趙艷姣，范 浩，廉 斌

1寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)三科，銀川 750004；2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院乳腺科，北京 100010

乳腺癌(BC)是導(dǎo)致女性癌癥相關(guān)死亡的首要原因?；瘜W(xué)療法是當(dāng)前乳腺癌的主要治療策略之一[1]。曲妥珠單抗是一種重組DNA 衍生的人源化單克隆抗體，通過(guò)靶向Her-2(人表皮生長(zhǎng)因子2)阻斷乳腺癌癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)刺激機(jī)體免疫細(xì)胞殺傷癌細(xì)胞，但是，許多乳腺癌患者對(duì)初始靶向療法沒(méi)有反應(yīng)，或者在隨后的治療中發(fā)生獲得性耐藥和交叉耐藥，導(dǎo)致臨床患者預(yù)后較差，死亡率較高[2,3]。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)用于乳腺癌的新療法，或者有效的增效劑或輔助藥物聯(lián)合治療以提高治愈率。

隨著中醫(yī)藥研究的快速發(fā)展，傳統(tǒng)中藥的抗癌以及增敏作用被廣泛研究，并逐步成為臨床癌癥腫瘤的有效輔助手段[4]。高良姜素(galangin)為傳統(tǒng)中藥高良姜的活性成分，研究發(fā)現(xiàn)高良姜素具有一定抗腫瘤活性，可以保護(hù)機(jī)體免受致癌因素的損傷，同時(shí)抑制腫瘤侵襲和遷移。最近的研究表明，高良姜素可通過(guò)PI3K/Akt通路的激活，防止caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖，侵襲以及遷移，并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[5,6]，還通過(guò)作用于MDM2/p53間接調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，最終抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖[7,8]。但是它是否可以抑制乳腺癌進(jìn)展以及其具體機(jī)制尚未可知。因此，我們的研究目的是應(yīng)用高良姜素治療乳腺癌，并在細(xì)胞核分子層面進(jìn)一步闡明其分子機(jī)制，從而為臨床乳腺癌的治療提供策略。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及試劑

正常乳腺細(xì)胞Hs 578Bst以及人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和SKBR3均購(gòu)自睿凱干細(xì)胞生物科技有限公司(中國(guó))。MCF-7和SKBR3細(xì)胞系使用添加10%胎牛血清(南通伊仕生物技術(shù)股份有限公司，中國(guó))和1%青霉素/鏈霉素(維潤(rùn)賽潤(rùn)生物試劑有限公司，中國(guó))的RPMI 1640(Invitrogen，美國(guó))培養(yǎng)，將細(xì)胞放在37 ℃和5%CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將乳腺癌細(xì)胞用高良姜素(格魯斯特，中國(guó))以終濃度20 μM處理48 h。

高良姜素(博拓生物科技股份有限公司，中國(guó))；曲妥珠單抗(輝瑞，美國(guó))；Akt抑制劑HY-10358(博奧森生物技術(shù)有限公司，中國(guó))；GAPDH、Bcl-2蛋白一抗(B細(xì)胞淋巴瘤2)、Caspase-9一抗、Akt一抗和p-AKT(懋康生物科技有限公司，中國(guó))；p-MDM2一抗、Caspase-3一抗、Alexa Fluor 488偶聯(lián)的兔抗小鼠二抗(利翰生物科技有限公司，中國(guó))。

1.2 異種移植腫瘤模型建立

Balb/cnu/nu裸鼠(上海信帆生物科技有限公司，中國(guó))，飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自由飲食飲水。將乳腺癌細(xì)胞(1×107個(gè)細(xì)胞)懸浮在100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基中，并皮下注射到4～6周齡的雄性Balb/cnu /nu裸鼠的左側(cè)腹中，飼養(yǎng)兩周，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到3 mm×4 mm時(shí)，將接種腫瘤細(xì)胞的小鼠隨機(jī)分為四個(gè)治療組，每組包含十只小鼠，MCF對(duì)照組和SKBR3對(duì)照組使用PBS作為對(duì)照；MCF-BP組和SKBR3-BP組每天腹腔注射200 mg/kg BP。建立SKBR3腫瘤移植模型，隨機(jī)分組，對(duì)照組(control，Con)：生理鹽水；高良姜素組(galangin，Gal)：給予高良姜素(0.75 mg/kg)；曲妥珠單抗組(trastuzumab，Tra)：給予曲妥珠單抗(10 mg/kg)；聯(lián)合用藥組(Gal+Tra)(0.75 mg/kg高良姜素+10 mg/kg曲妥珠單抗)，每天尾靜脈給藥一次，每3天計(jì)算一次小鼠的腫瘤體積：V = 2LS/2，在治療后約4周，頸椎脫臼法處死小鼠，切除腫瘤，稱重后固定在10%福爾馬林中，并進(jìn)行石蠟包埋進(jìn)行以下分析。

