姜 寧，朱淑彤，蘇浩雨，黃 洋，王道才，方 慶，陳莉莉，劉曉鵬*

1湖北民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院；2生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，恩施 445000

硒是人體的必須微量元素，在體內(nèi)主要參與形成谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase，TrxR)、硒蛋白P(selenoprotein P，Selp)，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、氧化還原狀態(tài)及關(guān)鍵細(xì)胞活動(dòng)[1]。硒在自然界中主要以無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒存在，其中無(wú)機(jī)硒的安全范圍很小，食用菌具有較強(qiáng)的富硒能力，能將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為人體吸收和利用的有機(jī)硒[2]。食用菌常用子實(shí)體培養(yǎng)或深層發(fā)酵菌絲體培養(yǎng)，與傳統(tǒng)的子實(shí)體培養(yǎng)相比，深層發(fā)酵具有占地少、成本小、產(chǎn)量高、質(zhì)量可控、重復(fù)性好、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。目前，通過在液體培養(yǎng)基中添加無(wú)機(jī)硒，深層發(fā)酵培養(yǎng)富硒食用菌菌絲體，從中提取富硒產(chǎn)品(如富硒多糖)，已得到廣泛應(yīng)用[3]。

猴頭菌(Hericiumerinaceus(Rull ex F.) Pers)屬擔(dān)子菌門、傘菌綱、紅菇目、齒菌科[4]，它除了味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富外，還具有降血糖[5]、抗氧化[6]和抗衰老[7]、促進(jìn)周圍神經(jīng)再生[8]，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[9]、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)能力[10]等功效，尤其對(duì)治療胃潰瘍及胃腸癌有顯著作用[11]。猴頭菌作為味道、營(yíng)養(yǎng)、功效倶佳的食用菌，是用來(lái)富硒培養(yǎng)的優(yōu)質(zhì)材料，但目前對(duì)猴頭菌的富硒培養(yǎng)大多僅限于子實(shí)體的培養(yǎng)，有關(guān)深層發(fā)酵培養(yǎng)富硒猴頭菌的報(bào)道還很少。

本文研究了3種猴頭菌的富硒能力，篩選出耐硒菌種；優(yōu)化深層發(fā)酵培養(yǎng)碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和維生素的種類和配比；確定無(wú)機(jī)硒培養(yǎng)液中的添加量，得到猴頭菌富硒菌絲體，為富硒猴頭菌產(chǎn)品的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：猴頭菌H2、猴頭菌H99由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，猴頭菌NK由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

試劑：Na2SeO3(山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，純度>98%，批號(hào)：20160703)；葡萄糖(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，純度>99%，批號(hào)：20181201)；麥芽糖(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度≥99%，批號(hào)：20160920)；可溶性淀粉(天津市天力化學(xué)試劑有限公司，純度>99%，批號(hào)：20160920)；瓊脂粉(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，純度>95%，批號(hào)：20180517)；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

SPX-250B生化培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；HZQ-F100全溫振蕩培養(yǎng)箱(大倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；TGL-16G離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；AFS-230E原子熒光光度計(jì)(北京海光儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

固體培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖1%，麥芽糖1%，MgSO40.15%，K2HPO40.1%，pH自然。

深層發(fā)酵培養(yǎng)基基本配方[12]：4.6%可溶性淀粉，4.6%黃豆粉，0.02% KH2PO4，0.018%維生素B1。黃豆粉需加適量水浸沒，煮沸30 min，過濾取濾液；可溶性淀粉需加熱使其充分溶解。

1.3.2 耐硒菌種及其耐硒濃度的篩選

將H2、H99、NK菌種放入28 ℃培養(yǎng)箱里活化，30 min后，用接種鏟從平板上切取1 cm2菌絲濃密適當(dāng)、生長(zhǎng)良好的菌種分別接入含Na2SeO3濃度為0、2、4、6、8、10、20、50 μg/mL的PDA平板培養(yǎng)基中，28 ℃倒置培養(yǎng)至空白平板菌絲長(zhǎng)滿，觀察其生長(zhǎng)狀況和菌絲顏色，比較3個(gè)菌種的耐硒能力，篩選耐硒菌種及其耐硒濃度。

