朱道謀，鐘麗花，陳彩華

(海南省婦女兒童醫(yī)學中心 1.急診科，2.新生兒科，海南 海口 570000)

新生兒敗血癥是新生兒期嚴重的感染性疾病，易導致多器官衰竭和死亡[1]。尤其是晚發(fā)型敗血癥(late-onset sepsis，LOS)患兒(出生72 h后發(fā)生，多見于極低體重新生兒)，病情進展迅速且腎損傷發(fā)生風險比早發(fā)型敗血癥更高。目前關于 LOS患兒早期急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)診斷的相關研究數(shù)據(jù)尚少，血清肌酐測定和利尿監(jiān)測對于新生兒腎功能下降的評估具有一定的局限性[2]。尋找準確、可靠、敏感、特異的新生兒AKI的生物標志物具有重要的臨床價值。其中血清和尿樣本中中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)[3]、胱抑素C(cystatin C，CysC)[4]、腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)[5]較其他指標受到更多的關注。但是尚沒有研究系統(tǒng)比較血液樣本和尿液樣本NGAL、CysC、KIM-1對LOS患兒AKI的早期預警價值。在本研究中，我們將回顧性分析120例LOS患兒血清和尿NGAL、KIM-1及CysC水平與早期AKI發(fā)生的關系，并進一步比較兩種樣本檢測對早期AKI預警的靈敏度、特異度的差異，從而為臨床檢驗提供循證醫(yī)學證據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2017年10月至2019年12月我院收治的120例LOS患兒的臨床資料，所有患兒都是日齡3～14 d(中位日齡8 d)入住新生兒重癥監(jiān)護室，在出生≥72 h后懷疑局部感染(肺炎、泌尿道感染)或出現(xiàn)臨床異常表現(xiàn)(主要是高熱、呼吸窘迫、高膽紅素血癥和發(fā)育停滯等)，被臨床診斷為敗血癥；其中53例患兒并發(fā)兩個或兩個以上器官或系統(tǒng)功能障礙，出現(xiàn)血壓下降和(或)外周血灌注減少的癥狀，被診斷為嚴重敗血癥/敗血性休克。入選標準為胎齡≥34周，出生3 d以上，具備新生兒敗血癥的體征和癥狀。所有患兒均按照醫(yī)療標準進行治療，血液和尿液樣本在-80 ℃保存用于進一步生化分析。排除尿道系統(tǒng)畸形、先天性疾病和確診為嚴重圍產期窒息的患兒以及確診AKI之前死亡的患兒。120例LOS患兒中男76例，女44例，中位胎齡37周(34～41周)，中位出生體重2 780 g(1 320～4 790 g)，中位Apgar 1 min評分6分(3～8 分)，中位 Apgar 5 min評分8分(5～10分)。新生兒重癥監(jiān)護室住院原因包括高膽紅素血癥、發(fā)育停滯、呼吸窘迫和疑似感染。用改良AKIN分期系統(tǒng)進行評估，將患兒分為分為AKI組(n=23)和非AKI組(n=97)。

1.2 AKI診斷標準

使用改良AKIN分期系統(tǒng)進行評估：以入院當天的血肌酐(serum creatinine，SCr)水平作為基礎值，入院48 h內SCr值較基礎值升高≥26.5 mol·L-1(≥0.3 mg·dl-1)；或者入院7 d內經推測或經明確后新生兒出現(xiàn)腎損害，SCr升高至≥1.5倍基礎數(shù)值；或持續(xù)6 h的尿量<0.5 ml·kg-1·h-1。另外根據(jù)AKI分級標準，將患兒AKI程度分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級。Ⅰ級：48 h內SCr值較基礎值升高≥26.5 mol·L-1(≥0.3 mg·dl-1)，或SCr升高至1.5～1.9倍基礎數(shù)值，尿量<0.5 ml·kg-1·h-1且持續(xù)6～12 h；Ⅱ級：SCr升高至2.0～2.9倍基礎數(shù)值，尿量<0.5 ml·kg-1·h-1且持續(xù)>12 h；Ⅲ級：SCr升高至≥3.0倍基礎數(shù)值，或Scr≥353.6 μmol·L-1，或無尿時間超過12 h。