1.3 免疫熒光染色

用條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)后，將細(xì)胞固定在4%多聚甲醛中并使用含0.1%Triton X-100的PBS浸潤(rùn)，5%BSA封閉后將細(xì)胞與p-MDM2一抗(1∶1 000)和Caspase-3一抗(1∶1 000)，室溫孵育30 min，然后用Alexa Fluor 488偶聯(lián)的兔抗小鼠(1∶200)或山羊抗兔IgG抗體(1∶200)標(biāo)記。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.4 免疫組織化學(xué)測(cè)定

處死小鼠分離異種移植腫瘤，將新鮮腫瘤組織在福爾馬林中固定48 h，然后使用石蠟包埋制作常規(guī)石蠟切片，用切片機(jī)將其切成2 mm切片后固定在載玻片上，將切片與Ki67(1：1 000)，p-MDM2(1∶1 000)和Caspase3(1∶1 000)抗體一起孵育，在含5%胎牛血清的PBS中4 ℃孵育過(guò)夜。然后根據(jù)制造商的說(shuō)明，通過(guò)染色試劑盒在室溫下用稀釋的鏈霉親和素過(guò)氧化物酶HRP偶聯(lián)物孵育切片，然后使用蘇木精復(fù)染5 min，安裝并在相差顯微鏡下進(jìn)行分析。

1.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

TUNE根據(jù)制造商的方案，使用熒光素原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒，通過(guò)TUNEL進(jìn)行樣品的凋亡分析并通過(guò)蘇木精復(fù)染，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)觀察并記錄TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目。

1.6 細(xì)胞遷移和侵襲

將Transwell小室置于6孔板中，將2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液加入到小室下方的6孔板中，BP或PBS處理48 h后將2×104個(gè)(200 μL)乳腺癌細(xì)胞加入小室內(nèi)，37 °C孵育48 h后，按照試劑商說(shuō)明書(shū)使用結(jié)晶紫/甲醇染色30 min，使用倒置顯微鏡觀察并記錄遷移細(xì)胞數(shù)；將 Matrigel基質(zhì)膠與RPMI1640 培養(yǎng)基(1∶5)混勻后，取100 μL加至小室底部，將Transwell小室放入6孔板中，室溫孵育過(guò)夜，后續(xù)操作與侵襲實(shí)驗(yàn)類似，使用倒置顯微鏡觀察并記錄侵襲細(xì)胞數(shù)量。

1.7 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期

剪切肝臟組織，通過(guò)II型膠原酶消化后1 000 rpm，離心5 min獲得肝細(xì)胞，懸浮在RPMI 1640培養(yǎng)基中，將細(xì)胞懸浮液以1 000 rpm離心5 min以去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，收獲肝單核細(xì)胞(MNC)，并重懸于70%percoll分層液中，從中間相中收集MNC，并在Hank緩沖液中洗滌兩次，用含有5%胎牛血清的培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液至1×106/mL接種于6孔板，分別添加PBS或高良姜素，37 ℃孵育24 h，胰酶消化后1 000 rpm，離心5 min，棄上清液，根據(jù)使用說(shuō)明書(shū)，使用R&D試劑盒，在裝有單細(xì)胞懸液的流式細(xì)胞儀試管中加入抗CD4 FITC和抗CD8 FITC抗體，使用CytomicsTMFC 500 MCL進(jìn)行分析后通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè)，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 蛋白質(zhì)印跡分析

