田振華, 何靜瑄, 王 穎

(陜西科技大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院 輕化工程國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心， 陜西 西安 710021)

0 引言

膠原是一種廣泛分布于生物體內(nèi),具有特殊功能的蛋白質(zhì).因具有優(yōu)異的生物學(xué)性能,膠原被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域[1].在生理?xiàng)l件下,膠原分子能夠自組裝形成膠原纖維并包裹水溶液形成膠原水凝膠,進(jìn)而構(gòu)成宏觀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu).與膠原分子相比,膠原纖維降解速率更慢,引起的炎癥反應(yīng)更輕,更易于與細(xì)胞結(jié)合,可作為一種重要的組織工程支架材料.因此,基于膠原自組裝設(shè)計(jì)和合成形成具有纖維結(jié)構(gòu)的生物功能材料已成為研究熱題[2].

然而，自組裝形成的膠原水凝膠力學(xué)性能和熱穩(wěn)定性較差,在生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域的應(yīng)用受到了一定限制[3].為提升膠原水凝膠的性能,人們通常對(duì)膠原水凝膠進(jìn)行化學(xué)改性[4,5].羧甲基纖維素(CMC)是天然纖維經(jīng)過化學(xué)改性后獲得的一種水溶性好的聚陰離子化合物.它廉價(jià)易得,具有保水性、成膜成型性、分散穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)[6].CMC經(jīng)氧化后所得到的氧化羧甲基纖維素(OCMC)具有高活性的醛基,可與膠原的氨基發(fā)生有效的共價(jià)結(jié)合[7](如圖1所示).

Tan等[8]用雙醛羧甲基纖維素作為交聯(lián)劑通過凍融法制備海綿狀膠原凍凝膠,改性后凝膠表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性,表明OCMC可作為良好的交聯(lián)劑.然而,先前的研究多關(guān)注OCMC交聯(lián)膠原分子,對(duì)于OCMC對(duì)膠原纖維所構(gòu)建的膠原水凝膠性能的影響探究較少,因此本課題提出先借助自組裝機(jī)理制備膠原水凝膠,再用OCMC進(jìn)行化學(xué)改性,期望提高膠原水凝膠的性能.

(a)OCMC制備原理示意圖

(b)OCMC與膠原的反應(yīng)示意圖圖1 OCMC制備及其與膠原的反應(yīng)示意圖

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑和儀器

1.1.1 主要試劑

膠原海綿、氧化羧甲基纖維素鈉,實(shí)驗(yàn)室自制;氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉,AR,廣東光華科技股份有限公司;茚三酮,AR,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.1.2 主要儀器

TU-1900紫外可見分光光度儀,北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司;Vertex70傅里葉變換紅外光譜儀,德國布魯克公司;Agilent 5100原子力顯微鏡,美國Agilent公司;DSC 200P3差示掃描量熱儀,德國Netzsch公司;DHR-1流變儀,美國TA公司.

1.2 膠原水凝膠的制備

將凍干的膠原海綿于冰水浴下用磷酸鹽緩沖液(PBS,10 mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4,100 mmol/L NaCl,pH～7.4)進(jìn)行溶解,得到5 mg/mL的膠原溶液.于37 ℃下培養(yǎng)3 h制備膠原水凝膠,隨后將水凝膠浸泡于含有不同量OCMC的PBS緩沖溶液中,室溫下反應(yīng)24 h,最終得到OCMC與膠原的質(zhì)量比(OCMC∶Col(w/w))分別為0∶1、0.3∶1、1∶1、2.5∶1、5∶1和10∶1的改性膠原水凝膠,依次命名為Col(0)、Col(0.3)、Col(1)、Col(2.5)、Col(5)、Col(10).

1.3 膠原水凝膠的性能檢測

1.3.1 交聯(lián)度檢測

采用茚三酮法測定改性前后膠原水凝膠中自由氨基數(shù)量以計(jì)算交聯(lián)度[9].將1 g膠原水凝膠、2 mL PBS緩沖溶液以及1 mL茚三酮溶液(5 mg/mL)于試管中均勻混合.沸水中避光反應(yīng)15 min,將產(chǎn)生的藍(lán)紫色溶液立即冷卻.用紫外分光光度計(jì)測定顯色溶液在570 nm處的吸光度,參比為去離子水.所有樣品均測試三次取平均值.改性水凝膠的交聯(lián)度(Crosslinking Degree)可以通過公式(1)計(jì)算:

(1)

式(1)中:An—純膠原水凝膠吸光度;Ac—改性膠原水凝膠吸光度.