1.3.3 猴頭菌液體種子的制備及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

用接種鏟從平板上切取生長(zhǎng)旺盛的1 cm2菌塊，接入液體種子液培養(yǎng)基中，并在25.8 ℃，搖瓶轉(zhuǎn)速為150 rpm條件下進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，每24 h取樣1次，每次取3瓶。四層紗布過濾種子液，用蒸餾水沖洗菌絲上的雜質(zhì)，105 ℃烘干至恒重(105 ℃烘2 h，冷卻后稱重，再放入105 ℃中烘30 min再稱重，兩次稱重的重量差不超過2 mg即為恒重)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌絲干重為縱坐標(biāo)，繪制種子液的生長(zhǎng)曲線。根據(jù)種子液的生長(zhǎng)曲線確定種子液的培養(yǎng)時(shí)間。

1.3.4 猴頭菌的深層發(fā)酵

每250 mL三角瓶裝量100 mL培養(yǎng)基，接種量11%、發(fā)酵溫度25.8 ℃、搖瓶轉(zhuǎn)速137 rpm，搖瓶培養(yǎng)7天[12]。

1.3.5 液體培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

1.3.5.1 單因素試驗(yàn)

(1)碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

分別以葡萄糖(glucose，Glc)、蔗糖(sucrose，Suc)、麥芽糖(maltose，Mal)、可溶性淀粉(Soluble starch，SS)、乳糖(lactose，Lac)、玉米淀粉(corn starch，CS)為碳源，濃度均為4.6%，其它成分為基本培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)條件按照“1.3.4”進(jìn)行。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液四層紗布過濾，用蒸餾水沖洗菌絲上的雜質(zhì)，105 ℃烘干至恒重。

(2)氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

分別以(NH4)2NO3、(NH4)2SO4、NaNO3、酵母膏(yeast extract，YE)、麩皮(bran，Bra)、豆餅粉(bean cake powder，BCP)、黃豆粉(soybean powder，SP)、尿素(urea，Ure)、蛋白胨(peptone，Pep)為氮源，濃度均為4.6%。其余成分同基本培養(yǎng)基配方。具體操作同“(1)”。

(3)無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

CaCl2、KCl、KH2PO4、FeSO4、MgSO4、K2HPO4，濃度均為0.02%。其余成分同基本培養(yǎng)基配方。具體操作同“(1)”。

(4)維生素B對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

VB分別為VB1、VB2、VB6、VB1+VB2、VB1+VB6、VB2+VB6、VB1+VB2+VB6，濃度均為0.018%。其余成分同基本培養(yǎng)基配方。具體操作同“(1)”。

1.3.5.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素結(jié)果，采用四因素三水平正交表L9(34)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，具體因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.5.3 正交試驗(yàn)的驗(yàn)證

采用正交試驗(yàn)的優(yōu)選培養(yǎng)基培養(yǎng)猴頭菌。稱量菌絲體干重，以驗(yàn)證優(yōu)化培養(yǎng)基的適用性和穩(wěn)定性。

1.3.6 培養(yǎng)基不同營(yíng)養(yǎng)元素配比的優(yōu)化

1.3.6.1 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)單因素、正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取最佳碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、維生素，采用U74均勻設(shè)計(jì)表，每一因素取7水平，根據(jù)菌絲體干重確定其培養(yǎng)基的最佳配比。因素及水平如表2所示。

表2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of uniform design test

1.3.6.2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)的驗(yàn)證

采用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化的培養(yǎng)基培養(yǎng)猴頭菌，稱量菌絲干重，與理論產(chǎn)量比較，對(duì)優(yōu)化的培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.7 猴頭菌液體培養(yǎng)最適硒濃度的確定

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在優(yōu)化的深層培養(yǎng)基中加入Na2SeO3，使其濃度分別為0、2、4、6、8、10、12 μg/mL，培養(yǎng)條件同上。測(cè)定菌絲干重、總硒含量和有機(jī)硒含量。