將細(xì)胞分為對(duì)照組(control，Con)、Akt抑制劑組(AktI)、高良姜素組(galangin，Gal)、高良姜素+AKT抑制劑組(Gal+AktI)，分別添加DMAO、SB431542、高良姜素、高良姜素+SB431542，與細(xì)胞共同孵育24 h后，胰酶消化獲取細(xì)胞，根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用T-PER組織蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白，通過(guò)BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并將每孔等量的蛋白質(zhì)上樣至10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上。隨后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，在含0.05%Tween-20(TBS-T)，補(bǔ)充有5%脫脂乳的Tris緩沖鹽水中，室溫下振蕩封閉2 h，然后用TBS-T洗滌3次。將在TBST中稀釋特異性GAPDH(1∶1 000)、Bcl-2蛋白(1∶1 000)、caspase-9(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)FAS(1∶100)、PTEN(1∶100)、P53C(1∶100)、P53N(1∶100)以及P21(1∶100)一抗，與該膜在4 °C下孵育過(guò)夜。隨后，將膜用TBS-T洗滌三次，然后與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的小鼠二抗(1∶500)在室溫下孵育1 h，使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)免疫活性蛋白。使用GE Healthcare ECL Western blotting分析系統(tǒng)檢測(cè)并分析Western蛋白印跡帶。

1.9 實(shí)時(shí)定量PCR分析

按照制造商的方案，使用Trizol試劑從小鼠腎臟中分離出的總RNA，使用SuperScript第一鏈合成試劑盒(RT-PCR)逆轉(zhuǎn)錄cDNA(1 μg)。表1為用于實(shí)時(shí)PCR的引物。在GenBank中檢查所有引物序列，以避免意外的序列同源性。由亨代勞生物科技有限公司(美國(guó))進(jìn)行引物序列的設(shè)計(jì)和合成，引物序列見(jiàn)表1。使用SYBRGreen PCR預(yù)混液在BioRad iCycler iQ檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)部對(duì)照，使用2-Delta Delta C(T)方法對(duì)基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和并計(jì)算倍數(shù)變化。

表1 PCR引物及序列Table 1 PCR primers and sequences

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。使用Graph Pad PRISM(6.0版；Graph Pad Software，美國(guó))，通過(guò)單向方差分析與Dunn最小顯著性差異檢驗(yàn)比較處理過(guò)的細(xì)胞，組織和相應(yīng)的對(duì)照。P<0.05時(shí)，組間差異顯著的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高良姜素抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移、抑制腫瘤生長(zhǎng)

與對(duì)照組相比，使用高良姜素治療后，乳腺癌細(xì)胞MCF-7和SKBR3的細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著下降(圖1A～C)，MCF-7(圖1E)和SKBR3(圖1F)腫瘤異種移植模型小鼠的腫瘤尺寸顯著減小。

圖1 高良姜素在體外抑制乳腺癌細(xì)胞系的增殖、侵襲和遷移，并在體內(nèi)減小腫瘤的大小Fig.1 Galangin inhibits the proliferation,invasion and migration of breast cancer cell lines in vitro,and reduces tumor size in vivo注：與對(duì)照組組相比，*P<0.05；**P <0.01；***P <0.001。A：乳腺癌細(xì)胞系的集落形成；B：遷移中的MCF-7和SKBR3細(xì)胞的代表性圖像，柱形圖顯示細(xì)胞計(jì)數(shù)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；C：具有侵襲性的MCF-7和SKBR3細(xì)胞的代表性圖像，柱形圖顯示細(xì)胞計(jì)數(shù)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；D：異種移植裸鼠模型腫瘤的代表性圖像；E：異種移植裸鼠模型的腫瘤體積。Note:Compared with the control group, *P<0.05;**P <0.01;***P <0.001.A:Colony formation of breast cancer cell lines;B:Representative images of migrating MCF-7 and SKBR3 cells.The column graph shows the statistics of the cell count;C:Representative images of aggressive MCF-7 and SKBR3 cells,with column graph showing statistics of cell counts;D:Representative images of xenograft nude mouse model tumors;E-F:Tumor volume of xenograft nude mouse model.