1.3.2 紅外光譜

將膠原水凝膠樣品置于硅膠板上、于室溫(25 ℃、RH 65%±5%)下風(fēng)干成膜,用去離子水多次洗滌去除鹽,再次風(fēng)干[10].采用傅里葉變換紅外光譜儀檢測,分辨率為2 cm-1,波數(shù)范圍4 000～400 cm-1.

1.3.3 原子力顯微鏡

將膠原水凝膠剪成小條,粘貼在新剝離的云母片上;將OCMC配制濃度為25μg/mL的待測液,取5μL待測液滴在新剝離的云母片上.樣品于室溫條件下干燥24 h后以1 Hz的掃描速率在輕敲模式下進(jìn)行測試.每個(gè)樣品至少觀察3個(gè)不同的位置以確定所得到的形貌的一致性.

1.3.4 熱穩(wěn)定性檢測

準(zhǔn)確稱取膠原水凝膠(～10 mg)密封于鋁坩堝中,以PBS緩沖溶液作參比.在溫度范圍30℃ ～ 85 ℃,升溫速率5 ℃/min,吹掃氣20 mL/min條件下得到DSC曲線,曲線峰值即對(duì)應(yīng)樣品的熱變性溫度(Td).

1.3.5 動(dòng)態(tài)頻率掃描測試

將樣品分別置于平板直徑為40 mm,板間距為2.5 mm的流變儀中,選取2%的恒定應(yīng)變[11],于30 ℃下進(jìn)行動(dòng)態(tài)頻率掃描,頻率范圍為0.01～10 Hz,記錄樣品的儲(chǔ)能模量、損耗模量以及損耗因子隨頻率變化的曲線圖.

1.3.6 蠕變測試

將樣品分別置于平板直徑為40 mm,板間距為2.5 mm的流變儀中,溫度設(shè)為30 ℃,施加8 Pa的恒定應(yīng)力并持續(xù)100 s,記錄樣品的形變率.

2 結(jié)果與討論

2.1 交聯(lián)度

圖2為不同量OCMC改性膠原水凝膠的的交聯(lián)度曲線.隨著OCMC用量的增加,膠原水凝膠的交聯(lián)度呈上升的趨勢(shì).Col(0)、Col(0.3)、Col(1)、Col(2.5)、Col(5)、Col(10)的交聯(lián)度分別為0、16.7%、21.3%、26.8%、43.9%和60.6%.

圖2 不同用量OCMC交聯(lián)膠原水凝膠的交聯(lián)度

當(dāng)OCMC∶Col(w/w)≤0.3∶1時(shí)交聯(lián)度上升較快,說明膠原纖維中與OCMC醛基進(jìn)行交聯(lián)的活性氨基較多.當(dāng)OCMC∶Col(w/w)>0.3∶1后,交聯(lián)度變化緩和,說明參與反應(yīng)的活性氨基數(shù)量在逐漸減少.理論上,當(dāng)OCMC分子的醛基與膠原纖維的活性氨基數(shù)量比值為1∶1時(shí),膠原內(nèi)的自由氨基基本完全反應(yīng),交聯(lián)度達(dá)到100%[12].然而Col(10)的交聯(lián)度僅為60.6%.推測原因是賴氨酸以及羥賴氨酸側(cè)鏈上的一些活性氨基被包裹在纖維內(nèi)部,而大分子OCMC由于空間位阻難以進(jìn)入纖維內(nèi)部與氨基反應(yīng).

