用，與其他抗生素聯(lián)合使用可有效治療多重耐藥革蘭氏陰性菌感染。法硼巴坦-美羅培南聯(lián)合用藥也于2017年在美國獲準(zhǔn)上市。

圖9 (a)阿維巴坦與β-內(nèi)酰胺酶的反應(yīng)機(jī)理;(b)瑞來巴坦和(c)法硼巴坦的結(jié)構(gòu)

5 總結(jié)和展望

如今，我們已經(jīng)進(jìn)入了“后抗生素時(shí)代”。β-內(nèi)酰胺酶的傳播和變異削弱了抗生素的效力，對(duì)生命健康和全球發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。人們嘗試改變?chǔ)?內(nèi)酰胺類抗生素的結(jié)構(gòu)以提高藥物的穩(wěn)定性。然而，病原菌通過基因突變不斷適應(yīng)新型抗生素。因此，研究β-內(nèi)酰胺酶探針和抑制劑對(duì)合理選擇抗生素、治療感染性疾病具有重要的臨床意義。

分子結(jié)構(gòu)的模擬對(duì)接與相關(guān)疾病模型的建立對(duì)β-內(nèi)酰胺酶探針結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)和篩選大有裨益。盡管由碳青霉烯酶產(chǎn)生的耐藥菌是目前疾病感染研究的重點(diǎn)，但是相關(guān)的探針和生物應(yīng)用較少，具有重要的研究意義。由于大多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶的空間構(gòu)象和活性位點(diǎn)的水解機(jī)制已經(jīng)闡明，這為β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的設(shè)計(jì)提供了基礎(chǔ)。同時(shí)，β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的設(shè)計(jì)和開發(fā)還需要考慮藥代動(dòng)力學(xué)過程，分子跨膜能力、親和力和抑制活性等問題。隨著化學(xué)生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的β-內(nèi)酰胺酶探針和抑制劑具有更高的選擇性和更強(qiáng)的相容性，這將為克服日益嚴(yán)重的抗生素耐藥現(xiàn)狀提供有力的保障。