1.3.8 硒含量的測(cè)定

根據(jù)GB5009.93—2017《食品中硒的測(cè)定》，采用原子熒光光譜法測(cè)定樣品中的總硒和無(wú)機(jī)硒含量。有機(jī)硒含量為總硒含量與無(wú)機(jī)硒含量的差值。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(standard error，SE)，組間多重比較用最小顯著差異(least significant difference，LSD)法，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐硒菌種的篩選及其耐硒濃度的確定

猴頭菌H2在含0～50 μg/mL Na2SeO3平板上的生長(zhǎng)狀況如圖1所示。在含Na2SeO32 μg/mL平板(見圖1B)上，H2的長(zhǎng)勢(shì)與空白對(duì)照(見圖1A)相比無(wú)明顯差異，當(dāng)Na2SeO3濃度升至4 μg/mL時(shí)，菌絲半徑開始減小，且隨著硒濃度的增大，菌絲半徑逐漸減小(見圖1C)。當(dāng)硒濃度為8、10 μg/mL時(shí)(見圖1E、F)，盡管氣生菌絲長(zhǎng)勢(shì)仍較茂密，但菌絲半徑與6 μg/mL的平板(見圖1D)相比已明顯減小，說(shuō)明菌絲的延伸已受到抑制。當(dāng)Na2SeO3濃度達(dá)到50 μg/mL時(shí)菌絲顏色變深，菌絲長(zhǎng)勢(shì)極弱(見圖1H)。

圖1 硒濃度對(duì)猴頭菌H2生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of selenium concentration on the growth of H.erinaceus H2

圖2為猴頭菌H99在含0～50 μg/mL Na2SeO3平板上培養(yǎng)相同時(shí)間后的生長(zhǎng)情況。由圖可知：當(dāng)平板上不含Na2SeO3時(shí)(見圖2A)，H99長(zhǎng)勢(shì)旺盛，氣生菌絲較長(zhǎng)，隨著Na2SeO3濃度的不斷提高，菌絲長(zhǎng)勢(shì)逐漸減弱，基內(nèi)菌絲開始變成紅色，當(dāng)Na2SeO3濃度超過4 μg/mL時(shí)，氣生菌絲的長(zhǎng)勢(shì)就受到顯著抑制，當(dāng)Na2SeO3濃度達(dá)50 μg/mL時(shí)，菌絲生長(zhǎng)受到極大抑制，且菌絲顏色變深。

圖2 硒濃度對(duì)猴頭菌H99生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of selenium concentration on the growth of H.erinaceus H99

圖3為猴頭菌NK培養(yǎng)相同時(shí)間后在含0～50 μg/mL Na2SeO3平板上的長(zhǎng)勢(shì)。與空白平板(見圖3A)上生長(zhǎng)情況比較，當(dāng)Na2SeO3含量為2 μg/mL時(shí)，NK菌絲的長(zhǎng)勢(shì)就受到抑制，菌絲半徑顯著減小(見圖3B)，隨著硒濃度的增加，這種抑制作用不斷加強(qiáng)，基內(nèi)菌絲也逐漸變紅，同時(shí)培養(yǎng)基也變紅(見圖3C-H)。

比較以上3種猴頭菌菌種在富硒平板的長(zhǎng)勢(shì)和菌絲半徑，可以看出H2的耐硒能力最強(qiáng)，且在含Na2SeO36 μg/mL的平板上，長(zhǎng)勢(shì)較旺盛，菌絲延伸速度也較快，所以作為后續(xù)富硒培養(yǎng)的菌種。

2.2 猴頭菌液體種子的制備及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌絲干重為縱坐標(biāo)，繪制種子液的生長(zhǎng)曲線(見圖4)。猴頭菌種子液的生長(zhǎng)曲線呈典型的S型，從第7天起進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12天后進(jìn)入平臺(tái)期，因此選取培養(yǎng)10天的種子液作為后續(xù)的發(fā)酵種子。種子液生長(zhǎng)曲線的測(cè)定是為了選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌絲，因?yàn)榇似诰z生長(zhǎng)旺盛，作為液體種子能很快適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，迅速生長(zhǎng)，更易在短時(shí)間內(nèi)獲得較高產(chǎn)量[13]。

