禹博威 潘曉瓊 陳君第霞 胡臻

1.溫州醫(yī)科大學(xué) 浙江，溫州 325000 2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院

2型糖尿病是糖尿病的常見類型，以長期高血糖狀態(tài)和胰島素抵抗為主要臨床表現(xiàn)，可引發(fā)視網(wǎng)膜病變及神經(jīng)損傷、糖尿病腎病、心血管病變等并發(fā)癥[1-2]。在糖尿病諸多大血管并發(fā)癥中，以動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）最為常見，其發(fā)生發(fā)展可導(dǎo)致冠心病、腦梗死等一系列心血管疾病，是引起患者死亡的主要危險因素[3]。血管內(nèi)皮功能異常是導(dǎo)致AS相關(guān)心血管病變的重要因素，早期可表現(xiàn)為血管內(nèi)膜脂蛋白和單核細(xì)胞的滲透積聚，單核細(xì)胞在內(nèi)膜下先分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吞噬積聚的脂蛋白后轉(zhuǎn)變成泡沫細(xì)胞，活化的內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，引起纖維組織增生，逐步形成纖維斑塊，斑塊導(dǎo)致的血管堵塞和斑塊破裂引起的血栓都會引發(fā)的動脈粥樣硬化性栓塞[4]，所以防治內(nèi)皮功能異常是治療AS的關(guān)鍵點。

中藥黃芪是豆科植物黃芪的干燥根莖，其主要活性提取物黃芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）及黃芪甲苷等具有一系列藥理作用，包括促進(jìn)免疫反應(yīng)、抗炎、保護(hù)血管、抗氧化、改善胰島素抵抗和抗腫瘤等[5-9]，已被廣泛用于心血管疾病的治療。研究顯示，APS能夠促進(jìn)一氧化氮（nitric oxide，NO）的產(chǎn)生，改善NO相關(guān)的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能障礙[10]。NO是血管內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌的血管內(nèi)皮舒張因子，除了維持血管內(nèi)皮舒張功能外，還具有抑制白細(xì)胞和血小板聚集和黏附、誘導(dǎo)血小板解聚、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長等作用[11-12]。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）是NO生成和消除的關(guān)鍵酶。有研究表明，磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）能夠通過激活eNOS，提高NO水平，以維持血管內(nèi)皮功能[13-14]。NOX活性升高，ROS產(chǎn)生增多，則會抑制eNOS活性，引起NO釋放減少[15]。另外有報道證實，APS能夠通過AMPK通路促進(jìn)葡萄糖攝取，改善胰島素抵抗并減輕炎癥反應(yīng)[7，16]。但APS促進(jìn)NO生成是否與AMPK途徑有關(guān)尚不明確，因此本研究以高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ） 腹腔注射+維生素D3（vitamin D3，VitD3）灌胃+免疫損傷法建立糖尿病AS大鼠模型，探討APS對AS大鼠NO調(diào)節(jié)信號通路的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF） 級SD雄性大鼠50只，4周齡，體質(zhì)量80～120g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供［實驗動物生產(chǎn)許可證號碼：SCXK（浙）2015-0001］，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心［實驗動物使用許可證號碼：SYXK（浙）2016-0006］。

1.1.2 主要試劑 70% APS購于上海士鋒生物科技有限公司（批號：89250-26-0）；弗氏完全佐劑、卵清蛋白均購于美國Sigma公司（批號：F5881、A5503）；98% VitD3購于上海源葉生物科技有限公司（批號：S28148）；STZ、蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒均購于北京索萊寶科技有限公司（批號：S8050、G1121）；大鼠胰島素（insulin，INS）酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購于上海博蘊(yùn)生物科技有限公司（BF-E30620）；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購于美國Invitrogen公司（批號：15596026、4374967、1176102K）；血糖儀及血糖試紙均購于瑞士羅氏公司（批號：10151134、26000931）。

