周滟晴，劉婷，周婉婷，郭麗丹，趙帥東，汪立平,2,3*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海海洋大學(xué) 食品熱加工工程技術(shù)研究中心，上海，201306) 3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海，201306)

幾千年來(lái)，發(fā)酵食品和飲料一直在人類(lèi)飲食習(xí)慣中占據(jù)重要地位[1]。食醋是一種用谷物釀造的傳統(tǒng)酸性調(diào)味品，歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng)[2]。果醋富含多種小分子有機(jī)酸、多種酚類(lèi)物質(zhì)、多種維生素及礦物元素，在緩解人體疲勞、調(diào)節(jié)人體酸堿平衡、加速體內(nèi)新陳代謝等方面有積極作用[3-4]。目前，中國(guó)銷(xiāo)售的果醋產(chǎn)品多為勾兌果醋飲品，主要包括食醋與果汁勾兌或蘋(píng)果醋與果汁勾兌，風(fēng)味單一，口感不佳。歐美市場(chǎng)上，果醋產(chǎn)品主要是高酸度果醋(發(fā)酵)，用于沙拉和烹飪調(diào)味，或直接飲用(稀釋后)，能平衡血糖和加速代謝。高酸度果醋在運(yùn)輸、貯存及銷(xiāo)售中有較強(qiáng)的天然抑菌效果，具有質(zhì)量穩(wěn)定、風(fēng)味豐富、節(jié)約成本和空間的優(yōu)點(diǎn)。

高品質(zhì)高酸度果醋的關(guān)鍵在于果醋專(zhuān)用醋酸菌(Acetobactersp.)的篩選和發(fā)酵工藝的優(yōu)化。發(fā)酵工藝優(yōu)化相關(guān)的研究較多[5-6]，但關(guān)于篩選果醋專(zhuān)用醋酸菌的研究較少。果汁發(fā)酵生產(chǎn)果酒，果酒氧化生產(chǎn)果醋，其果酒的乙醇含量和發(fā)酵溫度是影響醋酸發(fā)酵的關(guān)鍵因素。乙醇作為醋酸發(fā)酵的底物，為醋酸菌的生長(zhǎng)代謝提供能量，但乙醇具有一定的抑菌作用，在其含量超過(guò)4%(體積分?jǐn)?shù))時(shí)，醋酸菌的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制[7]。溫度是影響細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的重要因素，醋酸菌的最適生長(zhǎng)溫度是30 ℃[8]。溫度過(guò)高使醋酸菌發(fā)酵的基本酶類(lèi)變性，細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致細(xì)胞分散[9]，影響果醋質(zhì)量。我國(guó)工業(yè)釀造食醋的醋酸菌菌株主要有A.pasteurianusAS1.41和滬釀1.01。它們適用于釀造谷物醋，但在果醋釀造時(shí)，不僅產(chǎn)酸能力、耐高溫及耐乙醇能力不足，而且形成的風(fēng)味也不佳[10-11]。因此，篩選出優(yōu)良耐受性的果醋專(zhuān)用高產(chǎn)酸醋酸菌具有重要意義。

本研究以多種類(lèi)型的水果樣品(李子、水蜜桃、芒果、香蕉、枇杷)為研究對(duì)象。首先，通過(guò)鈣平板、醋酸定性試驗(yàn)和產(chǎn)酸定量試驗(yàn)篩選高產(chǎn)醋酸菌株。其次，對(duì)高產(chǎn)醋酸菌株的耐受性(耐乙醇或耐高溫)比較后篩選耐受性優(yōu)良的菌株。為探索耐受性優(yōu)良的菌株在發(fā)酵果醋中的應(yīng)用，以產(chǎn)酸量和菌株生長(zhǎng)情況為指標(biāo)，對(duì)李子醋的發(fā)酵過(guò)程(高乙醇或高溫)進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)李子醋產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。最后，通過(guò)形態(tài)觀察和16S rDNA 對(duì)優(yōu)良菌株進(jìn)行菌種鑒定。本研究從水果中篩選具有耐高濃度乙醇和耐高溫特性的高產(chǎn)酸醋酸菌，并應(yīng)用到李子醋產(chǎn)品中，不僅豐富了果醋醋酸菌種庫(kù)，還為其在果醋產(chǎn)品的應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

