夏 飛， 曹靜靜, 馮 婕, 汪夢雯, 劉志超, 崔浪軍

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.漢中市藥材總公司， 陜西 漢中 723000; 3.陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程試驗室， 陜西 西安 710119)

0 引言

附子為毛茛科烏頭屬植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx.的子根，是臨床治療常用的中藥材，具有回陽救逆，助陽補氣，驅(qū)寒散濕的功效.現(xiàn)代研究表明，附子在心血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老等方面具有顯著治療效果[1].附子藥效成分中雙酯型生物堿，屬于附子所含生物堿中有較強毒性的一類[2]；而單酯型生物堿則是附子的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[3].因此，附子的臨床應(yīng)用需經(jīng)過加工炮制，將毒性成分雙酯型生物堿轉(zhuǎn)換為有效成分單酯型生物堿，從而保證臨床安全應(yīng)用.

目前，附子加工炮制工藝多以膽巴炮制為主，膽巴本身具有一定毒性，經(jīng)膽巴炮制后的附子易引入其它雜質(zhì)[4]，目前黑順片的炮制過程中采用膽巴作為炮制輔料，膽巴中所含大量鈣、鎂等金屬離子，具有較高的毒性[5，6].膽巴殘留對人體消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)均有一定毒性和刺激作用[7].采用膽巴炮制附子過程中，后期為去除膽巴殘留,使用清水沖洗也會使附子的有效成分流失[8].現(xiàn)代研究提出附子無膽炮制方式，以達(dá)到減毒增效目的[9].雙酯型生物堿受熱會進行水解，轉(zhuǎn)換成毒性較小的單酯型生物堿[10]，使毒性降低，增強附子臨床應(yīng)用效果.已有研究證實，無膽炒附片中單酯型生物堿含量明顯高于黑順片[11]，同時，無膽炮制所得白附片中總生物堿、單酯型生物堿、雙酯型生物堿含有量均高于傳統(tǒng)膽巴炮制的白附片，且工藝簡單、不易引入雜質(zhì)[12].

中藥往往具有良好的抗氧化活性，可作為潛在天然抗氧化劑[13]，減少各種因素引起的自由基升高導(dǎo)致對細(xì)胞和組織的損傷[14].有關(guān)附子藥理活性研究表明，附子可減少自由基的生成，并且加快其清除，具有一定抗氧化作用[15].目前，附子藥理作用研究重點主要集中在對心血管、免疫、抗腫瘤方面的作用，其抗氧化作用及機制需要進一步研究確定.自由基清除力通常作為抗氧化能力關(guān)鍵指標(biāo)，但自由基清除法會受待測物質(zhì)成分組成、結(jié)構(gòu)等因素影響，因此需同時測定被測物與多種自由基的清除效果，綜合比較，以便更準(zhǔn)確的分析其清除效果[16，17].因此，本文中進一步對附子浸提物的體外抗氧化活性開展研究，為附子的生產(chǎn)加工和進一步安全、有效的應(yīng)用及推廣奠定一定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生附片；烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿等標(biāo)準(zhǔn)品，均為色譜級；乙酸銨(分析純)；甲醇(色譜純)；鹽酸(分析純)；乙腈(色譜純)；DPPH乙醇溶液；雙氧水；鄰苯三酚.

1.2 儀器設(shè)備

LS-C50L立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)；高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；島津LC-2030高效液相色譜儀(日本島津株式會社)；紫外分光光度計.

1.3 實驗方法

1.3.1 單因素考察實驗

以附子中單酯型生物堿和雙酯型生物堿含量為考察指標(biāo)，分別考察浸潤水量、浸潤時間、蒸制溫度、蒸制時間、干燥溫度5個因素對附子生物堿含量的影響.分別以干燥生附片與加入浸潤清水量的定量比例(1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2)，噴淋潤濕飲片，浸潤5 h、10 h、15 h、20 h、25 h，蒸制溫度為100 ℃、105 ℃、110 ℃、115 ℃、120 ℃，分別蒸制20 min、30 min、40 min、50 min、60 min取出，烘干，干燥考察溫度為60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃，分別得到無膽蒸制后的附子炮制飲片.粉碎過100目篩，測定樣品中雙酯型生物堿類及單酯型生物堿類成分的含量.

1.3.2 生物堿含量測定

(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿、苯甲酰新烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL的儲備液，冰箱4 ℃保存.使用時，用流動相逐級稀釋配制成系列工作溶液.所有樣品經(jīng)過分散液微萃取后所得提取液進樣前均需用0.22μm的濾膜過濾.

