龐春艷，常志芳，王馨，白力，王永福,

(1.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科,內(nèi)蒙古 包頭 014010;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)自體免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 包頭 014010)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性炎癥為主的自身免疫性疾病，肽基精氨酸脫亞胺酶4(peptidyl arginine deiminase 4，PAD4)能將體內(nèi)蛋白質(zhì)中的精氨酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)楣习彼釟埢习彼峄赗A的發(fā)病中起著重要作用，瓜氨酸化可打破機(jī)體的免疫耐受、激活自身免疫反應(yīng)。因此，PAD4是亞洲人群RA的易感基因，在RA患者的滑膜中表達(dá)增高，它能促使RA發(fā)病以及加速病程進(jìn)展[1]。本研究主要分析RA患者PAD4蛋白和mRNA的表達(dá)水平以及RA患者PAD4蛋白的表達(dá)水平與類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)、抗環(huán)瓜氨酸肽(cyclic citrunilated peptides，CCP)抗體和28個(gè)關(guān)節(jié)的疾病活動(dòng)度評(píng)分(the disease activity score using 28 joint counts，DAS28)的相關(guān)性，探討PAD4對(duì)RA的診斷和治療價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)BIOMATIK公司和德國(guó)的歐蒙公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RvertAid First Strand cDNA Synthesis)和PowerUpTM?SYBR Green Master Mix購(gòu)自美國(guó)Thermol Fisher公司。

1.2 血清中PAD4、RF-IgM和抗CCP抗體的檢測(cè)

收集90例RA患者和76例健康對(duì)照者的血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩A患者的年齡為(56.68±12.45)歲，其中男性占24%；健康對(duì)照者的年齡為(54.38±9.91)歲，其中男性占16%。兩組在年齡和性別方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。特種蛋白儀檢測(cè)RA患者血清中RF-IgM的表達(dá)水平。ELISA法檢測(cè)血清中PAD4、RF-IgA、RF-IgG和抗CCP抗體的表達(dá)水平。PAD4的檢測(cè)按BIOMATIK公司的ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，方法如下：加100 μl標(biāo)準(zhǔn)品或血清，37 ℃孵育1 h；吸出液體，加100 μl檢測(cè)試劑A，37 ℃孵育1 h；吸出液體，洗滌3次；加100 μl檢測(cè)試劑B，37 ℃孵育30 min；吸出液體，洗滌5次；加90 μl底物，37 ℃孵育15 min；加50 μl終止液，450 nm讀取吸光度值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度。RF-IgA、RF-IgG和抗CCP抗體按歐蒙公司的ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，方法如下：加100 μl標(biāo)準(zhǔn)品或100倍稀釋后的血清，室溫孵育1 h；吸出液體，洗滌3次；加100 μl酶結(jié)合物，室溫孵育30 min；吸出液體，洗滌3次；加100 μl底物，室溫孵育30 min；加100 μl終止液，450 nm讀取吸光度值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度。

1.3 PAD4抑制劑F-amidine干預(yù)后外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)增殖情況檢測(cè)

收集RA患者的EDTA抗凝全血，淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC，RPMI 1640培養(yǎng)基加10%的胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)。PBMC以5×104個(gè)·ml-1的濃度種植于96孔板，實(shí)驗(yàn)分為空白組、陰性對(duì)照組、7.5 μmol·L-1F-amidine治療組、15 μmol·L-1F-amidine治療組、30 μmol·L-1F-amidine治療組和60 μmol·L-1F-amidine治療組，空白組不做任何處理，陰性對(duì)照組加同等體積的二甲基亞砜，分別作用24、48和72 h。CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.4 F-amidine干預(yù)后PBMC凋亡情況檢測(cè)

收集RA患者的EDTA抗凝全血，淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC，以5×105個(gè)·ml-1濃度種植于6孔板。根據(jù)上述細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)確定最佳作用濃度和最佳作用時(shí)間。實(shí)驗(yàn)分為空白組、陰性對(duì)照組和F-amidine治療組?？瞻捉M細(xì)胞不做任何處理，F(xiàn)-amidine治療組加入最佳濃度的F-amidine，陰性對(duì)照組細(xì)胞加入等體積的二甲基亞砜，在最佳作用時(shí)間下，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBMC凋亡的情況。