李子，購(gòu)于四川眉山、福建寧德、陜西渭南、山東臨沂、云南昭通5個(gè)地區(qū)；水蜜桃、芒果、香蕉、枇杷，上海市農(nóng)工商超市；

Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、通用反向引物1492R(5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′)、DNA Maker(100～2 000 bp)、溴酚藍(lán)、溴化乙錠、PCR mix、ddH2O，生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；A.pasteurianusAS1.41，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F型潔凈工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；JX-05型均質(zhì)機(jī)，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；E200MV型生物顯微鏡，南京尼康江南光學(xué)儀器有限公司；A300型梯度PCR儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；EC3 Imaging System型凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；Bioscreen C MBR全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀，Oy Growth Curves AbLtd。

1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(glucose yeast，GY)(g/L)：葡萄糖10、酵母提取物10、MgSO4·7H2O 0.5，pH 4.5；

液體培養(yǎng)基(GYE)：GY培養(yǎng)基滅菌后，待冷卻到70 ℃左右時(shí)，加入體積分?jǐn)?shù)3%無(wú)水乙醇。

分離培養(yǎng)基(GYECCa2+)：GYE培養(yǎng)基加入18 g/L瓊脂粉，滅菌后冷卻到70 ℃左右時(shí)，加入6 g/L CaCO3和3%(體積分?jǐn)?shù))無(wú)水乙醇混勻；

固體培養(yǎng)基(GYEC)：GY培養(yǎng)基加入18 g/L瓊脂粉，滅菌后待冷卻到70 ℃左右時(shí)，加入3%(體積分?jǐn)?shù))無(wú)水乙醇。

1.4 高產(chǎn)酸醋酸菌的篩選

1.4.1 醋酸菌初篩

稱(chēng)取水果的腐爛部分各(5.00±0.50)g，置于100 mL/250mL GY培養(yǎng)基的錐形瓶中，30 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。富集培養(yǎng)液梯度稀釋后涂布于GYECCa2+培養(yǎng)基，30 ℃靜置培養(yǎng)3 d。挑取透明圈較大的菌落，劃線純化后，-80 ℃保存[30%(體積分?jǐn)?shù))甘油]。

1.4.2 產(chǎn)酸定性實(shí)驗(yàn)[10]

分離菌株活化2次后，接種于50 mL/250 mL GYE培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)液4 000 r/min離心10 min，取5 mL上清液，中和后(0.05 mol/L NaOH溶液)滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%氯化鐵溶液5滴，4 000 r/min離心10 min。取上清液轉(zhuǎn)移至干凈試管中，沸水浴5 min，形成紅褐色絮狀沉淀則初步認(rèn)定為醋酸產(chǎn)生菌。4 000 r/min離心5 min，紅褐色絮狀沉淀分離，加入1 mL濃硫酸，沉淀溶解。加入1 mL無(wú)水乙醇，加熱至沸騰，有乙酸乙酯香味定為醋酸菌。

1.4.3 醋酸菌復(fù)篩[12]

分離菌株活化2次后，接種于GYE培養(yǎng)基，30 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，即得種子液。取3%(體積分?jǐn)?shù))種子液接種于GYE培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)。以第5天的產(chǎn)酸量為指標(biāo)，篩選產(chǎn)酸量高于AS1.41的分離菌株。

取2 mL菌液，加50 mL蒸餾水，滴加2～4滴5 g/L酚酞酒精溶液為指示劑。用0.1 mol/L NaOH進(jìn)行酸堿中和滴定，以消耗的NaOH體積計(jì)算菌株的產(chǎn)酸量,如公式(1)所示：

(1)

式中：V，滴定消耗的NaOH體積，mL；V0，以空白培養(yǎng)基為對(duì)照，滴定消耗的NaOH體積，mL；CNaOH，NaOH溶液濃度，mol/L；V樣，發(fā)酵液樣品體積，mL；60，醋酸相對(duì)分子質(zhì)量。

1.5 醋酸菌菌株性能測(cè)定

1.5.1 產(chǎn)酸能力評(píng)價(jià)