2.2 高良姜素增強(qiáng)曲妥珠單抗體內(nèi)外抗腫瘤作用

不同濃度的高良姜素或曲妥珠單抗處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力明顯抑制，且呈現(xiàn)劑量依賴性(圖2A、D)，與高良姜素或曲妥珠單抗單獨(dú)處理相比，聯(lián)合用藥明顯抑制細(xì)胞活力，(圖2B、C、E、F)。流式細(xì)胞儀分析表明，與低劑量的高良姜素或曲妥珠單抗處理組相比，高良姜素和曲妥珠單抗聯(lián)合用藥顯著誘導(dǎo)MCF-7和SKBR3細(xì)胞的凋亡(圖2G、H)，證實(shí)高良姜素可顯著增強(qiáng)曲妥珠單抗的體外抗癌活性。

圖2 高良姜素增強(qiáng)曲妥珠單抗的體外抗腫瘤活性Fig.2 Galangin enhances the anti-tumor activity of trastuzumab in vitro注：*P <0.05。A：高良姜素和曲妥珠單抗對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF細(xì)胞的活性抑制曲線；B：高良姜素、曲妥珠單抗以及聯(lián)合用藥對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF細(xì)胞的活性抑制曲線；C：曲妥珠單抗治療或聯(lián)合用藥對(duì)MCF細(xì)胞的活性抑制；D：高良姜素和曲妥珠單抗對(duì)人SKBR3細(xì)胞的活性抑制曲線；E：高良姜素、曲妥珠單抗以及聯(lián)合用藥對(duì)人乳腺癌細(xì)胞SKBR3細(xì)胞的活性抑制曲線；F：曲妥珠單抗治療或聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞SKBR3的活性抑制；G：?jiǎn)为?dú)用曲妥珠單抗或聯(lián)合用藥24 h后的乳腺癌細(xì)胞MCF7細(xì)胞凋亡和定量；H：?jiǎn)为?dú)用曲妥珠單抗或聯(lián)合用藥24 h后的SKBR3細(xì)胞凋亡和定量。Note: *P <0.05.A:Inhibition curve of galangin and trastuzumab on human breast cancer cell MCF cells;B:Inhibition curve of galangin,trastuzumab and their combination on human breast cancer cell MCF cell activity;C:Trastuzumab treatment or combination medication inhibits the activity of MCF cells;D:Activity inhibition curve of galangin and trastuzumab on human SKBR3 cells;E:The activity inhibition curve of galangin,trastuzumab and the combination on human breast cancer cell SKBR3 cells;F:Trastuzumab treatment or combination therapy inhibits the activity of breast cancer cell SKBR3;G:The apoptosis and quantification of breast cancer cell MCF7 cells 24 hours after trastuzumab alone or combination therapy;H:Apoptosis and quantification of SKBR3 cells 24 hours after using trastuzumab alone or in combination.

BC異種移植裸鼠模型結(jié)果顯示，與低劑量高良姜素(0.75 mg/kg)或曲妥珠單抗(10 mg/kg)治療組相比，低劑量高良姜素(0.75 mg/kg)和曲妥珠單抗(10 mg/kg)聯(lián)合用藥處理顯著抑制腫瘤的發(fā)展，且與高劑量曲妥珠單抗(30 mg/kg，圖3A)抑制作用相當(dāng)。此外，與高劑量曲妥珠單抗(30 mg/kg)治療相比，高良姜素與曲妥珠單抗聯(lián)合用藥可顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡(圖3B)，減少ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(圖3C)，增加癌組織中TUNEL陽(yáng)性的數(shù)量(圖3D)，證實(shí)高良姜素可顯著增強(qiáng)曲妥珠單抗的體內(nèi)抗乳腺癌活性。

圖3 高良姜素增強(qiáng)曲妥珠單抗的體內(nèi)抗腫瘤活性Fig.3 Galangin enhances the anti-tumor activity of trastuzumab in vivo注：*P <0.05。A：SKBR3原位移植小鼠模型肝腫瘤的生長(zhǎng)曲線；B：高良姜素和曲妥珠單抗治療后原位肝腫瘤的代表性蘇木精和曙紅(H&E)染色圖像；C、D：在高良姜素和曲妥珠單抗治療的腫瘤中，增殖標(biāo)志物ki67和凋亡標(biāo)志物TUNEL；比例尺：50 μm。Note:*P <0.05.A:The growth curve of liver tumor in SKBR3 orthotopic transplantation mouse model;B:Representative hematoxylin and eosin (H&E) stained image of orthotopic liver tumor after galangin and trastuzumab treatment;C,D:Representative immunohistochemical staining of proliferation marker ki67 and apoptosis marker TUNEL;Scale bar:50 μm.