(2)高效液相色譜條件：使用色譜柱規(guī)格采用Venusil XBP CI8(L) 色譜柱(4.6 mm*250 mm，5μm)，柱溫35 ℃，流動相A ：2 mmol/L 乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)，流動相B：乙腈；洗脫程序：0～3 min，B為0%～8%；3～10 min，B為8%～20%；10～15 min，B為20%～35%；15～35 min，B為35%～50%.流速1 mL/min，進樣量均為10μL.

(3)供試溶液配制：精確稱取附子粉末1.000 g于50 mL試管中，加入5 mL 0.05 mol/L鹽酸，充分混勻，超聲30 min.6 000 r/min離心10 min,吸取上清液0.5 mL，與2 mL甲醇混勻，將混合液通過0.22μm微孔有機濾膜過濾，制成供試樣品液.測定其單酯型生物堿和雙酯型生物堿含量.

(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：稱取烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿、苯甲酰新烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL的儲備液，用流動相逐級稀釋配制成系列工作溶液.以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，進行線性回歸分析，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù).

(5)方法學(xué)驗證：精密度試驗測定新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿的RSD值；穩(wěn)定性試驗測定 6 種生物堿的峰面積RSD.重復(fù)性試驗測定6 種生物堿的RSD；加樣回收率試驗測定回收率.

1.3.3 正交試驗設(shè)計

在單因素實驗基礎(chǔ)上，根據(jù)單因素測定結(jié)果選擇4個主要因素進行4因素3水平的正交設(shè)計，展開正交試驗，分別測定各條件下無膽蒸制附片的單酯生物堿和雙酯生物堿含量，根據(jù)正交試驗結(jié)果優(yōu)選最佳無膽蒸制附片的炮制工藝.

1.3.4 附子體外抗氧化活性

將附子生附片、無膽蒸附片粉碎，準(zhǔn)確稱取粉末2 g，加入200 mL蒸餾水，沸水浴煎煮30 min，離心，取上清液，濃度記為10 mg/mL，并稀釋至8 mg/mL，6 mg/mL，4 mg/mL，2 mg/mL，分別測定各濃度樣品溶液DPPH清除率[18]、羥基自由基的清除率[19]、超氧陰離子清除率[20].每個樣品重復(fù)測定三次，取平均值.以Vc作為對照進行測定.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素篩選結(jié)果

2.1.1 加入浸潤水量對附子單酯型生物堿含量的影響

無膽蒸附片有效成分單酯生物堿含量隨加入浸潤清水量的增加呈降低趨勢，浸潤干燥生附片，加入清水量為1∶0.4時，單酯生物堿含量值顯示為最大值0.033 7%，當(dāng)浸潤水量為1∶1時，單酯生物堿含量降至0.015 2%，如圖1所示.浸潤過程中，單酯生物堿成分可能會隨浸潤液存在一定程度的流失[8]，為避免有效成分過多流失，因此選擇加入浸潤水量比例為1∶(0.4～0.8)范圍進行正交試驗考察.

圖1 浸潤水量對附子單酯生物堿含量的影響

浸潤時間對無膽蒸附片單酯型生物堿成分的含量影響總體呈降低趨勢，浸潤時間5 h，單酯型生物堿含量為0.025 3%，當(dāng)浸潤時間延長至15 h，單酯生物堿含量為0.025 5%，隨著浸潤時間的增加，20 h時，單酯型生物堿含量降低至0.019 3%(圖2)，綜合考慮炮制工藝時長及成本，故而正交試驗中選定浸潤時間為5 h，進行實驗考察.

圖2 浸潤時間對附子單酯生物堿含量的影響

2.1.3 蒸制溫度對附子單酯型生物堿含量的影響

無膽蒸附片有效成分單酯生物堿含量隨著蒸制溫度的升高呈增加趨勢，當(dāng)溫度為100 ℃時，單酯生物堿含量為0.017 1%，溫度升高至110 ℃時，單酯生物堿含量隨之升高至0.020 8%，120 ℃時，單酯生物堿含量高達(dá)0.025 7%(圖3).因附子炮制過程中，毒性成分雙酯型生物堿受熱會水解為有效成分單酯型生物堿，從而使得單酯型生物堿含量增加，以發(fā)揮減毒增效的作用[21]，同時，考慮工業(yè)生產(chǎn)條件的可控性及經(jīng)濟成本等因素，選擇110 ℃～120 ℃的蒸制溫度范圍進行正交實驗考察.