1.3 檢測方法

(1) 所有新生兒在入院時進行一系列實驗室檢查，包括全血細胞計數(shù)、C反應蛋白(C reactive protein，CRP)、葡萄糖、電解質和血培養(yǎng)，以及必要的生化評估和動脈血氣分析；還進行了尿液分析和尿液培養(yǎng)。以上所有報告的數(shù)據(jù)均由我院檢驗科醫(yī)師審核后出具。(2)血清和尿NAGL、CysC、KIM-1水平檢測：血液和尿液樣本在入院后2 d內采集4次(0、12、24、48 h)，置于冰箱中直至離心。離心后將上清液在-80 ℃下保存。采用Maglumi2000電化學發(fā)光免疫分析儀和ELISA試劑盒檢測血清和尿中NGAL、CysC、KIM-1水平。NGAL試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司(板內、板間變異系數(shù)分別為3.6%和7.9%)；KIM-1試劑盒購于瑞士澳斯邦公司(板內、板間變異系數(shù)分別為4.4%和4.9%)；CysC試劑盒購于北京世紀沃德生物科技有限公司(板內、板間變異系數(shù)分別為4.2%和7.2%)；Maglumi2000電化學發(fā)光免疫分析儀購于深圳市新產業(yè)生物醫(yī)學工程股份有限公司。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 兩組患兒一般資料比較

AKI組和非AKI組患兒的性別、胎齡、日齡、出生體重、Apgar 1 min評分、Apgar 5 min評分、白細胞計數(shù)、CRP、血清肌酐(SCr)、估算腎小球濾過率(eGFR)等基礎資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；AKI組患兒發(fā)生嚴重敗血癥/敗血性休克的比例高于非AKI組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組LOS患兒一般資料的比較

2.2 兩組患兒入院2 d內血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平變化比較

采用重復測量設計的方差分析比較兩組患兒各時間點血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平:(1)不同時間點血清和尿NGAL(F時間=19.241、37.385，P<0.001)、KIM-1(F時間=8.135、11.469，P<0.05)、CysC(F時間=6.544、9.308，P<0.05)水平差異有統(tǒng)計學意義。(2) 兩組患兒血清和尿NGAL(F組別=25.736、78.915，P<0.001)、KIM-1(F組別=14.208、29.414，P<0.001)、CysC(F組別=8.717、13.218，P<0.05)水平比較差異有統(tǒng)計學意義，入院后2 d內AKI組患兒血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平均高于非AKI組(P<0.05)。(3) 兩組患兒血清和尿NGAL(F組別×時間=51.305、130.472，P<0.001)、KIM-1(F組別×時間=9.445、7.381，P<0.05)、CysC(F組別×時間=11.459、19.374，P<0.05)水平變化趨勢有統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 兩組患兒入院2 d內血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平變化

2.3 多因素Logistic回歸分析LOS患兒繼發(fā)AKI的危險因素

以發(fā)生AKI作為因變量，將性別，胎齡，日齡，出生時體重，Apgar 1 min評分，Apgar 5 min評分，白細胞計數(shù)，CRP，SCr，eGFR，入院時尿NGAL、KIM-1、CysC水平等存在統(tǒng)計學差異的變量納入回歸方程，經多因素Logistic回歸分析，尿NGAL、KIM-1及CysC水平升高是LOS患兒繼發(fā)AKI的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 LOS患兒繼發(fā)AKI的危險因素

2.4 不同AKI分級患兒入院時血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平差異

根據(jù)AKI分級標準，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級分別有12、7、4例患兒，Ⅲ級組患兒血清NGAL水平及尿NGAL、KIM-1水平高于Ⅰ級組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同AKI分級患兒入院時血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平差異

