熊永潔， 殷啟潤， 李 靜， 劉德義， 賀紹君

(安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

熱應(yīng)激作為一種非特異性的環(huán)境應(yīng)激，可對(duì)畜禽的生產(chǎn)繁殖效率、生產(chǎn)性能產(chǎn)生諸多不利影響。隨著畜牧業(yè)集約化和產(chǎn)業(yè)化程度的不斷提高，由于受到降溫成本、降溫設(shè)備設(shè)施和降溫效率等諸多因素的影響，規(guī)?；曫B(yǎng)的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，尤其是種公畜往往長時(shí)間處于熱應(yīng)激狀態(tài)而影響?zhàn)B殖經(jīng)濟(jì)效益，如引起睪丸生殖激素分泌功能紊亂、睪丸生理機(jī)能減退、精液品質(zhì)急劇下降、死精數(shù)量和精子畸形率增加，造成公畜種用性能急劇下降，進(jìn)而嚴(yán)重影響?zhàn)B殖的經(jīng)濟(jì)效益。因此，如何有效預(yù)防和減少熱應(yīng)激對(duì)公畜繁殖能力的危害、進(jìn)而提高公畜的精液品質(zhì)和種用價(jià)值，是夏季規(guī)模化養(yǎng)殖業(yè)面臨的主要問題。α-硫辛酸(Alpha lipoic acid，ALA)作為B族維生素家族成員的一類親脂性化合物，具有獨(dú)特的抗炎、抗氧化等藥理活性。據(jù)報(bào)道，α-硫辛酸能夠顯著降低熱應(yīng)激飼養(yǎng)條件下肉雞的料肉比、改善屠體的肉品質(zhì)。但是α-硫辛酸能否有效緩解熱應(yīng)激引起的雄性動(dòng)物睪酮分泌失調(diào)，目前仍不清楚。本研究以雄性小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探究?硫辛酸對(duì)熱應(yīng)激誘發(fā)的睪酮分泌失調(diào)的影響以及可能的作用機(jī)理，以期為防控夏季雄性動(dòng)物熱應(yīng)激提供理論支持和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為熱應(yīng)激防治藥物的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

α-硫辛酸(飼料級(jí)，廣州盛瑄食品添加劑有限公司)；睪酮酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)快速試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)；免疫組化切片染色Ultra-SensitiveSP商品化試劑盒(福建福州邁新生物公司)；組織全蛋白快速提取與分離試劑盒;二辛可寧酸法(Bicinchonininc acid，BCA)蛋白濃度分析試劑盒(江蘇南京凱基生物技術(shù)公司)；IRE1、Caspase-3、β-actin一抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；羊抗兔和羊抗鼠二抗(上海碧云天生物技術(shù)公司)；蛋白免疫印跡化學(xué)發(fā)光超敏檢測(cè)試劑盒(美國伯樂公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)與處理

8周齡SPF級(jí)雄性昆明近交系性成熟小鼠60只，體重32～35 g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司安徽代理分公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(魯)2019003，飼養(yǎng)于安徽科技學(xué)院人工氣候控制室科研實(shí)驗(yàn)鼠房，在室溫(24±1) ℃下，每日08:00-20:00給予光照，自由飲水和采食，各組小鼠均飼喂商品化實(shí)驗(yàn)鼠糧。正常飼養(yǎng)3 d后，將小鼠隨機(jī)分為3組：正常飼養(yǎng)對(duì)照組(Con)、熱應(yīng)激飼養(yǎng)組(HS)、α-硫辛酸+熱應(yīng)激飼養(yǎng)組(ALA+HS)，每組20只。實(shí)驗(yàn)開始后，對(duì)照組的室溫維持在(24±1) ℃，熱應(yīng)激組和α-硫辛酸+熱應(yīng)激組從10:00-17:00維持室溫(35±1) ℃。α-硫辛酸的給藥方式以及劑量參照盧斌等的研究報(bào)道進(jìn)行,將α-硫辛酸采用生理鹽水溶解后，每天09:00對(duì)α-硫辛酸+熱應(yīng)激組小鼠按照60 mg/kg的劑量進(jìn)行α-硫辛酸灌胃給藥，對(duì)照組和熱應(yīng)激組分別給予等體積的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行14 d后處死小鼠，分別采集血液和睪丸，用于相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3 血清睪酮含量檢測(cè)