2.2 紅外光譜

圖3為純膠原水凝膠及改性膠原水凝膠的紅外光譜及其局部放大圖.從圖中觀察到，酰胺A帶、B帶出現(xiàn)在約3 327 cm-1處和3 082 cm-1處,歸屬于N-H的伸縮振動(dòng)與氫鍵的耦合及C-H的伸縮振動(dòng);酰胺I帶出現(xiàn)在1 663 cm-1處,歸屬于C=O基團(tuán)的拉伸振動(dòng);酰胺II帶出現(xiàn)在1 555 cm-1處,歸屬于酰胺基中N-H彎曲振動(dòng)和C-N伸縮振動(dòng)的耦合;酰胺III帶出現(xiàn)在1 240 cm-1左右,歸屬于C-O的伸縮振動(dòng);1 450 cm-1歸屬于CH3不對(duì)稱彎曲振動(dòng).理論上OCMC分子中的醛基與膠原中的自由氨基發(fā)生交聯(lián)生成C=N基團(tuán),但在紅外光譜上并未觀察到C=N基團(tuán)的吸收峰,主要的原因是其吸收峰位于1 650 cm-1附近,被強(qiáng)度較高的酰胺I帶(1 663 cm-1)所掩蓋[13].此外,分別出現(xiàn)在1 660 cm-1、1 555 cm-1附近的酰胺基中的C=O伸縮振動(dòng)、N-H彎曲振動(dòng)和C-N伸縮振動(dòng)吸收峰來自螺旋結(jié)構(gòu)[14],在一定程度上可說明膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)存在與否.而且,膠原的酰胺A帶、B帶以及III帶也與其三股螺旋結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[15].改性后膠原的這五個(gè)特征吸收峰均未發(fā)生明顯移動(dòng),表明膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)象仍然保留[16,17].

(a)全波段紅外光譜圖(4 000～400 cm-1)

(b)紅外光譜局部放大圖(1 780～930 cm-1)圖3 不同用量OCMC交聯(lián)膠原水凝膠的紅外光譜

為了進(jìn)一步證實(shí)膠原的三股螺旋是否保持完整,通過以下兩種方法來判斷:

(1)AⅢ/A1450表示酰胺III帶與1 450 cm-1處特征峰的吸光度比值,若比值接近于1.00,表明膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)完整;反之,若比值遠(yuǎn)小于1.0則說明膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)被破壞.例如明膠,雖與膠原的氨基酸組成一樣,但不具有三股螺旋結(jié)構(gòu),其比值為0.59[18].

(2)Δv=v1-v2表示酰胺I與酰胺II之間波數(shù)的差值,若差值接近100 cm-1則判斷膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)具有完整性[19].

表1為不同用量OCMC交聯(lián)膠原的AⅢ/A1450與Δv值.兩者均可以說明改性膠原仍具有完整的三股螺旋.

表1 不同用量OCMC交聯(lián)膠原AⅢ/A1450、Δv值

2.3 微觀形貌

圖4為OCMC及不同用量OCMC交聯(lián)膠原水凝膠的AFM圖.純膠原水凝膠表面以自組裝形成的纖維結(jié)構(gòu)為主[12],排列雜亂且多以單根纖維的形式存在.而改性膠原水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)雖同樣具有典型纖維結(jié)構(gòu),在纖維的分布排列上卻有明顯差異.

(a)Col(0) (b)Col(0.3)

(c)Col(1) (d)Col(2.5)

(e)Col(5) (f) Col(10)

(g)OCMC圖4 不同用量OCMC交聯(lián)膠原水凝膠的AFM圖(尺寸:2 μm × 2 μm)

Col(0.3)和Col(1)中膠原纖維開始兩兩結(jié)合形成“纖維單元(FU)”[12],表明交聯(lián)反應(yīng)首先發(fā)生在相鄰膠原纖維之間.Col(2.5)中OCMC濃度的提高使得交聯(lián)作用更加明顯,FU間開始發(fā)生交聯(lián),多個(gè)FU聚集成團(tuán)(A),且排列具有一定的方向性.Col(5)中相距較遠(yuǎn)的膠原纖維在不同方向上發(fā)生相互交聯(lián),出現(xiàn)聚集現(xiàn)象.這是由于膠原纖維之間的OCMC分子變多,彼此之間發(fā)生自聚,導(dǎo)致分子鏈變長,相距較遠(yuǎn)的膠原纖維得以在不同方向上發(fā)生交聯(lián).Col(10)中膠原纖維之間的排列已經(jīng)非常緊密并趨于穩(wěn)定.綜上所述,OCMC的引入使得改性膠原水凝膠結(jié)構(gòu)更加規(guī)整緊密.而OCMC本身粘連較為嚴(yán)重,基本觀察不到纖維形態(tài).證明改性膠原水凝膠的規(guī)整結(jié)構(gòu)是由于交聯(lián)作用而不是OCMC自身的形貌.