1.1.3 主要儀器 AU5800全自動生化分析儀購于美國Beckman Coulter公司；DM2500熒光正置顯微鏡、EG1150石蠟包埋機(jī)、RM2235石蠟切片機(jī)均為德國徠卡公司產(chǎn)品；TPJ-A型攤片機(jī)、TPJ-A型烘片機(jī)均購于常州中威電子儀器有限公司；DW-86L626超低溫冰箱為中國海爾公司產(chǎn)品；超速低溫離心機(jī)購于美國Thermo Forma公司；Light Cycler480型實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）儀為瑞士羅氏公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病AS模型建立 50只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，選取30只造模，剩余20只不作處理。造模大鼠予高脂飼料飼養(yǎng)4周，配方為78.8%基礎(chǔ)飲食、10%蛋黃粉、10%豬油、1%膽固醇、0.2%豬膽汁鹽，使之產(chǎn)生胰島素抵抗；其余大鼠飼喂普通飼料。STZ以pH值為4.5的0.1mol·L-1檸檬酸緩沖液溶解，配制成濃度為1%的STZ溶液。注射前大鼠禁食不禁飲12h，造模大鼠以35mg·kg-1的劑量一次性腹腔注射STZ，未造模大鼠注射等量0.9%氯化鈉注射液。VitD3以無水乙醇溶解，配制成濃度為30mg·mL-1的溶液，再與食用油按1∶4的比例混合配成混合溶液，在造模大鼠注射STZ 1周后，以VitD3 15mg·kg-1的劑量灌胃1次，未造模大鼠給予乙醇食用油混合溶液灌胃。次日，將弗氏完全佐劑與卵清蛋白混合成抗原乳液，在造模大鼠背部按照3mg·kg-1的劑量皮下注射1次，間隔3周后以2.5mg·kg-1的劑量腹腔注射，加強(qiáng)免疫誘導(dǎo)，1次/周，連續(xù)注射3周；未造模大鼠只注射等量0.9%氯化鈉注射液。STZ注射1周后，在大鼠尾尖取血，連續(xù)2次，以快速血糖儀測空腹6h后血糖，空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）≥11.1mmol·L-1者為糖尿病模型造模成功[17]。

1.2.2 分組和給藥 30只造模大鼠中，實驗期間死亡10只，將余下20只造模大鼠，分為模型組和治療組；另將20只未造模大鼠分為空白對照組和APS對照組，每組10只。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)多數(shù)研究者采用700mg/（kg·d）的APS進(jìn)行灌胃治療，均有比較明顯的延緩糖尿病進(jìn)展的作用[18-20]。前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，高濃度（大于700mg·kg-1）灌胃過程中容易出現(xiàn)藥物返流，引發(fā)肺炎和窒息，難以保證大鼠生存率。綜合考慮后，最終以700mg·kg-1作為灌胃治療的劑量。APS對照組與治療組以700mg·kg-1APS灌胃治療；空白對照組與模型組以等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，連續(xù)給藥8周。

1.2.3 檢測指標(biāo)

1.2.3.1 大鼠一般情況 觀察并記錄各組大鼠的精神狀態(tài)、活動情況、毛色情況、飲食飲水量以及二便情況。

1.2.3.2 樣本采集 末次給藥后，大鼠以10%水合氯醛3.5mL·kg-1腹腔注射麻醉，心臟取血3～5mL置于冰上備用。打開胸腔后分離胸主動脈，部分樣本-80℃凍存；部分樣本以4%多聚甲醛溶液固定備用。

1.2.3.3 血生化指標(biāo)檢測 將冷凝后的大鼠血液，3000r/min離心15min后取血清-20℃保存，以全自動生化分析儀檢測血清FBG、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平。以ELISA法檢測空腹胰島素（fasting serum insulin，F(xiàn)INS）水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)FBG和FINS計算胰島素抵抗指數(shù)（homeostatic model assessment of insulin resistance，HOMA-IR），HOMA-IR=FINS×FBG/22.5。

1.2.3.4 胸主動脈病理形態(tài)學(xué)觀察 將經(jīng)多聚甲醛溶液固定24h的胸主動脈組織取出，洗滌后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5μm切片，按照HE染色試劑盒說明書脫蠟、染色、封片，光鏡下觀察。

1.2.3.5 Real-time qPCR檢測胸主動脈組織eNOS、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4）、AMPK mRNA的表達(dá) 取150mg樣本組織，充分研磨后，以Trizol試劑抽提總RNA。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物設(shè)計和合成在Invitrogen公司完成，序列見表1。反應(yīng)體系共25μL，由 5 ×PCR Buffer 5.0μL、250mmol·L-1Mg2+0.3μL、10mmol·L-1脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）0.75μL、10μmol·L-1上 下游引物各0.5μL、25×SYBRGreen Ⅰ 1.0μL、10-3×Calibration 1.0μL、5U·μL-1HS-Ex-Taq酶0.25μL、ddH2O 14.7μL、cDNA 1.0μL組成。 反應(yīng)條件見表2，產(chǎn)物4℃保存。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