圖4 猴頭菌種子液生長(zhǎng)曲線Fig.4 The growth curve of H.erinaceus

2.3 液體培養(yǎng)基成分的優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1.1 碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

不同碳源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)影響結(jié)果見圖5。碳源對(duì)猴頭菌的生長(zhǎng)具有顯著影響。葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉為碳源時(shí)，菌絲體生長(zhǎng)量較大，與其它碳源相比，菌絲干重有極顯著差異(P< 0.01)，因此選取葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉這3種碳源作為后續(xù)正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

圖5 碳源對(duì)猴頭菌菌絲干重的影響Fig.5 Effects of carbon sources on the dry mycelial weight of H.erinaceus注：大、小寫英文字母分別表示α= 0.01，0.05水平上的差異，下同。Note:Upper and lower case letters indicate the difference at the levels of α = 0.01 and 0.05,the same below.

碳源是微生物六大營(yíng)養(yǎng)要素之一，在食用菌的生長(zhǎng)中既是碳源也是能源，碳源是否適宜將直接影響菌絲產(chǎn)量。從圖5可以得知猴頭菌對(duì)單糖葡萄糖、二糖蔗糖、多糖可溶性淀粉利用較好，而對(duì)二糖麥芽糖、乳糖以及多糖玉米淀粉的利用較差，這可能和猴頭菌體內(nèi)利用糖的酶系統(tǒng)有關(guān)，具體的原因還有待進(jìn)一步研究。

2.3.1.2 氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

不同氮源對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響結(jié)果如圖6所示。由圖可知：氮源能顯著影響菌絲產(chǎn)量，慢速利用的氮源有利于猴頭菌的生長(zhǎng)，這是因?yàn)榭焖倮玫?尿素和無(wú)機(jī)氮)不能提供猴頭菌的必需氨基酸，而慢速利用氮源成分復(fù)雜，富含合種氨基酸，能滿足氨基酸異養(yǎng)型食用菌生長(zhǎng)[14]，因此通過優(yōu)化得到的食用菌最佳氮源大都是慢速利用氮源。Ding等[15]研究了金針菇液體發(fā)酵的最佳氮源為黃豆粉，但也有例外，如Tang等[16]優(yōu)化了桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)最適氮源是氯化銨。根據(jù)菌絲干重，選取酵母膏、黃豆粉、蛋白胨3種氮源作為后續(xù)正交試驗(yàn)的水平。

圖6 氮源對(duì)猴頭菌菌絲干重的影響Fig.6 Effects of nitrogen sources on the dry mycelial weight of H.erinaceus

2.3.1.3 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響結(jié)果見圖7。無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲干重的影響達(dá)顯著水平(P< 0.05)，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽分別為CaCl2、FeSO4、MgSO4時(shí)菌絲產(chǎn)量最高，所以作為后續(xù)正交試驗(yàn)的水平。

圖7 無(wú)機(jī)鹽對(duì)猴頭菌菌絲干重的影響Fig.7 Effects of inorganic salts on the dry mycelial weight of H.erinaceus

無(wú)機(jī)鹽對(duì)不同食用菌菌絲生長(zhǎng)的影響較為復(fù)雜，這不僅與食用菌的種類有關(guān)，也與培養(yǎng)基中其它成分有關(guān)，如培養(yǎng)基中含有天然成分，這些天然成分一般含量一定的無(wú)機(jī)鹽，使得無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響變得復(fù)雜。

2.3.1.4 不同維生素B對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

圖8為不同維生素B對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響。

圖8 VB對(duì)猴頭菌菌絲干重的影響Fig.8 Effects of vitamin B on the dry mycelial weight of H.erinaceus