分離菌種活化2次后，接種于50 mL/250 mL GYE培養(yǎng)基的錐形瓶中，30 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d后，即得種子液。取3%(體積分?jǐn)?shù))種子液于100 mL/250 mL GYE培養(yǎng)基的錐形瓶，30 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)15 d，每隔24 h測(cè)1次產(chǎn)酸量，測(cè)定方法同1.4.3。

1.5.2 菌株耐溫性和耐醇性測(cè)定

采用單因素試驗(yàn)考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)[3%(30 ℃)、9%(30 ℃)、11%(30 ℃)]和不同溫度[30 ℃(3%乙醇)、37 ℃(3%乙醇)、42 ℃(3%乙醇)]條件下醋酸菌的OD600，確定具有優(yōu)良耐受能力的菌株。

分離菌株活化2次后，參照婁陽(yáng)等[13]、LIANOU等[14]和LINDQVIST[15]的研究，使用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線儀監(jiān)測(cè)各脅迫條件下的OD600。在Bioscreen配套的100微孔板中，預(yù)先吸取180 μL GYE培養(yǎng)基于孔板，吸取20 μL備用種子液接種至第1孔，以此為第1稀釋度，移液槍吹打混勻后，吸取20 μL第1稀釋度菌液至第2孔，依次稀釋至第3孔中(第3孔吸取 20 μL 菌液舍棄)。以180 μL GYE培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。將空白對(duì)照及樣品液100微孔板放入樣品槽中，設(shè)置為每30 min讀取1次OD600值，監(jiān)測(cè)時(shí)間為84 h。

1.6 優(yōu)良菌株發(fā)酵李子醋的研究

將1.5.2的耐受性優(yōu)良菌株與對(duì)比菌株AS1.41接種到自制李子酒中，分別在適宜環(huán)境[30 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))乙醇)]、高溫環(huán)境[37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))乙醇]和高乙醇環(huán)境[30 ℃、8%(體積分?jǐn)?shù))乙醇]中靜置發(fā)酵12 d，每隔24 h測(cè)產(chǎn)酸量(測(cè)定方法同1.4.3)和OD600，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

感官評(píng)價(jià)：挑選10名經(jīng)過(guò)感官培訓(xùn)的食品專(zhuān)業(yè)人員，參照段珍珍等[16]、趙方圓等[17]制定的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(表1)對(duì)李子醋的色澤、氣味、滋味、體態(tài)進(jìn)行評(píng)分。

表1 李子醋感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of plum vinegar

1.7 菌株的鑒定

通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察菌株形態(tài)[18-19]。

按照Ezup柱式細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取菌株基因組DNA，作為模板。PCR擴(kuò)增的16S rDNA引物為27F和1492R。利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳，確定PCR成功后，送至生物工程(上海)有限公司進(jìn)行16S rDNA基因擴(kuò)增序列測(cè)序。在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)在線數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列檢索，將目標(biāo)菌株和在BLAST程序中檢索到的與同屬其他種的醋酸菌模式菌株作最大同源性比較分析，并利用系統(tǒng)發(fā)育軟件 MEGA 7.01采用鄰位相鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，同時(shí)進(jìn)行重復(fù)次數(shù)為1 000次的 Bootstrap 測(cè)試，最終確定菌株的分類(lèi)地位。

1.8 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，使用Microsoft Excel 2016，Origin 9.0、Graphpad prism8.0 和Mega 7.0.1等軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)酸醋酸菌的篩選

2.1.1 醋酸菌的初篩

本研究取9種水果樣品(5種李子、水蜜桃、芒果、香蕉、枇杷)的腐爛部分富集培養(yǎng)后，通過(guò)鈣圈法，將透明圈大的菌株分離純化，共分離57株菌株。其中，5個(gè)地區(qū)的李子中分離篩選出37株，編號(hào)分別是G-1、H1～H8，C1～C5，PA1～PA5，PB1～PB6，PC1～PC7，PD1～PD5；從水蜜桃中分離篩選出6株，編號(hào)T1～T6；從芒果中分離篩選出5株，編號(hào)M1～M5；從香蕉中分離篩選出5株，編號(hào)Bn1～Bn5；從枇杷中分離篩選出5株，編號(hào)LO1～LO5。通過(guò)產(chǎn)酸定性試驗(yàn)，產(chǎn)生紅褐色沉淀的菌株共42株，可以確定為產(chǎn)醋酸菌株。

