王佰靈，羅 倫，戈振凱，邱婧然，王 源，黃婉君，郝新才,3，趙永恒,3*

1湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院；2武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點實驗室；3湖北省藥用植物綜合利用工程技術(shù)研究中心，十堰442000

痛風(fēng)是由尿酸排泄障礙和(或)嘌呤代謝紊亂而引起的血尿酸增高的代謝性疾病[1]。痛風(fēng)常引起關(guān)節(jié)的疼痛、畸形和腎臟損害，多并發(fā)于高血壓、糖尿病和心血管等疾病。因飲食結(jié)構(gòu)改變，痛風(fēng)患病率呈現(xiàn)逐年增加趨勢，且發(fā)病率與年齡呈正相關(guān)，80歲以上痛風(fēng)發(fā)病率高達(dá)12%。西醫(yī)治療痛風(fēng)常采用尿酸生成抑制藥物(如別嘌醇)、尿酸排泄促進(jìn)藥物(如來辛奴拉、曲尼司特等)、抗炎藥物(非甾體抗炎藥、秋水仙堿)以及皮質(zhì)激素類等進(jìn)行治療，是以糾正高尿酸血癥，防止痛風(fēng)發(fā)作為目的。但由于不良反應(yīng)明顯，需長期服藥，導(dǎo)致患者順應(yīng)性差，使其應(yīng)用受到限制。

中醫(yī)藥治療痛風(fēng)具有多靶點、療效好、安全性高等特點，在降低尿酸水平、抗炎等方面具有西醫(yī)無法代替的優(yōu)勢。痛風(fēng)，屬中醫(yī)“痹證”范疇，又稱之為“白虎歷節(jié)”、“濕病”等。金錢草具有利濕退黃，利尿通淋等功效，用于濕熱黃疸，石淋，熱淋，小便澀痛等證[2]。金錢草復(fù)方能夠明顯改善痛風(fēng)患者的癥狀，在臨床上取得了較好的療效[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，金錢草可使高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平下降[4]。金錢草總黃酮可使血清肌酐、尿素氮水平以及小鼠腎臟指數(shù)降低，黃嘌呤氧化酶以及腺苷脫氨酶的活性減弱，降低血清TNF-α、COX-2、MCP-1水平，改善腎臟病變以及恢復(fù)胸腺、脾臟免疫器官的萎縮[5]。目前對于金錢草治療痛風(fēng)的藥效成分及作用機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)認(rèn)識。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法從整體上探討金錢草治療痛風(fēng)的潛在藥效成分、作用靶點及信號通路，為金錢草的進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 金錢草活性成分及靶點的收集

以“金錢草”、“Jin Qian Cao”、“Christina Loosestrife”或“Herba Glechomae Longitubae”為檢索詞，檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、TCMID數(shù)據(jù)庫(http://119.3.41.228:8000/tcmid/)、ETCM數(shù)據(jù)庫(http://www.tcmip.cn/ETCM/)、Sym-Map數(shù)據(jù)庫(https://www.symmap.org/search/)、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)，并在PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)、中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫進(jìn)行文獻(xiàn)挖掘，獲取金錢草化學(xué)成分。

以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-like，DL)≥0.18作為篩選條件，從而得到活性成分?；钚猿煞值淖饔冒悬c從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中獲得，把靶點名稱輸入UniProt 數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)，獲得相應(yīng)的人源靶點基因名稱。

1.2 痛風(fēng)相關(guān)靶點的收集

以“gout”、“hyperuricemia”、“chronic gout”、“chronic gouty arthritis”、“gout acute”或“primary gout”為檢索詞，在GeneCards(https://www.genecards.org)、Therapeutic Target Database(TTD)(http://db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(https://www.omim.org)和DisGeNET(https://www.disgenet.org/search)數(shù)據(jù)庫中，檢索痛風(fēng)潛在靶點信息。利用UniProt數(shù)據(jù)庫，設(shè)定物種為“Homo sapiens”，對靶點命名進(jìn)行規(guī)范化處理，得到官方名稱。

1.3 潛在作用靶點的預(yù)測

分別將金錢草活性成分的相關(guān)靶點及痛風(fēng)相關(guān)靶點，輸入韋恩圖在線軟件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，獲取兩者交集，即為金錢草治療痛風(fēng)的潛在作用靶點。

1.4 “活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將活性成分和潛在作用靶點導(dǎo)入Cystoscope 3.7.2軟件進(jìn)行“活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、分析和可視化。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建