表2 反應(yīng)條件Tab.2 Reaction conditions

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。服從正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。若滿足方差齊性，兩組間多重比較采用Bonferroni法；若方差不齊，采用Tamhane T2法檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 未造模大鼠一般情況良好；造模大鼠活動減少，精神欠佳，毛發(fā)干枯易脫落，缺少光澤，出現(xiàn)2型糖尿病典型的多食、多飲、多尿癥狀，體重減少；治療組大鼠上述癥狀有所好轉(zhuǎn)。

2.2 各組大鼠血清FBG、FINS水平和HOMA-IR比較 與空白對照組比較，模型組和治療組血清FBG、FINS水平和HOMA-IR均升高（P＜0.05，P＜0.01）；APS對照組FBG、FINS水平和HOMA-IR差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，治療組血清FBG、FINS水平和HOMA-IR降低（P＜0.05）。 見表3。

表3 各組大鼠FBG、FINS及HOMA-IR比較（±s）Tab.3 Comparison of FBG，F(xiàn)INS and HOMA-IR in each group（±s）

表3 各組大鼠FBG、FINS及HOMA-IR比較（±s）Tab.3 Comparison of FBG，F(xiàn)INS and HOMA-IR in each group（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05Note:Compared with blank control group，*P＜0.05，**P＜0.01;compared with model group，#P＜0.05

組別 n FBG（mmol·L-1） FINS（mU·mL-1） HOMA-IR空白對照組 10 5.82±0.97 12.91±1.40 3.31±0.46 APS 對照組 10 5.38±1.05 12.87±1.12 3.05±0.43模型組 10 26.60±3.10* 22.62±2.53* 26.93±5.58**治療組 10 21.80±3.30*# 19.05±2.76*# 18.57±4.38**#

2.3 各組大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較 與空白對照組比較，模型組和治療組TC、TG、LDL-C水平升高（P＜0.01），HDL-C水平降低（P＜0.01）；APS對照組TC、TG、LDL-C、HDL-C水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 與模型組比較，治療組TC、TG、LDL-C水平下降（P＜0.05），HDL-C水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較（±s，mmol·L-1）Tab.4 Comparison of levels of TC,TG,LDL-C and HDL-C in each group(±s，mmol·L-1)

表4 各組大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較（±s，mmol·L-1）Tab.4 Comparison of levels of TC,TG,LDL-C and HDL-C in each group(±s，mmol·L-1)

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05Note:Compared with blank control group,**P＜0.01;compared with model group,#P＜0.05

組別 n TC TG HDL-C LDL-C空白對照組 10 1.99±0.55 0.48±0.11 1.10±0.10 0.25±0.08 APS 對照組 10 1.84±0.59 0.48±0.17 1.15±0.11 0.27±0.09模型組 10 5.68±0.61** 1.05±0.21** 0.64±0.16** 0.58±0.14**治療組 10 4.77±1.05**# 0.84±0.15**# 0.77±0.09** 0.43±0.12**#

2.4 各組大鼠胸主動脈病理形態(tài)學(xué)比較 空白對照組和APS對照組胸主動脈組織管腔結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)皮光滑，無明顯增生，平滑肌細(xì)胞排列規(guī)則，無鈣化和泡沫細(xì)胞生成。模型組主動脈內(nèi)膜不規(guī)則增厚，向管腔內(nèi)凸起形成斑塊，并伴有泡沫細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤，中膜鈣化，平滑肌細(xì)胞排列紊亂。治療組內(nèi)膜仍有大量泡沫細(xì)胞沉積，內(nèi)膜局部增厚形成粥樣斑塊，細(xì)胞增生廣泛明顯，排列不規(guī)則，但病變程度較模型組輕。見圖1。

圖1 各組大鼠胸主動脈病理形態(tài)學(xué)比較（HE染色，400×）Fig.1 Comparison of pathomorphology of thoracic aorta in each group（HE staining，400×）