2.3 磷酸化的AKT在乳腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)

與正常乳腺細(xì)胞和正常癌旁組織樣品相比，乳腺癌細(xì)胞系中AKT磷酸化顯著增加，AKT基因表達(dá)水平明顯提高(圖4A和4B)，且乳腺腫瘤組織中AKT的表達(dá)與小鼠存活率呈負(fù)相關(guān)(圖4E)。

圖4 磷酸化的AKT在乳腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)Fig.4 Phosphorylated AKT is highly expressed in breast cancer cell lines注：與對(duì)照組組相比，*P<0.05；**P <0.01；***P <0.001。A：正常乳腺細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞系中的p-AKT蛋白表達(dá)；B：正常乳腺細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞系中AKT mRNA的表達(dá)；C：正常癌旁組織和腫瘤組織切片的抗AKT IHC染色；D：AKT陽(yáng)性細(xì)胞的百分比；E：通過(guò)AKT表達(dá)與異種移植裸鼠模型的總體存活率。Note:Compared with the control group, *P<0.05;**P <0.01;***P <0.001.A:Expression of p-AKT protein in normal breast cells and breast cancer cell lines;B:AKT mRNA expression in normal breast cells and breast cancer cell lines.;C:Anti-AKT IHC staining of normal adjacent tissues and tumor tissue sections;D:Percentage of AKT positive cells;E:The overall survival rate of nude mice model by AKT expression and xenotransplantation.

2.4 高良姜素抑制AKT活性，下調(diào)p-MDM2表達(dá)

與對(duì)照組相比，使用高良姜素治療后，乳腺癌細(xì)胞MCF-7(圖5A)和SKBR3(圖5B)中AKT表達(dá)水平顯著下調(diào)，MDM2的激活明顯抑制(圖5A)，p-MDM2蛋白表達(dá)以及MDM2 mRNA水平顯著降低(圖6B～D)；與AktI組相比，乳腺癌細(xì)胞MCF-7和SKBR3中AKT表達(dá)水平，MDM2的激活，p-MDM2蛋白表達(dá)以及MDM2 mRNA水平無(wú)顯著差異(圖6B～D)；

圖5 高良姜素通過(guò)抑制AKT活性抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移Fig.5 Galangin inhibits the growth and migration of breast cancer cells by inhibiting AKT activity注：與對(duì)照組組相比，*P<0.05；**P <0.01；***P <0.001。A：MCF-7細(xì)胞中AKT的表達(dá)；B：KBR3細(xì)胞中的AKT表達(dá)；C：MCF-7和SKBR3細(xì)胞中AKT的代表性圖像，條形圖顯示細(xì)胞計(jì)數(shù)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；D：MCF-7和SKBR3細(xì)胞的集落形成。Note:Compared with the Control group, *P<0.05;**P <0.01;***P <0.001.A:AKT expression in MCF-7 cells;B:AKT expression in KBR3 cells;C:Representative images of AKT in MCF-7 and SKBR3 cells,bar graphs showing statistics of cell counts;D:Colony formation of MCF-7 and SKBR3 cells.

圖6 高良姜素通過(guò)p-Mdm2調(diào)節(jié)抑制乳腺癌的生長(zhǎng)Fig.6 Galangin inhibits the growth of breast cancer through p-Mdm2 regulation注：與對(duì)照組組相比，*P<0.05；**P <0.01；***P <0.001。A：MCF-7和SKBR3細(xì)胞的p-Mdm2免疫熒光染色分析(紅色)，細(xì)胞核(藍(lán)色)；B：異種移植腫瘤的p-Mdm2抗體IHC染色；C：乳腺癌細(xì)胞系中p-Mdm2的表達(dá)；D：p-Mdm2的相對(duì)蛋白質(zhì)水平；E：乳腺癌細(xì)胞系中p-Mdm2 mRNA表達(dá)水平。Note:Compared with the Control group, *P<0.05;**P <0.01;***P <0.001.A:p-Mdm2 immunofluorescence staining analysis of MCF-7 and SKBR3 cells (red),nucleus (blue);B:p-Mdm2 antibody IHC staining of xenograft tumors;C:p-Mdm2 in breast cancer cell lines expression;D:Relative protein level of p-Mdm2;E:The expression level of p-Mdm2 mRNA in breast cancer cell lines.