2.1.2 醋酸菌的復(fù)篩

醋酸菌的產(chǎn)酸量作為最重要的指標(biāo)之一，一直被研究者重視。李華敏等[20]篩選的A.cibinongensisYT17在6%(體積分?jǐn)?shù))乙醇下生長(zhǎng)，在第8天時(shí)，其產(chǎn)酸量達(dá)到27.91 g/L。孫一帆等[21]篩選的A.pasteurianusSP001的最大產(chǎn)酸量為23.1 g/L。本研究以AS1.41為對(duì)比菌株，與初篩的42株產(chǎn)醋酸菌株進(jìn)行產(chǎn)酸量對(duì)比(圖1)。第5天時(shí)，菌株H4、H5、H7、H8、PB2、PD1、LO2、M1、M3的產(chǎn)酸量高于AS1.41(20.7 g/L)，其產(chǎn)酸量分別為28.68、27.41、25.76、26.76、23.95、27.03、23.53、22.42、21.91 g/L。因此，將這9株菌用于后續(xù)研究。

圖1 產(chǎn)醋酸菌株產(chǎn)酸量對(duì)比Fig.1 Acid production of producing acetic acid strains

2.1.3 醋酸菌產(chǎn)酸曲線

如圖2所示，對(duì)比9株菌和AS1.41的產(chǎn)酸曲線可知，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，醋酸產(chǎn)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，發(fā)酵前6 d醋酸產(chǎn)量迅速增加，6 d后醋酸產(chǎn)量增長(zhǎng)速度減緩，但總體酸含量增加。其中，PD1產(chǎn)酸量增幅較緩，上升趨勢(shì)比較滯后。第8天時(shí)，AS1.41在產(chǎn)酸量達(dá)到最大后出現(xiàn)下降趨勢(shì)。第12天后，PB2產(chǎn)酸量達(dá)到最大，且高于其他菌株，其他菌株的產(chǎn)酸速率和產(chǎn)酸量增加幅度與對(duì)比菌株AS1.41相差不大。14 d后，菌株P(guān)B2 (28.35 g/L)和LO2 (27.30 g/L)優(yōu)于對(duì)比菌株AS1.41 (26.86 g/L)，且比其他菌株有較大優(yōu)勢(shì)。

圖2 高產(chǎn)酸菌株產(chǎn)酸曲線對(duì)比Fig.2 Comparison of acid production curves of high-yielding acid strains

2.2 篩選優(yōu)良耐受性的高產(chǎn)酸醋酸菌

乙醇是醋酸發(fā)酵的底物，底物(乙醇)含量直接影響著產(chǎn)物(乙酸)的含量。但乙醇也使醋酸菌細(xì)胞內(nèi)的酶變性，對(duì)生長(zhǎng)有一定的抑制作用。因此，具有一定耐乙醇特性的高產(chǎn)酸醋酸菌菌株在生產(chǎn)中具有優(yōu)勢(shì)。CHEN等[22]從醋醅中篩選的A.pasteurianusFY-24 和A.pasteurianusDY-5能在含有12%(體積分?jǐn)?shù))乙醇的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)。由圖3可知，乙醇濃度影響醋酸菌的生長(zhǎng)，隨著乙醇濃度的增加，菌株逐漸被抑制，其OD600逐漸減小。由圖3-b、圖3-c、圖3-f、圖3-g和圖3-i可知，PD1，PB2、H7、H8和M3在高乙醇濃度環(huán)境中完全不生長(zhǎng)；由圖3-a、圖3-d和圖3-e可知，LO2、H4和H5對(duì)高濃度乙醇具有一定耐受性，特別是LO2菌株，能在11%(體積分?jǐn)?shù))乙醇環(huán)境中生長(zhǎng)。