圖3 蒸制溫度對附子單酯生物堿含量的影響

2.1.4 蒸制時間對附子單酯型生物堿含量的影響

無膽蒸附片有效成分單酯生物堿含量隨蒸制時間的延長，整體呈下降趨勢，蒸制時間為30～50 min時，單酯生物堿含量變化趨于穩(wěn)定為0.017 4%～0.017 8%，但在蒸制時長達(dá)60 min時，含量有所下降，為0.014 2%(圖4).由于附子炮制過程中，單酯型生物堿會在溫度影響下，隨時間的延長進而水解成醇胺類烏頭原堿類生物堿，導(dǎo)致單酯生物堿含量測定結(jié)果降低[22]，綜合考慮減毒效果及炮制時長和有效成分的保留，選擇40～60 min的蒸制時間范圍進行正交實驗考察.

圖4 蒸制時間對附子單酯生物堿含量的影響

2.1.5 干燥溫度對附子單酯型生物堿含量的影響

隨著干燥溫度的升高，無膽蒸制附片單酯生物堿含量呈增加趨勢(圖5)，干燥溫度為60 ℃時，單酯生物堿含量為0.024 5%，90 ℃時含量升高為0.025 7%，100 ℃干燥時，單酯生物堿含量升高至0.030 5%，考慮藥材飲片儲存要求以及加工生產(chǎn)成本，選擇80 ℃～100 ℃的干燥溫度范圍進行正交實驗考察.

圖5 干燥溫度對附子單酯生物堿含量的影響

基于單因素篩選的結(jié)果，加入浸潤水量，蒸制溫度，蒸制時間、干燥溫度四個因素為正交實驗主要考察因素，采用四因素三水平L9(34)正交設(shè)計，進行實驗考察.

2.2 正交優(yōu)化附子炮制條件結(jié)果

基于單因素篩選的結(jié)果，選擇蒸制溫度(A)、蒸制時間(B)、浸潤水量(C)、干燥溫度(D)為正交實驗主要考察因素，采用四因素三水平L9(34)正交設(shè)計，正交設(shè)計如表1所示.

成蟲、幼蟲均為害小麥，以幼蟲為害為主。成蟲沿葉脈啃食葉肉，成白條狀，不食下表皮，幼蟲鉆入新葉內(nèi)舔食葉肉，葉面出現(xiàn)寬白條狀食痕，造成葉面枯焦。

表1 正交設(shè)計各因素和水平表

根據(jù)正交設(shè)計四因素三水平L9(34)試驗方案，共得到9組實驗結(jié)果(表2)，根據(jù)2020年版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)[23]，附子單酯型生物堿含量不少于0.01%，雙酯生物堿含量不得超過0.02%.從表2可得到，蒸制優(yōu)選炮制條件為∶浸潤水量1∶0.4，蒸制溫度120 ℃，蒸制時間50 min，干燥溫度100 ℃時，此時單酯生物堿含量為0.350 6%，結(jié)果可達(dá)到藥典對2種生物堿含量的要求.

表2 正交試驗方案及結(jié)果

由表2分析可知∶蒸制溫度(A)、蒸制時間(B)、浸潤水量(C)、干燥溫度(D)4個因素極差R大小依次為：A>D>C>B；對正交實驗結(jié)果進行方差分析(表3)，蒸制溫度因素結(jié)果差異顯著，說明蒸制溫度對單酯生物堿含量具有顯著影響(P<0.05).

表3 方差分析

綜合優(yōu)選附子無膽蒸制最優(yōu)條件組合為，即浸潤水量1∶0.4、蒸制溫度120 ℃、蒸制時間50 min、干燥溫度100 ℃.所得蒸制附片中單酯類生物堿含量達(dá)0.308 5%，雙酯生物堿含量減少至0.014 8%.該結(jié)果符合2020年版 《中國藥典》 中有關(guān)要求.經(jīng)高溫?zé)o膽蒸制，可使毒性成分雙酯生物堿快速轉(zhuǎn)化為無毒單酯型生物堿，而且蒸制時間不宜過長，長時間蒸制可能會造成生物堿類成分流失[12].

2.3 生物堿含量檢測方法學(xué)驗證結(jié)果

本研究以附子6中生物堿成分為指標(biāo)，采用高效液相方法測定附子炮制品的生物堿含量，以對照品進樣量為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程；并對液相方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率進行測定，結(jié)果如表4所示，線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，加樣回收率均97%以上.

2.4 生附片和無膽蒸附片生物堿含量測定結(jié)果

無膽蒸制附片與生附片中生物堿含量對比顯示(圖6)，無膽蒸附片的有效成分單酯型生物堿含量為0.350 6%，生附片單酯型生物堿含量為0.075%，無膽蒸制工藝下附片的有效成分單酯生物堿含量高于生附片.同時蒸附片雙酯生物堿含量為0.014 8%，生附片雙酯生物堿含量為0.818 2%，生附片毒性成分遠(yuǎn)高于無膽蒸附片，無膽蒸制炮制工藝具有顯著的減毒效果(P<0.01).