2.5 高良姜素抑制細(xì)胞增殖

與對(duì)照組相比，高良姜素處理后MCF-7和SKBR3細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中p53的活性明顯上調(diào)，p53下游信號(hào)蛋白P21，F(xiàn)AS和PTEN水平明顯增加(圖7A和B)。細(xì)胞周期分析表明(圖7C-E)，與對(duì)照組相比，使用高良姜素處理后，MCF-7和SKBR3細(xì)胞中G0/G1期的細(xì)胞明顯上調(diào)，S期細(xì)胞明顯降低。

圖7 高良姜素通過(guò)抑制乳腺癌細(xì)胞增殖Fig.7 Galangin inhibits breast cancer cell proliferation注：與對(duì)照組組相比，*P<0.05；**P <0.01；***P <0.001。A：乳腺癌細(xì)胞系中增殖相關(guān)的信號(hào)p-P53、P53、P21、FAS和PTEN的表達(dá)；B：p-P53、P53、P21、FAS和PTEN的相對(duì)蛋白水平；C：高良姜素處理后誘導(dǎo)MCF-7和SKBR3細(xì)胞G2/M細(xì)胞周期停滯；D：MCF-7中細(xì)胞周期百分比；E：SKBR3中細(xì)胞周期百分比。Note:Compared with the control group, *P<0.05;**P <0.01;***P <0.001.A:The expression of proliferation-related signals p-P53,P53,P21,FAS and PTEN in breast cancer cell lines;B:Relative protein levels of p-P53,P53,P21,FAS and PTEN;C:Galangin treatment induces G2/M cell cycle arrest in MCF-7 and SKBR3 cells;D:Cell cycle percentage in MCF-7;E:Cell cycle percentage in SKBR3.

2.6 高良姜素促進(jìn)細(xì)胞凋亡

與對(duì)照組相比，高良姜素處理后MCF-7和SKBR3細(xì)胞凋亡明顯增加(圖8A)，抗凋亡因子c-FLIP和Bcl-2顯著下調(diào)，凋亡因子Caspase-9和Caspase-3明顯上調(diào)(圖8B)。免疫熒光分析表明，高良姜素處理組MCF-7(圖8C)和SKBR3(圖8D)細(xì)胞中Caspase-3明顯激活。

圖8 高良姜素通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡改善乳腺癌的進(jìn)展Fig.8 Galangin improves breast cancer progression by promoting apoptosis注：與對(duì)照組組相比，*P<0.05；**P <0.01；***P <0.001。A：通過(guò)流式細(xì)胞儀分析進(jìn)行膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI確定MCF-7和SKBR3細(xì)胞的凋亡；B：乳腺癌細(xì)胞系中凋亡信號(hào)包括c-FLIP、Bcl-2、Bim、Cyto-c、Caspase-9和Caspase-3的表達(dá)；C：免疫熒光染色分析MCF-7細(xì)胞中 Caspase-3(綠色)表達(dá)，細(xì)胞核(藍(lán)色)；D：免疫熒光染色分析SKBR3細(xì)胞中，Caspase-3(綠色)表達(dá)，細(xì)胞核(藍(lán)色)。Note:Compared with the Control group, *P<0.05;**P <0.01;***P <0.001.A:Annexin V-FITC/PI was analyzed by flow cytometry to determine the apoptosis of MCF-7 and SKBR3 cells;B:Apoptotic signals in breast cancer cell lines include c-FLIP,Bcl-2,and Bim,Cyto-c,Caspase-9 and Caspase-3 expression;C:Immunofluorescence staining analysis of Caspase-3 (green) expression in MCF-7 cells,nucleus (blue);D:Immunofluorescence staining analysis of SKBR3 cells,Caspase-3 (green) expression,and nucleus (blue).