將采集的血液置于4 ℃冰箱靜置過夜后分離收集血清，采用睪酮酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒測(cè)定血清中的睪酮(Testosterone, T)含量，檢測(cè)方法和程序按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 石蠟切片免疫組化染色

睪丸組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、入水、微波抗原修復(fù)后，采用商品化的免疫組化染色試劑盒檢測(cè)IRE1蛋白在小鼠睪丸中的表達(dá)定位。滴加試劑盒A液(內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑)，室溫條件下孵育0.5 h之后用PBS清洗3次，進(jìn)行封閉操作，滴加試劑盒B液(封閉液)使之完全覆蓋載玻片上的組織，于37 ℃恒溫箱中放置1 h；滴加IRE1一抗孵育過夜。取出并用PBS清洗切片3次，進(jìn)行第二抗體結(jié)合與孵育，滴加試劑盒C液(生物素標(biāo)記的第二抗體)，于37 ℃電熱恒溫箱中靜置孵育1 h。二抗孵育處理結(jié)束后，滴加適量的試劑盒D液(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶)，于37 ℃電熱恒溫箱中孵育15 min，隨即進(jìn)行目的蛋白顯色、復(fù)染、脫水、封片和顯微觀察拍照。

1.5 蛋白免疫印跡Western blot 檢測(cè)

從液氮罐中取出已收集的各組睪丸組織樣品，加入適量體積的全蛋白提取試劑盒中已經(jīng)預(yù)冷處理的蛋白裂解液及PMSF，低溫條件下勻漿處理后，4 ℃低溫離心機(jī)12 000 r/min離心15 min后吸取上清液，然后采用BCA法對(duì)上清進(jìn)行蛋白濃度定量檢測(cè)，所獲蛋白上清液置于-80 ℃超低溫冰箱保存。Western blot 檢測(cè)時(shí)，取35 μg蛋白樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，65 V條件下將蛋白樣品采用濕轉(zhuǎn)的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)移作用1.5 h，待蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜上之后，取出薄膜放入封閉液中室溫封閉1 h。封閉結(jié)束后添加IRE1一抗4 ℃孵育過夜。次日經(jīng)洗膜操作后，于樣品薄膜上滴加堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的第二抗體，隨即在搖床上輕搖1.5 h進(jìn)行二抗孵育。二抗孵育結(jié)束后，再次洗膜，最終在每張膜上分別滴加200 μL蛋白免疫印跡化學(xué)發(fā)光液，分析測(cè)定各蛋白條帶的灰度值以進(jìn)行蛋白表達(dá)量的定量分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 硫辛酸對(duì)熱應(yīng)激小鼠血清睪酮含量水平的影響

由圖1可以看出，與對(duì)照組(Con)相比，熱應(yīng)激組(HS)小鼠血清睪酮含量水平顯著降低，差異極顯著(

P

<0.01)；與熱應(yīng)激組相比，α-硫辛酸+熱應(yīng)激處理組(ALA+HS)的血清睪酮含量顯著上升(

P

<0.05)，含量上升40.68%。

圖1 硫辛酸對(duì)熱應(yīng)激小鼠血清睪酮含量水平的影響

2.2 硫辛酸對(duì)非折疊蛋白反應(yīng)信號(hào)基因IRE1在小鼠睪丸中蛋白表達(dá)定位的影響

從圖2可得，在各組小鼠睪丸的生精小管和睪丸間質(zhì)中均可見IRE1蛋白的陽性免疫染色細(xì)胞；與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組睪丸組織中的IRE1蛋白陽性免疫染色細(xì)胞數(shù)量明顯增多(

P

<0.05)(圖3)；但與熱應(yīng)激組相比，α-硫辛酸+熱應(yīng)激處理組睪丸的生精小管和間質(zhì)中IRE1蛋白的陽性免疫染色細(xì)胞數(shù)量顯著減少(

P

<0.05)，詳見圖2。

圖2 硫辛酸對(duì)熱應(yīng)激小鼠睪丸中IRE1蛋白陽性細(xì)胞數(shù)的影響

圖3 IRE1在熱應(yīng)激小鼠睪丸中的表達(dá)定位

2.3 硫辛酸對(duì)非折疊蛋白反應(yīng)信號(hào)基因IRE1在熱應(yīng)激小鼠睪丸中蛋白表達(dá)量變化的影響

從圖4～5可以看出，與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組、α-硫辛酸+熱應(yīng)激處理組中睪丸組織內(nèi)的IRE1蛋白表達(dá)水平均顯著增加(