生附子生物堿成分主要為雙酯型生物堿，且該類化合物可能導(dǎo)致嚴(yán)重急性毒性事件[24]，同時雙酯型生物堿穩(wěn)定性也較差，經(jīng)炮制可水解成藥效活性強且毒性低的單酯型生物堿及原堿[10].隨著附子炮制方式的持續(xù)研究，現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)被普遍利用，利用雙酯型生物堿受熱易水解特性進一步研究附子炮制工藝，鄧文偉等[25]采用烘箱烘烤加熱法進一步探索質(zhì)量合格的附子炮制工藝；賀亞男等[26]采用微波加熱炮制法研究附子微波炮制工藝.本研究主要采取高溫蒸制方式，進一步研究降低毒性，保留附子藥效的炮制工藝，結(jié)果證明，高溫蒸制方式簡單、便捷、可推廣.

表4 生物堿回歸方程方法學(xué)驗證

圖6 無膽附子與生附片生物堿含量(“**”表示差異顯著(P<0.01))

2.5 無膽蒸附片體外抗氧化活性

2.5.1 DPPH自由基清除能力

無膽蒸附片和生附片對DPPH自由基的清除率均存在一定量效關(guān)系(圖7)，當(dāng)濃度在2 mg/mL時，無膽蒸附片清除率為71.8%，生附片為48.9%，同濃度的Vc對照清除率為96.4%，該濃度下無膽蒸附片DPPH自由基清除率高于生附片.當(dāng)濃度升高至8 mg/mL時，無膽蒸附片清除率升高至89.0%，生附片也隨之升高至86.9%.隨著濃度增加，無膽蒸附片對DPPH自由基的清除率均呈上升趨勢，具有較好清除效果.

圖7 蒸附片對DPPH自由基清除率

2.5.2 超氧陰離子清除能力

測定生附片及無膽蒸附片對超氧陰離子清除率，結(jié)果如圖8所示.無膽蒸附片對超氧陰離子的清除率隨著濃度的增加，總體呈上升趨勢.當(dāng)濃度在4 mg/mL時，Vc對照清除率為56.5%，無膽蒸附片清除率為3.5%，生附片清除率為10.5%，當(dāng)濃度在8 mg/mL時，無膽蒸附片清除率升高為11.7%，生附片清除率為15.6%，總體結(jié)果顯示無膽蒸附片和生附片均對超氧陰離子具有一定清除效果.

圖8 蒸附片對超氧陰離子清除率

2.5.3 羥基自由基清除能力

生附片及無膽蒸附片對羥基自由基的清除率隨著濃度的增加，有一定升高趨勢,如圖9所示.當(dāng)濃度為4 mg/mL時，無膽蒸附片清除率為16.027%，生附片在該濃度時清除率為10.745%，當(dāng)濃度增加為8 mg/mL時，無膽蒸附片清除率升高為30.016%，大于生附片在該濃度時清除率值16.025%，無膽蒸附片清除率升高趨勢大于生附片.

綜合分析無膽蒸附片與生附片的抗氧化活性，兩者對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子的清除效果差異不顯著.此外，無膽蒸附片和生附片對羥基自由基和超氧陰離子清除效果相似，但對DPPH自由基清除能力略有升高，其可能與自由基的性質(zhì)有關(guān)，DPPH自由基抗氧化效果更有助于抗氧化結(jié)果分析[27].

圖9 蒸附片對羥基自由基清除率

3 結(jié)論

本研究采用正交試驗分析得出最佳無膽蒸制工藝為：浸潤干燥生附片、浸潤水量為1∶0.4、蒸制溫度120 ℃、蒸制時間50 min、干燥溫度100 ℃.在該條件下所得無膽蒸附片單酯生物堿含量達(dá)0.350 6%，高于生附片單酯生物堿含量0.075 5%;同時,測定兩者毒性成分雙酯生物堿含量，無膽蒸附片雙酯生物堿含量為0.014 8%，結(jié)果符合2020年版《中國藥典》中對附子飲片單酯生物堿含量不得低于0.010%，雙酯型生物堿含量不得超過0.020%的要求;無膽蒸附片對DPPH、羥基自由基以及超氧陰離子清除率具有一定的效果.

本研究炮制工藝方法簡捷，能夠縮短藥材的炮制時間.同時，通過溫度、時間的控制，避免過度炮制的傾向，降低附子毒性并保留有效成分，適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用，并為附子臨床應(yīng)用和選擇提供參考價值.