1.5 RT-PCR檢測(cè)PBMC中PAD4 mRNA的表達(dá)水平

收集39例RA患者和22例健康對(duì)照者的EDTA抗凝全血，采用淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC，Trizol法提取PBMC中總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PAD4 mRNA的表達(dá)水平。PAD4的上游引物5′-ATGAAAGCCAAGTGCAAG-3′，下游引物5′-CGTTTTGTGTGGGGCTTG-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為108 bp。內(nèi)參GAPDH的上游引物5′-CTCCAGAACATCATCCCTGCCTC-3′，下游引物5′-ACGCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度190 bp。PCR體系:cDNA 1 μl,PCR反應(yīng)混合液 10 μl,上游引物1 μl,下游引物1 μl，總體積20 μl。PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 RA患者和健康對(duì)照者血清中PAD4的表達(dá)水平

RA患者血清中PAD4的濃度為(5.94±0.37) ng·ml-1，健康對(duì)照者血清中PAD4的濃度為(2.30±0.18)ng·ml-1，RA患者的PAD4濃度顯著高于健康對(duì)照者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.402，P<0.000 1)。PAD4蛋白診斷RA的曲線下面積為0.875，以5.07 ng·ml-1為cut-off值，其特異度為98.7%，敏感度為66.7%，見圖1。

圖1 PAD4診斷RA的ROC曲線

2.2 RA患者PAD4的濃度與RF-IgM、抗CCP抗體及DAS28評(píng)分的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，PAD4與RF-IgM呈正相關(guān)(r=0.22，P=0.039)，見圖2?？笴CP抗體陽(yáng)性組患者PAD4的表達(dá)水平與抗CCP抗體呈正相關(guān)(r=0.258，P=0.033，圖3)，但抗CCP抗體陰性組患者19例中14例有高水平的PAD4表達(dá)。PAD4蛋白的水平與RF-IgA、RF-IgG及DAS28無(wú)相關(guān)性。

圖2 PAD4與RF-IgM的相關(guān)性

圖3 PAD4與抗CCP抗體的相關(guān)性

2.3 F-amidine對(duì)RA患者PBMC增殖的影響

15 μmol·L-1F-amidine作用PBMC 48 h時(shí)，細(xì)胞抑制率為50%左右，見圖4。接下來(lái)又檢測(cè)了15 μmol·L-1F-amidine對(duì)8例RA患者PBMC作用48 h時(shí)細(xì)胞增殖情況，驗(yàn)證了F-amidine的最佳作用濃度是15 μmol·L-1，大部分患者細(xì)胞的抑制率在50%左右，見圖5。

圖4 不同濃度F-amidine對(duì)PBMC增殖情況的影響

圖5 15 μmol·L-1 F-amidine作用48 h PBMC增殖情況

2.4 F-amidine對(duì)RA患者PBMC凋亡的影響

在RA患者的PBMC中加入15 μmol·L-1的F-amidine，作用48 h后收集細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)F-amidine可以增加PBMC晚期凋亡細(xì)胞比例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但對(duì)早期凋亡細(xì)胞的作用不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1和圖6。

表1 F-amidine對(duì)RA患者PBMC凋亡的影響 %

圖6 F-amidine對(duì)RA患者PBMC凋亡的影響

2.5 RA患者和健康對(duì)照者全血中PAD4 mRNA的表達(dá)水平及其與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、DAS28評(píng)分的相關(guān)性

RA患者全血中PAD4 mRNA的表達(dá)量為7.23±9.57，明顯高于健康對(duì)照者的1.00±0.00，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.069，P<0.001)。Pearson相關(guān)分析顯示，PAD4 mRNA與抗CCP抗體呈正相關(guān)(r=0.390，P=0.023，圖7)，與RF及DAS28無(wú)相關(guān)性。

圖7 PAD4 mRNA與抗CCP抗體的相關(guān)性

3 討 論

RA是一種常見的自身免疫性疾病，主要以慢性滑膜炎癥為病理改變。RA患者血清中會(huì)出現(xiàn)RF和抗CCP抗體。李雪飛等[2]研究顯示,聯(lián)合RF和抗CCP抗體檢測(cè)可以提高RA患者的診斷準(zhǔn)確性，但其中仍有1/3的RA患者血清反應(yīng)是陰性的[3]。有學(xué)者采用噬菌體展示文庫(kù)技術(shù)篩選出新興的自身抗體，可作為抗CCP抗體和RF血清學(xué)陰性的RA患者的血清學(xué)候選指標(biāo)。PAD4就是其中一種新型的血清學(xué)指標(biāo)[4]。