復(fù)合維生素B對(duì)猴頭菌生長(zhǎng)的效果要好于單一維生素B的效果。復(fù)合維生素B中含有VB6的效果最好，但在培養(yǎng)基中只添加VB6效果不及含VB6的復(fù)合維生素B。說(shuō)明猴頭菌利用維生素B族的多條生化途徑不是獨(dú)立的，而是相互作用、相互協(xié)同。因此選VB1+VB6、VB2+VB6、VB1+VB2+VB63種維生素為后續(xù)正交試驗(yàn)的水平。

生長(zhǎng)因子種類繁多，難以將所有生長(zhǎng)因子進(jìn)行篩選，通過查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)VB族維生素對(duì)食用菌菌絲生長(zhǎng)影響較大[15]，因此，本研究選取VB1、VB2、VB6作為候選的生長(zhǎng)因子。

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果(表3)，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4所示。比較各因素R值，可以得知四種因素對(duì)菌絲干重的影響程度，分別為C無(wú)機(jī)鹽> D維生素B>A碳源>B氮源。通過計(jì)算K值，得到最佳碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、維生素分別為：可溶性淀粉，黃豆粉，CaCl2，VB1+VB2+VB6。根據(jù)F值，四個(gè)因素對(duì)菌絲干重的影響程度順序?yàn)镃無(wú)機(jī)鹽> D維生素B>A碳源>B氮源，與根據(jù)R值判斷的結(jié)果一致。對(duì)四個(gè)因素進(jìn)行顯著性分析，得知碳源、無(wú)機(jī)鹽及維生素B對(duì)結(jié)果有顯著影響，氮源則影響不顯著，比較3種氮源，根據(jù)工業(yè)化生產(chǎn)對(duì)成本以及是否易得的要求，選擇黃豆粉為猴頭菌后續(xù)培養(yǎng)用的氮源，與正交試驗(yàn)結(jié)果一致。因此，最優(yōu)培養(yǎng)基組成為可溶性淀粉、黃豆粉、CaCl2、VB1+VB2+VB6。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)方差分析

2.3.3 正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

按4.6%可溶性淀粉、4.6%黃豆粉、0.02%CaCl2、0.018% VB1+VB2+VB6配制培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)重復(fù)9次，菌絲體的平均產(chǎn)量達(dá)1.98 g/100 mL，與正交試驗(yàn)中的最優(yōu)組合A3B2C1D3(第8號(hào)試驗(yàn))產(chǎn)量基本持平，說(shuō)明該優(yōu)化培養(yǎng)基具有穩(wěn)定性。

食用菌液體培養(yǎng)基優(yōu)化的研究大多采用單因素試驗(yàn)得到最佳組分，正交試驗(yàn)[17]或響應(yīng)面法確定最優(yōu)配比[18]，但僅憑單因素試驗(yàn)得到最優(yōu)組分沒有考慮各組分相互作用對(duì)菌絲產(chǎn)量的影響。為了研究各組分對(duì)猴頭菌菌絲干重的影響，本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上增加了正交試驗(yàn)。研究結(jié)果也證明正交試驗(yàn)得到的最佳組分并不完全與單因素試驗(yàn)結(jié)果相符，如單因素中碳源為葡萄糖時(shí)菌絲產(chǎn)量最高，正交試驗(yàn)后得到的最優(yōu)碳源是可溶性淀粉。

2.4 培養(yǎng)基配比的優(yōu)化

2.4.1 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。以菌絲干重(g/100 mL)為因變量y，以可溶性淀粉(X1，%)黃豆粉(X2)、CaCl2(X3)、VB1+VB2+VB6(X4)為自變量，利用SPSS16.0軟件建立線性方程模型，得出如下回歸方程:

表5 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of uniform design test

R=1.000，R2=1.000，F(xiàn)=9.64×106>F0.01(4,3) = 28.71，P< 0.01，說(shuō)明建立的回歸方程具用顯著的線性關(guān)系。對(duì)各因素的偏回歸系數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)(表6)，可以得知各因素對(duì)菌絲體產(chǎn)量存在極顯著影響(P< 0.01)，主次順序?yàn)閄2>X1>X4>X32>X3。