將交集靶點輸入到STRING 11.0數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。設(shè)定物種為“Homo sapiens”，最低相互作用閥值設(shè)為高置信度0.7，簡化顯示設(shè)置為“hide disconnected nodes in the network”，其余參數(shù)保持默認(rèn)，獲得蛋白互作關(guān)系，并導(dǎo)出蛋白相互作用關(guān)系的TSV格式的數(shù)據(jù)文件。選取文件中的node1、node2和Combined score三列導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2中，利用“NetworkAnalyzer”工具，設(shè)置節(jié)點顏色與大小反映Degree值大小，邊的粗細(xì)反應(yīng)Combined score的高低，構(gòu)建PPI圖。

1.6 分子對接

利用Vina軟件對主要活性成分及核心靶點進(jìn)行分子對接，以評價網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測的可靠性。首先，準(zhǔn)備配體和受體：使用ChemBioDraw 3D軟件繪制活性成分的三維結(jié)構(gòu)，并以mol2格式保存，使用AutoDock TOOLs保存為pdbqt格式。從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)(http://www.rcsb.org/)下載關(guān)鍵靶點的晶體結(jié)構(gòu)，用PyMOL軟件刪除配體，并用AutoDock TOOLs進(jìn)行加氫和除水等修飾，保存為pdbqt格式。其次，準(zhǔn)備對接和評分參數(shù)，包括網(wǎng)格參數(shù)文件，地圖文件，對接參數(shù)文件。最后，利用Vina軟件進(jìn)行分子對接。

1.7 靶點的基因本體(GO)分析和通路注釋

利用RStudio軟件中CludterProfiler包進(jìn)行GO富集分析和KEGG代謝通路分析，并選取P-value排名靠前的分析結(jié)果以圖的形式展示。

2 結(jié)果

2.1 金錢草治療痛風(fēng)的活性成分及靶點的獲取

從數(shù)據(jù)庫中共檢索到金錢草相關(guān)成分356個。根據(jù)DL≥0.18和OB≥30%的條件篩選，獲取每個活性成分所涉及的潛在靶點，通過UniProt數(shù)據(jù)庫比對校正后去重，共獲得共獲得15個活性成分(見表1)和190個潛在靶點。

表1 金錢草治療痛風(fēng)潛在成分Table 1 Potential active components in the treatment of gout in Lysimachiae Herba

圖1 疾病靶點與活性成分靶點交集的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of active components-disease intersecting targets

2.2 痛風(fēng)相關(guān)靶點的收集

以“gout”、“hyperuricemia”、“chronic gout”、“chronic gouty arthritis”、“gout acute”或“primary gout”為檢索詞，分別從Genecards、TTD、DisGeNET和OMIM中檢索到1 457、17、693和384個與痛風(fēng)相關(guān)靶點，去除重復(fù)的，共有2 236個。將金錢草活性成分的190個靶點與痛風(fēng)的2 236個靶點取交集后，共獲得99個交集靶點。

2.3 “活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將活性成分和相應(yīng)靶點導(dǎo)入Cystoscope 3.7.2軟件即得到“活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)，其中每條邊代表活性成分與作用靶點之間的關(guān)系，橢圓形代表靶點、V形代表藥物成分。在網(wǎng)絡(luò)圖中，共包含114個節(jié)點，其中化合物節(jié)點15個，靶點節(jié)點99個。相互作用的邊432條，靶點與成分的平均度值為3.79。其中，槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、異鼠李素(isorhamnetin)、金合歡素(acacetin)、金圣草(黃)素(chryseriol)、甘草素(liquiritigenin)、圣草酚(eriodictyol)、檉柳黃素(quercetin 4′-methyl ether)等的度值較高，均能與4個以上的靶點相連接，推測這10個成分可能是金錢草發(fā)揮治療痛風(fēng)作用的主要活性成分，體現(xiàn)了金錢草治療痛風(fēng)是通過協(xié)調(diào)多成分、多靶點發(fā)揮作用的。

圖2 活性成分-預(yù)測靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.2 The diagram of active components-targets

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建

將篩選得到的99個共同靶點導(dǎo)入到STRING 11.0數(shù)據(jù)庫并利用Cystoscope 3.7.2軟件構(gòu)建PPI圖(圖3)。圖中圓形節(jié)點表示不同的基因蛋白，節(jié)點連線表示蛋白之間的作用關(guān)系。圓形節(jié)點的顏色和大小表示degree值的大小，節(jié)點越大表示degree值越大，顏色由橙變綠則相應(yīng)的degree值則由大變小，節(jié)點連線的粗細(xì)表示combine score，邊越粗，combine score越高。IL6、AKT1、MAPK8、IL1B、JUN、MAPK1、VEGFA、CXCL8、PTGS2、EGF、MMP9、RELA、CCL2、MYC、ICAM1、MAPK3、IL10、CASP3、STAT1、MAPK14、FOS、HMOX1、CCND1、MMP2、IL2、IL4、APP、PPARG、VCAM1、ESR1、NOS3、CRP、AR、BCL2L1、NFKBIA、CASP8、IFNG、 SERPINE1、IL1A的Degree值均大于中位數(shù)16，對金錢草治療痛風(fēng)具有重要意義，認(rèn)為其為主要靶點。其中靶點IL6、AKT1、MAPK8、IL1B、JUN、MAPK1、VEGFA、CXCL8、PTGS2、EGF、MMP9、RELA、CCL2的Degree值大于中位數(shù)的2倍，表明這些靶點為金錢草治療痛風(fēng)的核心靶點。