3 討論

乳腺癌是最常見(jiàn)的女性惡性腫瘤之一，近年來(lái)，傳統(tǒng)中醫(yī)藥在乳腺癌臨床治療和基礎(chǔ)研究上取得快速進(jìn)展，逐漸成為乳腺癌患者術(shù)后的有效輔助療法[9]。高良姜素由中藥材高良姜提取而來(lái)，主要化學(xué)成分之一黃酮(flavonoids)是一類含15個(gè)碳原子的多元酚化合物，近年來(lái)研究表明高良姜素具有廣泛的藥理活性，包括抗病毒、抗癌、抗致畸、抗突變、抗菌及止痙作用等作用[10,11]，可通過(guò)激活caspase-8/t-Bid線粒體途徑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮抗肝癌作用，并通過(guò)TGF-β受體/Smad信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬。我們的研究結(jié)果提示高良姜素可能是乳腺癌治療的一種新途徑。

PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路廣泛參與各種細(xì)胞過(guò)程，例如細(xì)胞增殖，細(xì)胞分化以及細(xì)胞凋亡，在癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程以及細(xì)胞侵襲，血管生成和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]。先前的研究報(bào)道PI3K/AKT信號(hào)級(jí)聯(lián)可以通過(guò)Bcl-2家族成員或caspase家族蛋白介導(dǎo)細(xì)胞存活，并通過(guò)調(diào)節(jié)caspase活化，以及促凋亡和抗凋亡蛋白變化決定細(xì)胞命運(yùn)[13,14]。我們的結(jié)果表明，高良姜素可以下調(diào)Bcl-2表達(dá)，增加Capsase-9的酶促活性，激活Caspase-3，導(dǎo)致Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)被激活進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡。

PTEN(MMAC1)位于人類染色體10q23.3，編碼403 bp的PTEN蛋白，其蛋白尾區(qū)內(nèi)PDZ 結(jié)構(gòu)域具有調(diào)控PIP3水平和PI3K的去磷酸化，抑制腫瘤細(xì)胞錨定生長(zhǎng)等重要作用，由于在腫瘤發(fā)生過(guò)程中基因缺失或突變而在多種惡性腫瘤中，PTEN的表達(dá)受到抑制[15,16]。研究表明，在包括乳腺癌，卵巢癌，胃癌以及結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤類型中PTEN的失活都會(huì)導(dǎo)致 RTK/PI3K/Akt 信號(hào)的過(guò)度激活，從而驅(qū)動(dòng)腫瘤的發(fā)生[17,18]。作為PIK3/AKT途徑的抑制劑，PTEN可通過(guò)抑制AKT途徑來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，我們的研究結(jié)果表明，在乳腺癌細(xì)胞或腫瘤組織樣本中，AKT的表達(dá)高于對(duì)照組，與對(duì)照組相比，使用高良姜素處理后，AKT表達(dá)顯著降低，同時(shí)高良姜素施用可以顯著上調(diào)PTEN表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)AKT信號(hào)通路抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，抑制腫瘤進(jìn)展。

P53是一種抑癌基因，位于人染色體17p13，編碼53kD的P53蛋白，通過(guò)與細(xì)胞核內(nèi)性異性DNA部位結(jié)合，上調(diào)抑制細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)抑制細(xì)胞增殖相關(guān)基因的啟動(dòng)子，進(jìn)而阻斷細(xì)胞周期[19]，抑制細(xì)胞增殖發(fā)揮抑癌作用。研究表明抑癌基因p53與乳腺增生與乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，調(diào)節(jié)性細(xì)胞周期蛋白p53和p21的表達(dá)變化可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞G2/M期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。MDM2是p53的天然結(jié)合伙伴和抑制劑，參與p53的自調(diào)節(jié)循環(huán)，可以作為泛素連接酶結(jié)合p53活化域誘導(dǎo)p53降解[20]。我們的結(jié)果表明，高良姜素可以通過(guò)上調(diào)p53和p21的表達(dá)調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

總之，我們的研究表明，高良姜素可以明顯抑制MDM2和Bcl-2表達(dá)，并增強(qiáng)p53和Caspases活性，誘導(dǎo)PTEN表達(dá)導(dǎo)致AKT失活，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，侵襲和遷移，抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)增加曲妥珠單抗抗癌活性，具有抑制乳腺癌發(fā)展以及曲妥珠單抗增效作用，因此，高良姜素可能成為乳腺癌的的潛在治療藥物，并未高良姜素用于臨床輔助藥物提供依據(jù)。