表6 各偏回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 6 Significance test of partial regression coefficients

2.4.2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

采用優(yōu)化的培養(yǎng)基配方進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得菌絲體干重平均達(dá)2.66 g/100 mL，與預(yù)測(cè)值相符，優(yōu)于均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)的所有組合實(shí)驗(yàn)值。

均勻設(shè)計(jì)具有水平多、試驗(yàn)次數(shù)少、能夠建模等優(yōu)點(diǎn)，適用于培養(yǎng)基成分配比的優(yōu)化。前期我們?cè)捎镁鶆蛟O(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)猴頭菌液體培養(yǎng)基的配方進(jìn)行了優(yōu)化，得到的菌絲產(chǎn)量約為2.1 g/100 mL[12]。本研究以前期優(yōu)化的培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，采用正交和均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基的配方進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，培養(yǎng)基組分中碳源、氮源依然是可溶性淀粉和黃豆粉，而無(wú)機(jī)鹽、維生素B則由KH2PO4和VB1變?yōu)镃aCl2和VB1+VB2+VB6，這可能與菌種和培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分濃度有關(guān)，菌絲產(chǎn)量也提高到2.66 g/100 mL，高于其它文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的產(chǎn)量[19]。

2.5 最適硒濃度的確定

不同硒濃度對(duì)菌絲體干重和有機(jī)硒含量的影響見表7。由表7得知：硒濃度對(duì)菌絲體干重影響不顯著，而菌絲體中有機(jī)硒的含量則隨著硒濃度的增加而提高。所以確定發(fā)酵時(shí)Na2SeO3的濃度為12 μg/mL。

表7 硒濃度對(duì)猴頭菌菌絲體干重和有機(jī)硒含量的影響Table 7 Effects of selenium concentration on dry weight and organic selenium content of mycelium

在前期的預(yù)試驗(yàn)中，將硒濃度設(shè)為0、5、15、20、25 μg /mL，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)硒濃度達(dá)到15 μg/mL時(shí)菌絲生長(zhǎng)受到顯著抑制(1.65±0.13 g/100 mL)。因此在正式試驗(yàn)中將濃度梯度設(shè)成0、2、4、6、8、10、12 μg/mL。

由于硒元素不是食用菌菌絲生長(zhǎng)的必須元素，且測(cè)量菌絲中的硒含量費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此，在進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化時(shí)本研究并未考慮硒對(duì)菌絲干重的影響，而是在優(yōu)化后在液體培養(yǎng)基中添加不同濃度的硒，測(cè)量菌絲干重以研究硒濃度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。雖然有研究表明低濃度的硒會(huì)促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)[20]，但本研究結(jié)果并未顯現(xiàn)相似的結(jié)果。雖然硒濃度對(duì)菌絲干重沒有顯著影響，但硒的摻入也許會(huì)使菌絲中的營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生變化，具體結(jié)果還有待進(jìn)一步研究。

從表7可以看出猴頭菌菌絲體中的硒含量大多是有機(jī)硒，說(shuō)明猴頭菌將培養(yǎng)液的無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒的效率很高。由于猴頭菌極高的食用、藥用價(jià)值，所以對(duì)猴頭菌進(jìn)行富硒液體培養(yǎng)有很好的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

3種猴頭菌中H2的耐硒能力最強(qiáng)，菌絲在含6 μg/mL的Na2SeO3固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以作為后續(xù)深層發(fā)酵用的菌種；猴頭菌深層發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：可溶性淀粉5.8%、黃豆粉5.8%、CaCl20.04%、VB1+VB2+VB60.024%，在此培養(yǎng)基中添加12 μg/mL的Na2SeO3，菌絲生長(zhǎng)良好且總硒含量和有機(jī)硒含量最高。綜上所述，深層發(fā)酵猴頭菌菌絲體能獲得較高產(chǎn)量且具有較強(qiáng)的富硒能力，具備開發(fā)和利用的潛力。

致謝：感謝華中農(nóng)業(yè)大學(xué)姜道宏教授、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)趙明文教授為本研究提供菌種。