圖3 金錢草治療痛風(fēng)潛在作用靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 The PPI network of potential targets related gout of Lysimachiae Herba

2.5 分子對接

PPI中具有較高Degree值的節(jié)點，被認(rèn)為是核心靶點。將“2.4項下”篩選出的13個核心靶點與金錢草中10個主要活性成分進(jìn)行分子對接驗證，對接結(jié)果見表2，其熱圖見圖4。對分子對接來講，結(jié)合能(affinity)越小，表示配體與受體結(jié)合的越牢固，結(jié)合能低于-5.0 kcal/mol表明具有良好的結(jié)合活性。結(jié)果顯示，主要活性成分與核心靶點的結(jié)合能介于-5.2 kcal/mol與-9.9 kcal/mol之間，表明金錢草主要活性成分與核心靶點具有較好的結(jié)合活性，預(yù)測結(jié)果較為可靠。

圖4 分子對接能量熱圖Fig.4 Molecular docking heat-map

表2 主要活性成分與核心靶點的分子對接結(jié)果Table 2 Molecular docking results of active components and core targets

為明確靶點蛋白與所對應(yīng)成分之間的結(jié)合活性，本研究選取4個對接能量較小的結(jié)果進(jìn)行展示。其對接模式見圖5，結(jié)果表明，quercetin與PTGS2中的ARG-377、ASN-376、VAL-229、ASN-538、TYR-374和GLN-374等6個殘基結(jié)合；luteolin與PTGS2中的ARG-377、ASN-376、VAL-229、ASN-538和GLN-374等5個殘基結(jié)合；quercetin 4′-methyl ether與PTGS2中的CYS-36、GLN-136、TYR-131、GLY-45和GLU-466等5個殘基結(jié)合；eriodictyol與PTGS2中的ASP-125、CYS-47、ARG-44和ARG-469等4個殘基結(jié)合，均具有良好的結(jié)合位點。

圖5 金錢草部分活性成分與核心靶點的對接模式圖Fig.5 Molecular docking models of active components acting on core targets of Lysimachiae Herba

2.6 基因本體(GO)分析和通路注釋

根據(jù)P<0.05進(jìn)行GO富集分析，選取P-value排名前15的分析結(jié)果進(jìn)行展示(圖6)。其中，生物過程(biological process)共富集到1 999條，占91.24%，為主要過程，主要涉及有毒物質(zhì)的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞外刺激反應(yīng)、細(xì)菌起源分子反應(yīng)、營養(yǎng)水平的反應(yīng)等。分子功能(molecular function)共富集到137條，占6.25%，主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性、受體調(diào)節(jié)活性、輔因子結(jié)合、受體配體活性等。細(xì)胞組分(cellular component)共富集到55條，占2.51%，主要涉及膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、核染色體部分等。體現(xiàn)了金錢草可能通過調(diào)控多個GO功能來治療痛風(fēng)。

圖6 金錢草潛在作用靶點的GO功能富集分析(P<0.05)Fig.6 The bar and pie diagram of GO enrichment of Lysimachiae Herba(P<0.05)

根據(jù)P<0.01進(jìn)行KEGG通路富集分析，共富集到133條通路。選取P-value 排名前20的通路進(jìn)行做圖(圖7)。圖中，節(jié)點越大代表富集到的靶點數(shù)量越多，節(jié)點的顏色越紅代表P-value越大。因此紅色節(jié)點越大，該信號通路越重要。其中，TNF信號通路等屬于信號傳導(dǎo)通路；糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人類巨細(xì)胞病毒感染、丙型肝炎等屬于人類疾病通路；IL-17信號通路等屬于免疫系統(tǒng)通路。以上KEGG富集分析結(jié)果表明金錢草是通過調(diào)節(jié)不同類型的通路發(fā)揮治療痛風(fēng)作用的。

圖7 金錢草潛在作用靶點的KEGG通路富集分析(P<0.01)Fig.7 Enriched bubble diagram of KEGG signaling pathway of potential targets of Lysimachiae Herba(P<0.01)