2.4 熱穩(wěn)定性

圖5為不同用量OCMC交聯(lián)膠原水凝膠的熱變性溫度曲線.圖中Col(0)的Td值為47.0 ℃,改性水凝膠的最高Td值達(dá)到61.7 ℃,相較于Col(0)提高了14.7 ℃.

圖5 不同用量OCMC交聯(lián)膠原水凝膠的熱變性溫度曲線

當(dāng)OCMC∶Col(w/w)≤0.3∶1時(shí),膠原纖維開始相互交聯(lián)并定向排列,改性膠原水凝膠熱變性溫度從47.0 ℃提升至52.1 ℃,提升幅度較大.當(dāng)0.3∶15∶1時(shí),雖然交聯(lián)劑濃度翻倍增加,但熱變性溫度的變化并不明顯.這是因?yàn)槟z原纖維的聚集程度已經(jīng)基本趨于穩(wěn)定,熱變性溫度僅提升了2.6 ℃.

與純膠原水凝膠相比,改性膠原水凝膠的熱穩(wěn)定性有所提高,完全破壞其三股螺旋結(jié)構(gòu)需要的熱量隨之提高,大大擴(kuò)寬了膠原水凝膠的應(yīng)用范圍[20].

2.5 動(dòng)態(tài)頻率掃描

圖6為不同用量OCMC交聯(lián)膠原水凝膠的儲(chǔ)能模量G′、損耗模量G″及損耗因子tanδ值隨頻率變化的曲線.儲(chǔ)能模量G′是膠原水凝膠發(fā)生彈性形變時(shí)儲(chǔ)存的能量,它反應(yīng)膠原水凝膠的彈性行為,與膠原水凝膠的交聯(lián)程度有關(guān).而損耗模量G″則是作為評(píng)價(jià)膠原水凝膠粘性特征的一個(gè)指標(biāo)[21].從儲(chǔ)能模量曲線來看,隨著交聯(lián)劑濃度的增加,膠原水凝膠的儲(chǔ)能模量呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì),曲線的斜率卻在減小,說明在同頻率變化范圍內(nèi),改性膠原水凝膠比純膠原水凝膠對(duì)頻率變化的敏感程度要弱,且彈性特征越來越明顯,抵抗外力的能力增強(qiáng).

(a)儲(chǔ)能模量G′

(b)損耗模量G″

(c)損耗因子tanδ圖6 不同用量OCMC交聯(lián)膠原水凝膠的動(dòng)態(tài)掃描曲線

表2為1 Hz下不同用量OCMC交聯(lián)膠原水凝膠的G′、G″和tanδ值.Col(0.3)的儲(chǔ)能模量相較Col(0)提升了10.8 Pa,變化幅度較大,說明相鄰膠原纖維間的交聯(lián)大大增加了膠原水凝膠的儲(chǔ)能模量.Col(1)的儲(chǔ)能模量相較Col(0.3)僅提升2.6 Pa,變化幅度相對(duì)較小,而Col(5)儲(chǔ)能模量較Col(1)增加了21.3 Pa,變化幅度有所提升.推測由于交聯(lián)劑使纖維單元之間的交聯(lián)進(jìn)一步加強(qiáng)形成纖維單元,繼而相距較遠(yuǎn)的膠原纖維之間也進(jìn)行交聯(lián),膠原纖維出現(xiàn)聚集現(xiàn)象.由于膠原纖維之間的交聯(lián)聚集排列基本趨于穩(wěn)定,雖然交聯(lián)劑用量翻倍增加,Col(10)的儲(chǔ)能模量僅提升5 Pa,變化幅度不大.