P<

0.01，

P<

0.05)；但與熱應(yīng)激組相比，α-硫辛酸+熱應(yīng)激處理組中睪丸內(nèi)IRE1蛋白表達(dá)量顯著降低(

P

<0.05)。

圖4 Western blot法檢測(cè)IRE1在熱應(yīng)激小鼠睪丸中的蛋白表達(dá)量變化

圖5 IRE1蛋白相對(duì)表達(dá)量分析

2.4 硫辛酸對(duì)凋亡調(diào)節(jié)基因Caspase-3在熱應(yīng)激小鼠睪丸中表達(dá)的影響

從圖6～7可以看出，與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激組、α-硫辛酸+熱應(yīng)激處理組中睪丸組織內(nèi)的Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著增加(

P<

0.01，

P

<0.05)；但與熱應(yīng)激組相比，α-硫辛酸+熱應(yīng)激處理組中睪丸內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著降低(

P

<0.05)。

圖6 Western blot法檢測(cè)Caspase-3在熱應(yīng)激小鼠睪丸中的蛋白表達(dá)量變化

圖7 Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量分析

3 結(jié)論與討論

隨著人工授精技術(shù)在現(xiàn)代畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的大規(guī)模推廣和應(yīng)用，公畜繁殖性能的高低直接影響著養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。但是，目前對(duì)于熱應(yīng)激造成公畜繁殖功能障礙的研究，大多數(shù)集中于熱應(yīng)激對(duì)精子生成的影響方面。而睪酮作為睪丸分泌的重要生殖激素，在促進(jìn)雄性動(dòng)物精子成熟以及維持第二性征等方面發(fā)揮了重要作用。因此，如何有效降低和預(yù)防熱應(yīng)激對(duì)公畜睪酮分泌的不利影響，進(jìn)而提升公畜的精液品質(zhì)，對(duì)提升夏季公畜的繁殖性能和養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以雄性昆明小鼠為研究模型，探索α-硫辛酸對(duì)高溫?zé)釕?yīng)激狀態(tài)下小鼠睪酮分泌水平的影響，以期為合理使用α-硫辛酸防控畜禽熱應(yīng)激提供理論依據(jù)。

對(duì)于雄性動(dòng)物，睪酮主要來源于睪丸間質(zhì)細(xì)胞，受下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)和諸多細(xì)胞因子的調(diào)控。睪酮對(duì)促進(jìn)生殖器官發(fā)育和精子發(fā)生，以及維持第二性征等具有重要意義。熱應(yīng)激誘導(dǎo)睪酮分泌水平降低后，往往出現(xiàn)精子發(fā)生與成熟異常，導(dǎo)致精液品質(zhì)嚴(yán)重下降，即使消除引起熱應(yīng)激的不利因素后，也需要10周左右的緩沖時(shí)間，精液品質(zhì)才能完全恢復(fù)正常。同時(shí)，睪酮在其他組織器官的正常生理活動(dòng)中也發(fā)揮了重要作用，如維持機(jī)體的骨量、參與維持神經(jīng)和心腦血管系統(tǒng)的正常生理功能，調(diào)節(jié)皮脂腺的皮脂分泌功能等。目前，隨著對(duì)熱應(yīng)激發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究的不斷深入，現(xiàn)有研究結(jié)果表明在熱應(yīng)激發(fā)生過程中維持睪丸睪酮的正常分泌水平，對(duì)防治雄性動(dòng)物熱應(yīng)激、降低和消除熱應(yīng)激對(duì)其繁殖生產(chǎn)性能的不利影響顯得尤為重要。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，熱應(yīng)激顯著降低了血清中睪酮的含量，表明熱應(yīng)激處理降低了睪丸分泌睪酮的能力，損害了睪丸分泌生殖激素的正常生理功能，這與前人的研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激能夠引起雄性動(dòng)物生殖激素分泌功能障礙的研究結(jié)果相一致。而本研究發(fā)現(xiàn)給予α-硫辛酸后血清中睪酮的含量顯著升高，表明α-硫辛酸能夠增強(qiáng)睪丸在熱應(yīng)激條件下分泌睪酮的能力，進(jìn)而緩解熱應(yīng)激對(duì)睪丸生殖生理功能造成的損害。