2.5 入院時血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平對AKI的預警效能

入院時血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平對LOS患兒AKI發(fā)生的預測價值分析見表5、圖1。尿NGAL的AUC大于血清NGAL，差異具有統(tǒng)計學意義(Z=-7.835，P<0.05)。而血清和尿KIM-1、CysC預測AKI的AUC比較，差異無統(tǒng)計學意義(Z=-2.315、-1.683，P>0.05)。血清和尿NGAL、KIM-1、CysC的AUC值均>0.7，提示血清和尿中這3個指標的預警效能良好。Spearman相關分析顯示，血清和尿NGAL、KIM-1水平與實際結果的rs值均>0.4，且P值均<0.05，尤其是尿NGAL水平與實際結果的相關性最高。血清和尿NGAL、KIM-1、CysC經H-L擬合優(yōu)度檢驗，P值均>0.05，提示各指標的預測效果與實際結果擬合度良好。

圖1 血清NGAL、KIM-1、CysC診斷LOS患兒早期AKI的ROC曲線

表5 入院時血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平對AKI的預警價值

3 討 論

3.1 LOS與患兒AKI的關系

新生兒敗血癥是新生兒時期一種嚴重的感染性疾病，因病原體侵入新生兒血液中并且生長、繁殖、產生毒素而造成的全身性炎癥反應[6]。新生兒敗血癥往往缺乏典型的臨床表現(xiàn)，但進展迅速，病情險惡，因此提高新生兒敗血癥的診斷水平具有重要的臨床價值。新生兒敗血癥分為早發(fā)型和晚發(fā)型。早發(fā)型多在出生后72 h內起病，感染多發(fā)生于出生前或出生時，病原菌以大腸桿菌等格蘭陰性桿菌為主，多系統(tǒng)受累、病死率高[7]。而晚發(fā)型在出生72 h后起病，感染發(fā)生在出生時或出生后，病原體以葡萄球菌、肺炎克雷伯菌為主，多出現(xiàn)臍炎、肺炎等局部感染病灶[8]。與成人相比，新生兒重癥監(jiān)護病房的新生兒患兒有著獨特的AKI危險因素，這可能與不成熟的腎臟生理、母體環(huán)境、圍產期事件及醫(yī)源性損傷等有關。早產腎有一個出生后腎小球發(fā)生的短窗口，早產和足月腎都有一個固有的低腎小球濾過率(GFR)，易發(fā)生AKI[9]。敗血癥能夠通過不同的病理生理途徑引起AKI，在早產兒中新生兒敗血癥引起的AKI發(fā)病率更高，約為75.6%[10]。

3.2 AKI臨床常用診斷指標的局限性

AKI是各種嚴重疾病中最常見的并發(fā)癥之一，早期診斷對于AKI的治療至關重要[11]。AKI以前被稱為急性腎功能衰竭，其定義是腎功能突然下降，伴有SCr水平的急性和可逆性升高，并且與尿量減少有關，易導致液體平衡、電解質和廢物清除率紊亂。因此目前關于AKI的診斷基本是依賴于SCr水平的升高或尿量的減少，這兩者都是腎損傷的標志性指標。但是由于新生兒腎小管功能尚未發(fā)育完全，通常會出現(xiàn)非少尿性AKI，因此Ueno等[12]建議采用改良AKIN定義，不將尿量作為新生兒的診斷標準。AKI的早期診斷對于治療是至關重要的，但是連續(xù)測量SCr水平對于評估腎功能的下降程度具有一定的滯后性。而且SCr是作為一種反映腎功能情況的標志分子，只是表示GFR降低后內源性標志物的積累情況，并不代表腎組織損傷程度[13]。此外，新生兒在分娩后前7 d SCr反映了母體肌酐成分的胎盤轉移，因此，新生兒SCr水平的升高通常在出生后前7 d持續(xù)存在，并且會隨著時間的推移而下降。目前大量的研究致力于制定一個更加標準化和準確的AKI定義，以提高新生兒AKI的早期診斷率。