3 討論

從“活性成分-預(yù)測靶點”網(wǎng)絡(luò)中可知，槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素、異鼠李素、金合歡素、金圣草(黃)素、甘草素、圣草酚、檉柳黃素可能為金錢草治療痛風(fēng)的主要活性成分。研究表明：黃酮類成分可能為金錢草抗痛風(fēng)活性組分，其中槲皮素可使黃嘌呤氧化酶(XO)的活性降低[8]，并使肝臟和腸道中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9的表達(dá)減少，從而使高尿酸血癥小鼠的血清尿酸(UA)、尿素氮和肌酐水平下降[9]；山奈酚可顯著抑制XO活性，其機(jī)制可能為山奈酚插入XO活性中心位點，競爭性抑制底物的進(jìn)入，進(jìn)而減少XO催化黃嘌呤生成尿酸[10]；異鼠李素可直接抑制肝臟中XO活性，從而抑制UA的產(chǎn)生[11]；木犀草素能通過下調(diào)IL-1β、IL-17、TNF-α、IL-6的水平，以達(dá)到緩解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的踝關(guān)節(jié)腫脹[12]。PPI網(wǎng)絡(luò)分析表明，金錢草可通過降低由于尿酸鹽沉積誘發(fā)的IL6、IL1B、CXCL8、CCL2等炎癥因子和趨化因子的表達(dá)和水平，可以控制炎癥，進(jìn)而改善痛風(fēng)癥狀[13]。金錢草中主要活性成分通過抑尿酸生成、促進(jìn)尿酸排泄和改善炎癥方面發(fā)揮治療痛風(fēng)的作用。

KEGG通路富集分析表明，金錢草治療痛風(fēng)的通路主要涉及TNF信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、人類巨細(xì)胞病毒感染、丙型肝炎、IL-17信號通路等。IL-17是一種主要由輔助性T細(xì)胞及先天性免疫細(xì)胞等分泌的促炎性細(xì)胞因子，在炎癥性疾病和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[14]。關(guān)節(jié)內(nèi)注射尿酸單鈉晶體可刺激Th17細(xì)胞和Th17相關(guān)的炎癥細(xì)胞趨化因子IL-17的產(chǎn)生。IL-17中和抗體能顯著降低白細(xì)胞浸潤和髓過氧化物酶活性，降低IL-1α、IL-1β、IL-16、IL-17的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)[15]。IL-17受體通過激活下游NF-κB、JNK等信號通路，進(jìn)而抑制其他炎癥介質(zhì)的釋放，發(fā)揮顯著的抗炎作用，緩解痛風(fēng)癥狀。TNF主要由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)白細(xì)胞內(nèi)皮活化、細(xì)胞因子和化學(xué)因子擴(kuò)增，并促進(jìn)蛋白水解酶和氧自由基的釋放，促進(jìn)炎癥發(fā)生、發(fā)展[16]。研究發(fā)現(xiàn)，痛風(fēng)患者的血清TNF-α水平升高[17]，TNF的阻斷顯著降低了IL-1、IL-6、IL-8或GMCSF等促炎細(xì)胞因子和趨化因子。TNF作為前炎因子，通過誘導(dǎo)IL-1活化、增強(qiáng)IL-6介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)以及激活NF-κB炎癥信號通路，誘發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病理過程，TNF-α拮抗劑在痛風(fēng)的治療中具有重要作用[18]；在TNF信號通路中，TNF-α可以使NF-κB等上調(diào)，而引起多種效應(yīng)因子增加，達(dá)到白細(xì)胞募集、炎癥級聯(lián)放大等效應(yīng)，以控制炎癥反應(yīng)[19]。尿酸鹽結(jié)晶作為一種內(nèi)源性危險信號相關(guān)分子被細(xì)胞膜表面和Toll樣受體等識別，激活NF-κB，誘導(dǎo)炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-α、IFN-β等)的釋放，促進(jìn)痛風(fēng)性炎癥發(fā)作。研究表明，通過抑制TLR2、TLR4和NF-κB的mRNA和蛋白表達(dá)，可減少血清中TNF-α、IL-1β以及IL-6等炎性因子的合成與釋放[20]。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，預(yù)測金錢草治療痛風(fēng)的活性成分、靶點及其分子機(jī)制，結(jié)果表明金錢草通過多成分、多靶點以及多通路協(xié)同發(fā)揮治療痛風(fēng)的作用。但后續(xù)還需進(jìn)行生物學(xué)實驗，對活性成分、核心靶點進(jìn)行驗證，以明確金錢草治療痛風(fēng)的機(jī)制。