醋酸菌是典型的嗜中溫菌，溫度影響醋酸菌的生長(zhǎng)代謝，其生長(zhǎng)的最適溫度為30 ℃[8]。所以，具有耐溫特性的高產(chǎn)酸醋酸菌在有效降低工業(yè)生產(chǎn)(冷卻水)成本，減少環(huán)境污染等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。SAKI等[23]分離出的耐熱醋酸菌(A.pasteurianusSKU1108)被認(rèn)為是最好的耐熱醋酸菌之一，能在38～40 ℃環(huán)境下產(chǎn)生醋酸。PERUMPULI等[24]分離的耐高溫菌株A.pasteurianusSL13E-2、SL13E-3、SL13E-4，40 ℃，4%(體積分?jǐn)?shù))乙醇和37 ℃，6%(體積分?jǐn)?shù))乙醇中產(chǎn)生醋酸。KANCHANARACH等[25]篩選的A.pasteurianusMSU10能在37 ℃生長(zhǎng)和產(chǎn)酸。如圖3所示，9株分離菌株和AS1.41在42 ℃下均未生長(zhǎng)，37 ℃會(huì)明顯抑制醋酸菌的生長(zhǎng)。由圖3-a、圖3-e和圖3-h可知，只有LO2、H5和M1三株菌能在37 ℃下生長(zhǎng)，其中，LO2菌株生長(zhǎng)良好，H5和M1菌株的生長(zhǎng)被抑制。

綜上，60 h后，LO2在各脅迫條件下[37 ℃或11%(體積分?jǐn)?shù))乙醇]，OD600值沒(méi)有明顯區(qū)別(圖3-a)。但脅迫環(huán)境明顯影響了LO2菌株的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了延滯期。因此，高產(chǎn)酸菌株LO2具備良好的耐溫性或耐醇性，是具有應(yīng)用前景的醋酸菌。

2.3 優(yōu)良菌株高溫或高乙醇發(fā)酵李子醋

LO2菌株和AS1.41菌株在適宜環(huán)境[30 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))乙醇]、高乙醇環(huán)境[30 ℃、8%(體積分?jǐn)?shù))乙醇]和高溫環(huán)境[37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))乙醇]中靜置發(fā)酵李子醋，結(jié)果分別如圖4-a～圖4-c所示。由圖4-a可知，2株菌在適宜環(huán)境的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸性能相似，LO2菌株的最大產(chǎn)酸量(53.88 g/L)高于AS1.41菌株(51.64 g/L)。由圖4-b知，高乙醇環(huán)境延長(zhǎng)了醋酸菌的延滯期，抑制了醋酸菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸。8%(體積分?jǐn)?shù))乙醇環(huán)境下，LO2和AS1.41的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸有差距，LO2菌株的最大產(chǎn)酸量(59.80 g/L)高于AS1.41(47.78 g/L)。由圖4-c可知，37 ℃時(shí)，AS1.41被明顯抑制，LO2菌株產(chǎn)酸量(46.64 g/L)是AS1.41(25.92 g/L)的1.79倍。

綜合圖4-a和圖4-b，高乙醇環(huán)境下，LO2的生長(zhǎng)幾乎未被明顯影響，且產(chǎn)酸量提高(由53.88 g/L升高至59.80 g/L)，但AS1.41的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸都略下降。因此，LO2菌株更適合在高乙醇[8%(體積分?jǐn)?shù))乙醇]環(huán)境下釀制李子醋。綜合圖4-a和圖4-c，當(dāng)溫度由30 ℃上升至37 ℃時(shí)，LO2菌株的產(chǎn)酸略降低(由53.88 g/L降至46.64 g/L)，但AS1.41的產(chǎn)酸量下降了近1倍(由51.64 g/L降至25.92 g/L)。因此，LO2菌株是具有工業(yè)應(yīng)用潛力的、具有耐受性的高產(chǎn)酸果醋醋酸菌菌種。

a-LO2；b-PO1；c-PB2；d-H4；e-H5；f-H7；g-H8;h-M1;i-M3圖3 不同溫度或乙醇濃度下高產(chǎn)酸菌株的生長(zhǎng)情況對(duì)比Fig.3 Comparison of the growth of high-yielding acid strain at different temperature or ethanol concentration

a-30 ℃、5%乙醇;b-30 ℃、8%乙醇；c-37 ℃、5%乙醇圖4 不同溫度或乙醇濃度下LO2和AS1.41發(fā)酵李子醋的特性Fig.4 Characteristics of plum vinegar fermented by LO2 and AS1.41 at different temperatures or ethanol concentrations

