趙琳，王學(xué)紅，郜茜，馬雪芹，綻永華，李源化，李春霞，安琪

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院，青海 西寧 810001)

0 引言

胃癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，以胃腺癌(Gastric adenocarcinoma)多見，發(fā)病機制尚不明確，目前認(rèn)為是由遺傳因素、生物因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。遺傳學(xué)是腫瘤的研究基礎(chǔ)，表觀遺傳學(xué)的提出為腫瘤研究帶來了新的思路。表觀遺傳是沒有DNA 序列變化的可隨細(xì)胞分裂而遺傳的基因組修飾或基因表達(dá)調(diào)控，包括DNA 甲基化、組蛋白修飾等，這種基因序列不變而基因表達(dá)改變的作用機制在多細(xì)胞生物的發(fā)育中至關(guān)重要[1]，并能確?；虮磉_(dá)發(fā)生在正確的“時間”和“地點”[2]。DNA 甲基化已經(jīng)成為表觀遺傳學(xué)重要研究內(nèi)容。大量研究揭示了轉(zhuǎn)化生長因子β 誘導(dǎo)基 因(transforming growth factorβ induced gene，TGFβI) 在 腫瘤發(fā)生中的重要作用[3]。多民族聚居的青海是我國胃癌高發(fā)區(qū)[4]，研究發(fā)現(xiàn)藏族胃癌發(fā)病率高于漢族[5]，但具體機制尚不明確。本研究以青海地區(qū)胃癌高發(fā)和多民族聚居為研究背景，應(yīng)用 MethPrimer 在線平臺預(yù)測TGFβI 基因所富含CpG 島(共計15 個CpG 位點) 的序列；利用亞硫酸氫鹽測序(bisulfite sequencing PCR，BSP)法，對青海地區(qū)漢族及藏族胃腺癌患者TGFβI 基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)進行檢測，初步探討TGFβI 基因啟動子甲基化在不同民族間的狀態(tài)及與青海地區(qū)胃腺癌發(fā)生的關(guān)系。

1 對象及方法

1.1 一般資料

選擇2019 年3 月至11 月期間在青海大學(xué)附屬醫(yī)院住院經(jīng)胃鏡及病理首次確診的28 例胃腺癌病例為研究對象，收集患者的一般臨床資料，胃鏡檢查時選取胃癌組織、配對癌旁組織樣本各28 個；漢族患者17 例，藏族患者11 例，不同民族在年齡及性別上無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①由胃鏡并黏膜活檢病理確診的胃腺癌患者；②在青海生活逾20 年者；③均未行放化療；④未患有影響本研究結(jié)果的其他疾患；⑤所有研究對象均簽署知情同意書，且通過青海大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：XHK-2017-SKJT-001)。

1.3 研究方法

①胃癌組織及癌旁組織DNA 提?。喊碋zup 柱式組織基因組DNA 抽屜試劑盒(B518251，上海生工) 說明書步驟進行。②DNA 亞硫酸氫鈉修飾：將各標(biāo)本的DNA 20μL 依照修飾試劑盒說明書進行。③引物設(shè)計、PCR 擴增：應(yīng) 用MethPrimer 在線平臺預(yù)測TGFβ1 基因，序列總長度：2040bp；CpG 島預(yù)測結(jié)果：共發(fā)現(xiàn)1 個CpG 島，長度111 bp，位于1875～ 1985bp。其中包含有15 個CpG 位點。引物由上海生工生物公司設(shè)計，得到PCR 擴增引物序列：上游引物：TAAGGGTTGGGAAAATTGAGTA；下游引物：CCCRAACCAAATTAAATAAACTAC。PCR 反應(yīng)體系模板：DNA(20～50ng/μL)1～2μL。反應(yīng) 條件：在95 ℃下預(yù)變 性3～5 min；在94 ℃下變性30 sec；在55～60 ℃內(nèi)退火25～30 sec；在72 ℃下延伸30～50 sec；2～4 環(huán)節(jié)做35 個循環(huán)；在72 ℃下修復(fù)延伸5～8 min。④電泳檢測條帶：取PCR 產(chǎn)物取5μL 行1%瓊脂糖凝膠電泳(150V，100mA，10～20min)觀察。⑤連接反應(yīng)體系組成：1μL10Ligation Buffer，1μL50%PEG，50ng pUCmT Vector，0.2 pmolPCR Product，xμLH20，2.5U T4 DNA Ligase，F(xiàn)inal Volume 10μL，按試劑盒說明書轉(zhuǎn)化步驟制備感受態(tài)細(xì)胞(SK9307)。⑥ 藍(lán)白斑篩選：將IPTG/X～gal 平板上的白色菌落在含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基過夜(37 ℃)。最后采用3%糖凝膠電泳檢測的方法，對目的片段TA 克隆的菌落行PCR 鑒定。⑦ 測序。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0 分析。兩樣本率的比較、分析采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法，視P＜0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃腺癌患者癌及癌旁組織中TGFβI 基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)