Umeda等[5]研究發(fā)現(xiàn),RA患者PAD4的表達(dá)水平明顯高于系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和健康對(duì)照者，而且29.7%的RA患者血清中可檢測(cè)到抗PAD4 抗體，且抗PAD4 抗體與抗CCP抗體密切相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn),RA患者中PAD4蛋白的表達(dá)水平較健康對(duì)照者明顯升高，而且RA患者血清中PAD4蛋白的表達(dá)水平與RF呈正相關(guān)。關(guān)于PAD4或PAD4抗體與抗CCP抗體及DAS28的相關(guān)性研究，國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果不盡相同[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，在抗CCP抗陽(yáng)性組中PAD4蛋白的表達(dá)水平與抗CCP抗體呈正相關(guān)，在抗CCP抗體陰性組中也有73.7%RA患者血清中PAD4的表達(dá)水平高于cut-off值。劉秀明等[8]研究發(fā)現(xiàn)，25%的抗CCP抗體陰性患者的抗PAD4抗體為陽(yáng)性，提示抗CCP抗體陰性的RA患者中可以檢測(cè)到PAD4及其抗體的表達(dá)，具體的機(jī)制還有待深入研究。本研究發(fā)現(xiàn)PAD4 與DAS28無(wú)相關(guān)性，可能與RA患者的疾病活動(dòng)度大多為低中疾病活動(dòng)度有關(guān)。RA患者中可以檢測(cè)到更高水平的PAD4的表達(dá)，提示它可以用作RA患者的輔助診斷。

Verheul等[9]對(duì)日本、荷蘭和意大利等國(guó)家的12項(xiàng)研究進(jìn)行Meta分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗CCP抗體和RF單獨(dú)或者聯(lián)合診斷RA的敏感度為59%～88%，特異度為65%～100%。國(guó)內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn),血清RF診斷RA的ROC曲線下面積為0.742，血清抗CCP抗體診斷RA的ROC曲線下面積為0.813[10]。唐笛嬌等[11]研究發(fā)現(xiàn),抗CCP抗體診斷RA的敏感度為66.92%，特異度為76.09%，RF-IgM診斷RA的敏感度為66.15%，特異度為82.95。Vos等[12]采用第2代和第3代的抗CCP抗體診斷RA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第2代的抗CCP抗體診斷RA的曲線下面積為0.792，以10.5 U·ml-1為cut-off值，敏感度為80.0%，特異度為75.0%；第3代的抗CCP抗體診斷RA的AUC為0.773，以5.6 U·ml-1為cut-off值，敏感度為86.9%，特異度為61.0%?？梢姷?代和第3代的抗CCP抗體診斷RA的敏感度提高了，特異度變化不大。本研究發(fā)現(xiàn)，PAD4診斷RA的AUC為0.875，以5.07 ng·ml-1為cut-off值，敏感度為66.7%，其特異度為98.7%。提示PAD4診斷RA的價(jià)值可以與RF和第1代的抗CCP抗體相媲美，但與第2代和第3代抗CCP抗體相比，特異度提高了，敏感度沒有明顯變化。

郭靖等[13]研究發(fā)現(xiàn),RA患者PBMC中PAD4 mRNA表達(dá)水平高于健康對(duì)照者。本研究也發(fā)現(xiàn)RA患者PBMC中PAD4 mRNA表達(dá)水平高于健康對(duì)照者，提示PAD4確實(shí)參與了RA的發(fā)生和發(fā)展[13]。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),PAD4 mRNA與抗CCP抗體呈正相關(guān)，這個(gè)結(jié)果與PAD4蛋白與抗CCP抗體的相關(guān)性結(jié)果不完全一致，可能與抗CCP抗體陰性的病例數(shù)不完全一致有關(guān)，在PAD4蛋白檢測(cè)中有21.3%的患者呈抗CCP抗體陰性，而在PAD4 mRNA檢測(cè)時(shí)只有11.7%呈陰性。進(jìn)一步的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，PAD4 mRNA與RF及DAS28無(wú)相關(guān)性，可能與高疾病活動(dòng)度的病例數(shù)少有關(guān)，也可能是檢測(cè)PAD4 mRNA的病例數(shù)少引起的。

F-amidine是PAD4常見的抑制劑。本研究結(jié)果顯示，15 μmol·L-1的F-amidine可以增加RA患者PBMC晚期凋亡細(xì)胞比例，但對(duì)早期凋亡細(xì)胞的作用不明顯，提示F-amidine可能對(duì)RA有一定的治療作用。接下來(lái)本課題組將從動(dòng)物水平檢測(cè)F-amidine對(duì)RA動(dòng)物模型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)的治療作用。