表2 1 Hz時(shí)膠原水凝膠的G′、G″和tanδ值

在整個(gè)頻率范圍內(nèi),不同膠原水凝膠的G′值遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過G″值,說明自組裝時(shí)膠原纖維間的纏結(jié)作用賦予了純膠原水凝膠明顯的彈性特征.隨著OCMC用量的增加,G″只是在小范圍內(nèi)波動(dòng).表明交聯(lián)劑并未破壞纖維之間的物理纏結(jié),膠原水凝膠彈性提升的同時(shí),仍保留了部分柔性.不同改性程度的膠原水凝膠表現(xiàn)出相近的柔性,因此隨著OCMC用量的增加,粘性模量基本相近.

損耗因子tanδ為損耗模量G″與儲(chǔ)能模量G′的比值,當(dāng)tanδ<1時(shí),材料主要表現(xiàn)彈性特征,當(dāng)tanδ>1時(shí),材料表現(xiàn)的是粘性特征.如表2所示,在1 Hz時(shí)tanδ值均小于0.14,說明膠原水凝膠的彈性特征占主導(dǎo).當(dāng)OCMC∶Col(w/w)≤0.3∶1時(shí),從tanδ曲線相對(duì)位置可以看出,這一過程對(duì)膠原水凝膠彈性的影響比較顯著,tanδ值降低幅度較大.而當(dāng)OCMC∶Col(w/w)≥1∶1后,OCMC用量增加,tanδ值仍在減小,變化幅度卻較小,Col(10)與Col(0)相比,損耗因子從0.137降至0.094.

綜上,不同用量OCMC對(duì)膠原水凝膠進(jìn)行交聯(lián)改性能能夠進(jìn)一步提高膠原水凝膠的彈性,使膠原水凝膠抵抗形變的能力得到提升.

2.6 蠕變分析

圖7是不同用量OCMC交聯(lián)膠原水凝膠的形變率(Deformation Rate)隨時(shí)間的變化曲線.在施加應(yīng)力后,不同交聯(lián)劑用量的膠原水凝膠都發(fā)生了一定程度的形變,表明膠原水凝膠是一種彈性材料,具有蠕變性[10].其中Col(0)的形變率最大,達(dá)到了13.4%,Col(10)的形變率最低,只有7.9%.Col(0.3)、Col(1)、Col(2.5)和Col(5)的形變率介于兩者之間,分別為13.1%、10.7%、8.7%、8.0%.

圖7 不同用量OCMC交聯(lián)膠原水凝膠的形變率

膠原水凝膠的形變率與其抵抗形變的能力直接相關(guān),形變率越大,該膠原水凝膠抵抗形變的能力越弱[21].交聯(lián)鍵的引入使得膠原纖維之間的交聯(lián)作用加強(qiáng),水凝膠抗形變的能力得到提高,不容易發(fā)生形變.Col(0.3)與Col(0)相比,由于交聯(lián)劑濃度較低,膠原纖維雖交聯(lián)形成了纖維單元,但水凝膠的形變率僅從13.4%降至13.1%.當(dāng)0.3∶15∶1后,雖然交聯(lián)劑用量翻倍增加,但由于膠原纖維之間的排列已經(jīng)非常緊密且基本趨于穩(wěn)定,形變率變化并不明顯,僅為0.1%.

綜上,加入OCMC進(jìn)行交聯(lián)后,膠原水凝膠的膠原纖維間交聯(lián)程度逐步提高,最終聚集排列緊密,并趨于穩(wěn)定,因此形變率逐漸降低,即抵抗形變的能力增強(qiáng).

3 結(jié)論

借助膠原自組裝機(jī)理制備水凝膠,經(jīng)氧化羧甲基纖維素鈉交聯(lián)后得到改性膠原水凝膠.改性后的膠原仍保留完整的三股螺旋結(jié)構(gòu).隨著交聯(lián)劑用量的增加,水凝膠的性能先升高后趨于穩(wěn)定.當(dāng)OCMC∶Col(w/w)≤5∶1時(shí),改性水凝膠性能提升最快.當(dāng)OCMC∶Col(w/w)=5∶1時(shí)水凝膠的熱變性溫度、儲(chǔ)能模量和形變率分別為59.1 ℃、136.0 Pa和8.0%.而后OCMC用量雖翻倍增加,但膠原纖維排列已非常緊密,水凝膠性能變化不大.