檢測28 例胃腺癌及其配對癌旁組織TGFβI 基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，總克隆數(shù)8385 個CpG 位點(癌組織：4185；癌旁組織：4200)，甲基化陽性克隆總數(shù)771 個(癌組織：478；癌旁組織293)。癌組織中平均甲基化率為11.42%，配對癌旁組織中平均甲基化率為6.98%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)(見表1)。

表1 胃腺癌患者癌及癌旁組織中TGFβI 基因啟動子區(qū)域甲基化率

2.2 兩個民族胃腺癌患者癌組織中TGFβI 基因啟動子區(qū)域甲基化率

漢族癌組織得到甲基化克隆數(shù)299 個，平均甲基化率11.73%；藏族癌組織得到甲基化克隆數(shù)179 個，平均甲基化率10.95%。兩個民族癌組織中TGFβI 基因啟動子甲基化率不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(見表2)。

表2 兩個民族癌組織中TGFβI 基因啟動子區(qū)域甲基化率

2.3 兩個民族癌旁組織中TGFβI 基因啟動子區(qū)域甲基化率

漢族癌旁組織得到甲基化克隆數(shù)208 個，平均甲基化率8.16%；藏族癌旁組織得到甲基化克隆總數(shù)85 個，平均甲基化率5.15%。漢族高于藏族，兩個民族間癌旁組織中TGFβI 基因啟動子區(qū)域甲基化差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(見表3)。

表3 兩個民族癌旁組織中TGFβI 基因啟動子區(qū)域甲基化率

2.4 同一民族癌組織及癌旁組織TGFβI 基因啟動子區(qū)域甲基化率

癌組織及癌旁組織中TGFβI 基因啟動子區(qū)域甲基化率在漢族中分別為11.73%和8.16%，藏族中分別為10.95%和5.15%，癌組織均高于癌旁組織(P＜0.001)(見表4)。

表4 同一民族GC 患者癌組織中及癌旁TGFβ1 甲基化率

3 討論

胃癌的發(fā)生是多因素、多步驟進行性發(fā)展的過程。在正常情況下，胃黏膜上皮細(xì)胞的增值和凋亡之間保持動態(tài)平衡，這種平衡的維持有賴于癌基因、抑癌基因及一些生長因子的共同調(diào)控，當(dāng)癌基因被激活，抑癌基因被抑制，使胃上皮細(xì)胞過度增值又不能啟動凋亡信號，則可能逐漸進展為胃癌。隨著對腫瘤機制研究的不斷深入，人們認(rèn)識到腫瘤基因表達(dá)模式的改變不僅包含遺傳學(xué)改變而且包含了更多的表觀遺傳學(xué)改變，表觀遺傳學(xué)改變在腫瘤的啟動和進展中發(fā)揮著比遺傳學(xué)更為重要的作用[1]。Feinberg 和Vogelstein 發(fā)現(xiàn)[6]，在腫瘤中同時存在兩個互相矛盾的表觀遺傳現(xiàn)象，即全基因組低甲基化和局部高甲基化。有研究認(rèn)為[7-8]，全基因組的低甲基化可以導(dǎo)致ras、c-myc 等原癌基因激活，而DNA 啟動子區(qū)CpG 的高甲基化可以導(dǎo)致p16、APC 等抑癌基因失活，兩者協(xié)同作用，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。TGFβI 基因，最早是從由TGFβI 刺激的A549 肺腺癌細(xì)胞中克隆得到的基因，TGFβI基因存在廣泛，它可由多種類型的細(xì)胞產(chǎn)生，如人膀胱平滑肌(SMC)和成纖維細(xì)胞中表達(dá)[9]，也可以在腎近端小管細(xì)胞中表達(dá)[10]。作為細(xì)胞外基質(zhì)分子之一，最先被關(guān)注的是其調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附和遷移的功能，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)TGFβ1 基因在多種腫瘤中均有表達(dá)，但有關(guān)其作用的報道不一致，有研究認(rèn)為[11]在前列腺癌、腎癌中TGFβI 基因呈現(xiàn)高表達(dá)，并可誘導(dǎo)、增強腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的能力；與其相反的是[12-13]，在肺癌、乳腺癌細(xì)胞中TGFβI 表達(dá)水平明顯下降或表達(dá)缺失。DNA 甲基化，作為最熱門的表觀遺傳學(xué)修飾方式之一，在細(xì)胞生物學(xué)中有著十分重要的作用。DNA 甲基化是在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下，于胞嘧啶堿(5-甲基胞嘧啶)的碳-5 位置加入一個甲基[14]。研究證明基因的表達(dá)結(jié)果會因為DNA 甲基化而導(dǎo)致基因沉默致使該基因的表達(dá)降低，亦或是DNA 甲基化反而導(dǎo)致基因過度表達(dá)[3]，而這些過度表達(dá)的癌基因可促進腫瘤的發(fā)生[15]。因此，頻繁、連鎖性的DNA高甲基化和DNA 低甲基化與腫瘤的產(chǎn)生和進一步發(fā)展可能有著密不可分的關(guān)系。