2.5 各組大鼠胸主動脈組織eNOS、NOX4、AMPK mRNA表達(dá)水平比較 治療8周后，與空白對照組比較，模型組和治療組胸主動脈組織中eNOS mRNA和AMPK mRNA表達(dá)水平下降，NOX4 mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；APS對照組eNOS、NOX4、AMPK mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，治療組eNOS mRNA和AMPK mRNA表達(dá)水平升高，NOX4 mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見圖2。

圖2 各組大鼠胸主動脈組織中eNOS、NOX4、AMPK mRNA表達(dá)比較Fig.2 Comparison of the mRNA expression of eNOS，NOX4 and AMPK of thoracic aorta tissue in each group

3 討論

目前認(rèn)為，AS是一種血管炎性疾病，其特征在于脂質(zhì)積累、炎性細(xì)胞積聚、血管平滑肌細(xì)胞在內(nèi)膜層遷移和增殖導(dǎo)致的血管腔狹窄，以及脂質(zhì)過氧化、內(nèi)皮功能障礙、活化的巨噬細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)等因素激活血小板，使其黏附、聚集[21]，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞的活化和功能障礙是形成AS的關(guān)鍵步驟[22]。研究證實，內(nèi)皮eNOS功能受損引起的NO生成減少是內(nèi)皮功能障礙的一個重要標(biāo)志[23]。

NOX介導(dǎo)的ROS生成是引起血管功能障礙的重要因素[24]。NOX4作為NOX家族的一種亞型，主要在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，其主要作用是誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，而ROS的產(chǎn)生會影響eNOS活性，引起NO釋放減少。AMPK是一種廣泛表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的能量傳感器，通過AMPK/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）/eNOS信號通路提高NO水平，以維持血管內(nèi)皮細(xì)胞功能[25-26]。

黃芪是歷史悠久的傳統(tǒng)藥材，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、托毒排膿、斂瘡生肌等作用，臨床上常用黃芪治療氣虛乏力、脫肛、子宮脫垂、癰疽、慢性腎炎、糖尿病等病癥。APS是從黃芪中提取的主要活性成分之一，研究發(fā)現(xiàn)APS可以通過激活A(yù)MPK，從而改善糖尿病大鼠的高血糖狀態(tài)、肝糖原合成和骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運[27]。

本研究采用高脂飲食聯(lián)合STZ腹腔注射+VitD3灌胃+免疫損傷法建立糖尿病AS模型，觀察APS對糖脂代謝、胰島素抵抗和AMPK、eNOS及NOX4 mRNA表達(dá)的影響，從而進(jìn)一步驗證APS能否通過AMPK信號通路，調(diào)節(jié)eNOS與NOX4的活性，從而影響NO生成。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)APS干預(yù)的治療組大鼠血糖、血脂水平下降、胰島素抵抗情況改善，AMPK、eNOS mRNA表達(dá)上升，NOX4 mRNA表達(dá)下降，HE染色顯示大鼠胸主動脈的病變程度較模型組明顯改善。這些均提示APS可以改善糖尿病AS大鼠的高血糖和高血脂狀態(tài)，促進(jìn)胰島功能恢復(fù)，增加胰島素敏感性以減輕胰島素抵抗；同時能夠激活A(yù)MPK信號通路，升高eNOS活性，抑制NOX4活性。升高eNOS活性、抑制NOX4活性可以確保內(nèi)皮細(xì)胞生成足夠的NO，從而減輕NO依賴的血管內(nèi)皮功能損害，起到延緩AS發(fā)展的作用。本研究還設(shè)置了APS對照組，與空白對照組比較發(fā)現(xiàn)，兩組大鼠血糖、血脂差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而且NOX4、eNOS、AMPK mRNA的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。由此筆者推測，APS可能對健康大鼠無明顯影響，僅對患病大鼠AMPK相關(guān)信號通路有著比較明顯的作用。

綜上所述，本研究提示APS能有效改善大鼠的糖尿病和AS狀態(tài)，調(diào)節(jié)血糖血脂水平，保護(hù)血管內(nèi)皮功能，抑制粥樣斑塊形成，這可能與激活A(yù)MPK相關(guān)信號通路、活化eNOS、抑制NOX4表達(dá)有關(guān)，但APS對健康大鼠無明顯影響。