2.4 李子醋感官評(píng)定

2株菌在3種環(huán)境中釀造李子醋樣品的感官評(píng)價(jià)如圖5所示。6組李子醋樣品評(píng)分相近，均顏色鮮艷、呈桃紅色、有光澤，具有濃郁的果香味和醋香味、香味柔和、無(wú)異味，酸味柔和且爽口，清亮透明，沒(méi)有明顯的懸浮物和沉淀。其中，適宜環(huán)境時(shí)，AS1.41釀造的李子醋的口感協(xié)調(diào)性要略優(yōu)于LO2。而高溫環(huán)境中，LO2釀造的李子醋層次感更多，酸味更厚重。但高乙醇環(huán)境中，AS1.41釀造的李子醋酸味中帶澀味，協(xié)調(diào)性欠佳。因此，高溫或高乙醇環(huán)境下，LO2釀造的李子醋品質(zhì)優(yōu)良、與適宜環(huán)境發(fā)酵的李子醋口感差異性較小，且感官評(píng)分優(yōu)于AS1.41釀造的李子醋。

圖5 不同條件發(fā)酵李子醋的感官評(píng)分Fig.5 Sensory score of plum vinegar fermented under different conditions

2.5 菌株鑒定

2.5.1 菌株菌落形態(tài)

優(yōu)良菌株LO2的菌落形態(tài)如圖6-a和圖6-b所示，乳白色圓形、表面突起、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊、易挑取且產(chǎn)生溶鈣圈。革蘭氏染色如圖6-c，革蘭氏陰性菌，短桿狀或橢圓狀，單生或成對(duì)或成鏈生長(zhǎng)。

a-菌落形態(tài)圖；b-單菌落形態(tài)圖；c-革蘭氏染色圖圖6 LO2菌株形態(tài)特征Fig.6 Features of strain LO2

2.5.2 16S rDNA鑒定

以LO2菌株的基因組DNA為模板，以27F和1492R為引物，PCR擴(kuò)增后，用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，在約1 000～2 000 bp處形成1條清晰的擴(kuò)增條帶。LO2菌株的序列在NCBI網(wǎng)站上經(jīng)過(guò)序列比對(duì)后，采用MEGA 7.0.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行1 000次bootstrap測(cè)試分析。菌株LO2與A.malorumNX-11位于同一族群，相似度達(dá)到100%。最終，將LO2菌株確定為Acetobactersp.LO2(Genbank 序列號(hào) MN602472)。

圖7 菌株LO2的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.7 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequnences of strain LO2注：括號(hào)內(nèi)為菌株的16S rRNA基因序列在GenBank中的登錄號(hào)；標(biāo)尺的數(shù)據(jù)為進(jìn)化距離

3 結(jié)論

本研究以腐爛水果(李子、水蜜桃、芒果、香蕉和枇杷)為篩選樣品，樣品富集后，通過(guò)鈣圈法初篩和產(chǎn)酸定量復(fù)篩后分離得到9株分離菌株。通過(guò)全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線儀對(duì)9株分離菌株在不同乙醇濃度和不同溫度條件下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)菌株LO2在高溫(37 ℃)或高乙醇[11%(體積分?jǐn)?shù))]環(huán)境中的生長(zhǎng)趨勢(shì)與生長(zhǎng)最佳條件[30 ℃，3%(體積分?jǐn)?shù))乙醇)]時(shí)一致。同時(shí)，LO2菌株能在高溫或高乙醇下釀制李子醋，并具有較強(qiáng)且穩(wěn)定的產(chǎn)酸能力，且?guī)缀醪挥绊戯L(fēng)味。經(jīng)形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析，確定LO2為Acetobactersp.LO2。因此，LO2是1株具有優(yōu)良耐受性的果醋專(zhuān)用高產(chǎn)酸醋酸菌，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景，對(duì)推動(dòng)我國(guó)果醋行業(yè)發(fā)展和產(chǎn)品結(jié)構(gòu)調(diào)整有積極影響。