Han[16]等在對胃癌、肝癌等消化系統(tǒng)腫瘤的研究中用ELISA 法測定胃癌患者血清中TGFβI 水平，得到患者血清TGFβI 水平明顯升高的結(jié)論，考慮異常過量表達(dá)的TGFβI 基因可能來源于腫瘤本身，且TGFβI 基因過表達(dá)導(dǎo)致自發(fā)性腫瘤發(fā)生率增加，提示在胃癌中TGFβI 基因可能扮演的是“癌基因”角色。同時Kiichi Sugimoto[17]等的研究，收集了原發(fā)性胃癌(primarygastriccancers，PGC) 及殘胃癌(remnantgastriccancers，RGC) 的病例樣本，對全基因組DNA 啟動子進行甲基化分析證實了在基因普遍高甲基化組中PGC 的貢獻顯著，表明PGC 的啟動子甲基化狀態(tài)高于RGC(P=0.004)，這也進一步闡明了PGC 與甲基化的關(guān)系。

我們的研究應(yīng)用BSP 法，檢測青海地區(qū)漢族及藏族胃腺癌患者TGFβI 基因啟動子區(qū)域的甲基化情況，探討不同民族間TGFβI 基因甲基化狀態(tài)有無差異及甲基化與青海地區(qū)胃腺癌發(fā)生的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，胃腺癌患者癌組織中TGFβI基因啟動子甲基化程度明顯高于癌旁組織(P＜0.001)，相同民族TGFβI 甲基化率癌組織均高于癌旁組織(P＜0.001)，與Kiichi Sugimoto 的研究結(jié)果一致，提示TGFβI 基因在胃腺癌中可能作為“癌基因”存在，高甲基化會上調(diào)基因表達(dá)，從而參與胃癌的發(fā)生。

青海為少數(shù)民族聚居地，在一項時間跨度近30 年的回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，青海地區(qū)少數(shù)民族胃癌檢出率高于漢族(P＜0.01)[4]。在一項有關(guān)藏族胃癌患者危險因素的研究結(jié)果顯示，高原地區(qū)藏族人群患GC 的危險因素有作息不規(guī)律、喜食干硬食物、高鹽飲食、慢性及反復(fù)發(fā)作的胃部疾病、腫瘤家族史等[18]。藏族群眾因其祖輩長期居住的地理環(huán)境、游牧生活等因素導(dǎo)致了其無論從飲食習(xí)慣、生活習(xí)性都具有獨特的特點，但關(guān)于表觀遺傳學(xué)方面尚無研究報道。為進一步探討基因表觀遺傳學(xué)在民族間的差異，我們進行了漢族及藏族胃腺癌中TGFβI 基因啟動子甲基化狀態(tài)研究，實驗結(jié)果顯示TGFβI 基因啟動子甲基化率漢族為11.73%，藏族為10.95%，統(tǒng)計結(jié)果顯示兩個民族間無差異(P=0.440)。Shah[11]等已證實基因甲基化與腫瘤的局部侵襲呈正相關(guān)，結(jié)合本研究結(jié)果分析，考慮隨著甲基化程度不斷提高，局部組織細(xì)胞惡變程度加重呈現(xiàn)均質(zhì)化，而本實驗兩民族均選用晚期癌組織，故兩塊惡變完全的癌組織間基因甲基化均較為充分，此時差異便不再顯著。而在癌旁組織中，漢族組甲基化率8.16%，藏族組為5.15%，兩個民族間有差異(P＜0.05)，考慮癌旁組織為非癌或部分惡變組織[17]，甲基化程度不完全，結(jié)合Shah[11]等已證實基因甲基化與腫瘤的局部侵襲呈正相關(guān)的報道，推測漢族和藏族在遺傳學(xué)上有不同。本研究為表觀遺傳學(xué)在不同民族間腫瘤發(fā)病的研究提供一定參考數(shù)據(jù)。但本研究樣本數(shù)有限，需進一步擴大樣本研究。

TGFβI 基因啟動子區(qū)高甲基化狀態(tài)可能與青海地區(qū)胃癌高發(fā)有關(guān)，并可能扮演癌基因的角色。漢族和藏族癌組織中TGFβI 基因啟動子高甲基化狀態(tài)無差異，但在癌旁組織中有差異，推測漢族和藏族遺傳學(xué)上有不同，也提示甲基化可能在胃腺癌的早期發(fā)展階段起到更重要的作用，并在不同民族的胃腺癌發(fā)生過程中均扮演腫瘤啟動因子的角色。