熱應(yīng)激發(fā)生時(shí)，機(jī)體內(nèi)熱休克蛋白的合成數(shù)量急劇上升。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為動(dòng)物體內(nèi)新生蛋白修飾、成熟的重要部位和場(chǎng)所，未折疊新生蛋白數(shù)量的急劇增加可破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的平衡狀態(tài)而使之發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后，一系列應(yīng)激相關(guān)的壓力應(yīng)激信號(hào)反應(yīng)與轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，誘發(fā)細(xì)胞和機(jī)體產(chǎn)生一系列適應(yīng)性反應(yīng)，即非折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded proteins response，UPR)，以期恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的平衡狀態(tài)，從而對(duì)細(xì)胞和機(jī)體起到保護(hù)作用?，F(xiàn)有研究表明，肌醇需求酶1(Inositol requiring enzyme 1，IRE1)作為UPR信號(hào)通路中關(guān)鍵的應(yīng)激感知與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，熱應(yīng)激發(fā)生時(shí)， IRE1參與了熱應(yīng)激信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控過程。本研究的免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，在各組小鼠睪丸的生精小管和睪丸間質(zhì)細(xì)胞中均觀察到了IRE1蛋白的陽性免疫染色，且熱應(yīng)激處理后IRE1蛋白的陽性免疫染色明顯加深，但與熱應(yīng)激組相比，在α-硫辛酸處理組睪丸中IRE1蛋白的免疫染色明顯變?nèi)酢Ｍ瑫r(shí)，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，IRE1蛋白在熱應(yīng)激組睪丸中的表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高，而α-硫辛酸處理組的IRE1蛋白表達(dá)量較熱應(yīng)激組明顯降低，表明熱應(yīng)激可能通過增強(qiáng)IRE介導(dǎo)的UPR信號(hào)進(jìn)而影響睪丸的睪酮分泌功能，而α-硫辛酸在熱應(yīng)激條件下呈現(xiàn)出增強(qiáng)睪丸睪酮分泌的作用，可能與其抑制了IRE介導(dǎo)的UPR信號(hào)激活有關(guān)。

現(xiàn)有研究表明，熱應(yīng)激對(duì)UPR信號(hào)通路的持續(xù)或過度激活能夠誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體凋亡途徑的激活進(jìn)而引起機(jī)體組織細(xì)胞的凋亡，最終對(duì)組織器官的生理功能造成損傷。Caspase-3作為線粒體細(xì)胞凋亡途徑中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個(gè)關(guān)鍵凋亡調(diào)控因子，在以細(xì)胞線粒體為中心的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中扮演了凋亡執(zhí)行者的重要角色，其表達(dá)量的增加是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，熱應(yīng)激顯著誘導(dǎo)了Caspase-3蛋白在睪丸內(nèi)的表達(dá)，表明熱應(yīng)激誘發(fā)了睪丸組織細(xì)胞的凋亡，凋亡的異常增加損害了睪丸正常的生理生殖功能，進(jìn)而影響了睪丸分泌睪酮的能力；而與熱應(yīng)激組相比，α-硫辛酸顯著抑制了睪丸內(nèi)Caspase-3的蛋白表達(dá)，表明α-硫辛酸能夠有效抑制熱應(yīng)激狀態(tài)下睪丸組織細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)睪丸睪酮的分泌能力，進(jìn)而緩解熱應(yīng)激對(duì)睪丸生理功能產(chǎn)生的不利影響。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，熱應(yīng)激能夠損害小鼠睪丸睪酮的正常分泌能力、降低其體內(nèi)血清睪酮的含量，給予60 mg/(kg·d)的α-硫辛酸治療對(duì)高溫?zé)釕?yīng)激引起的小鼠血清睪酮含量下降具有良好的治療作用，其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制可能與α-硫辛酸抑制了IRE1介導(dǎo)的非折疊蛋白反應(yīng)信號(hào)通路激活、降低凋亡促進(jìn)基因Caspase-3在睪丸中的蛋白表達(dá)量有關(guān)。