3.3 NGAL、KIM-1、CysC與AKI發(fā)生的關系

本研究結果顯示，早期LOS患兒入院時血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平升高對于繼發(fā)性AKI的發(fā)生具有一定的預警效能。AKI組患兒入院48 h內血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平普遍升高，并且升高趨勢相較于非AKI組更明顯；多因素Logistic回歸分析顯示，入院時血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平升高是LOS患兒繼發(fā)性AKI發(fā)生的獨立危險因素，且隨著AKI嚴重程度增加，Ⅲ級組患兒血清NGAL水平和尿NGAL、KIM-1水平高于Ⅰ級組。新生兒敗血癥被認為是通過多種不同的病理生理途徑導致AKI。首先，全身炎癥反應導致低血壓、腎低灌注和繼發(fā)性急性腎小管壞死。其次，微血管功能障礙被認為是在腎血流量正?；蛟黾拥那闆r下發(fā)生的，表現(xiàn)為GFR降低和腎小管功能不全，這在組織學上與急性腎小管壞死不同。此外，腎盂腎炎通常伴有潛在的腎道異常和先天性感染，可導致AKI。在早產兒中，由于新生兒敗血癥引起的AKI的發(fā)生率遠遠高于足月新生兒。眾多研究證實，與腎損傷有關的分子如NGAL、KIM-1、CysC可用于預測新生兒敗血癥繼發(fā)性AKI，但是其可靠性尚存有爭議。El-Farghali等[14]研究發(fā)現(xiàn)，非敗血癥(n=35)和敗血癥(n=25)危重患兒sNGAL水平差異無統(tǒng)計學意義，但與無AKI組相比，AKI患兒sNGAL水平顯著升高，表明NGAL是AKI的標志物，其水平升高并非敗血癥所致。此外，很多學者認為一些AKI的新型標志物如NGAL、KIM-1、CysC等，在直接反映腎臟損傷方面優(yōu)于SCr。Shang等[15]研究表明，NGAL與腎損傷密切相關，腎損傷患者尿和血清NGAL的表達顯著增加。KIM-1是一種黏附分子，也是一種跨膜蛋白，由334個氨基酸殘基組成，一般由受損的近曲小管上皮細胞所表達。在正常的腎組織中，KIM-1幾乎是不表達的，但是當腎臟組織缺血或腎毒性損傷后，KIM-1在損傷后的近端小管中水平明顯上調。KIM-1可介導吞噬凋亡細胞并抑制免疫損傷和炎癥反應等，進而作為一種保護性細胞因子參與腎損傷修復過程[16]。因此，在腎小管早期損傷的時候，KIM-1的敏感性、特異性均較高。CysC是包含120個氨基酸的小分子堿性蛋白，其氨基酸序列在體內表達相對穩(wěn)定，一般情況下其在血液中的濃度變動很小。腎小管不主動分泌CysC，但CysC可自由透過腎小球濾過膜，并且在近曲小管處被分解和重吸收，因此CysC水平變化也可反映腎小球濾過功能的損害[17]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)AKI組LOS患兒血清和尿NGAL、KIM-1及CysC的水平均顯著升高，并且在入院48 h內持續(xù)升高。

3.4 血清和尿NGAL、CysC、NGAL水平對AKI的預警價值

本研究結果顯示，血清和尿NGAL、CysC、NGAL對于LOS患兒繼發(fā)性AKI都有一定的預警價值，且血清和尿NGAL、KIM-1、CysC的H-L擬合優(yōu)度檢驗顯示，均P>0.05，提示各指標的預測效果與實際結果擬合度良好。但是尿NGAL的預警效能大于血清NGAL，而且與實際結果的相關性更高；而血清和尿KIM-1或CysC對AKI的預警效能基本一致。NGAL被稱為lipocalin2，最初被描述為一種由多種人類細胞表達的癌基因，包括上皮細胞和中性粒細胞，可通過腎臟被迅速排出，半衰期為10～20 min[18]。因此相較于血清NGAL，尿NGAL水平升高更能夠反映腎小管內皮細胞的損傷情況，但是并不能反映GFR的下降。此外NGAL也是中性粒細胞活化的重要標志物，血清NGAL水平升高易受到其他炎癥感染因素的影響，因此若要進一步證實尿NGAL相較于血清NGAL對LOS患兒繼發(fā)AKI的預警效能更高，則需要從NGAL的起源和作用機制、代謝特點等方面進行更深入的分析。

綜上所述，LOS繼發(fā)性AKI患兒表現(xiàn)為早期血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平普遍升高，相較于血清NGAL，檢測尿NGAL水平對于AKI的預警效能更高，而對于KIM-1和CysC指標，我們并未發(fā)現(xiàn)血清和尿預警效能的差異性。