陸觀珠 包玉潔 白玉盤 焉雷 許潔

肝移植是治療終末期肝病的有效方法，但是由于供肝缺乏，治療費(fèi)用昂貴，且患者需要終生服用抗免疫排斥藥物，臨床應(yīng)用受到限制，因此尋求和探索一種新的肝硬化治療技術(shù)成為臨床與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的重要研究熱點(diǎn)之一。人乳牙牙髓干細(xì)胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)具有易獲得，低免疫原性和高分化潛能的優(yōu)點(diǎn)。本研究通過建立小鼠肝硬化模型及SHED治療肝硬化模型，檢測小鼠肝功能、體重、肝臟濕重以及肝臟組織病理學(xué)表現(xiàn)，在動(dòng)物體內(nèi)初步驗(yàn)證SHED對延緩或逆轉(zhuǎn)肝硬化/肝纖維化的安全性及有效性。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

BABL/c小鼠，雄性，6周齡，體質(zhì)量為(16±1)g，SPF級。實(shí)驗(yàn)涉及的所有動(dòng)物處理內(nèi)容均遵從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理和動(dòng)物福利相關(guān)條例和法規(guī)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并由其監(jiān)督支持。

實(shí)驗(yàn)用SHED在GMP條件下培養(yǎng)，細(xì)胞采用0.9% NaCl溶液進(jìn)行重懸，由卡替(上海)生物技術(shù)有限公司提供。

二、小鼠肝硬化模型及干細(xì)胞治療模型建立

15只小鼠飼養(yǎng)于沒有病原菌的環(huán)境下，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中有充足的水分和食物。將15只小鼠隨機(jī)分為A、B、C組，每組5只。肝硬化模型的建立：將A組和B組小鼠腹腔注射10% CCl4(4 μL/g)，2次/周，C組腹腔注射0.9% NaCl溶液(4 μL/g)，2次/周。每2周稱量記錄小鼠體重1次。在肝硬化模型建立的第4周，A組和C組小鼠予尾靜脈注射0.9% NaCl 200 μL，1周1次；同時(shí)將1×106SHED懸浮于200 μL 0.9% NaCl溶液中，混勻，經(jīng)尾靜脈注射入B組小鼠，每周注射1次，共4周。在第9周時(shí)行乙醚麻醉，各組隨機(jī)取3只小鼠眼眶取血，離心分離血清，應(yīng)用小鼠肝功能試劑盒檢測肝功能指標(biāo)。安樂處死小鼠，所有小鼠各取1 cm×1 cm的肝臟組織，4%甲醛固定，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、造模9周后3組小鼠肝功能比較

結(jié)果顯示：A組和B組小鼠的肝功能各項(xiàng)指標(biāo)均較C組小鼠顯著增高。進(jìn)一步比較B組與A組的肝功能情況，發(fā)現(xiàn)B組肝硬化小鼠的肝功能指標(biāo)均較A組有顯著的好轉(zhuǎn)(表1)。由此可見，經(jīng)尾靜脈注射SHED能夠明顯改善肝硬化小鼠的肝功能，對肝細(xì)胞具有一定的修復(fù)作用。

表1 3組小鼠造模9周后的生化指標(biāo)比較(±s)

二、3組小鼠體質(zhì)量和肝臟濕重比較

記錄3組小鼠的生長曲線發(fā)現(xiàn)：A組和B組小鼠的體質(zhì)量增長較C組小鼠嚴(yán)重滯后(P<0.01)，而B組小鼠較A組的體質(zhì)量增長有所恢復(fù)(P<0.01)。第9周處死各組小鼠后，解剖肝臟，肉眼可見C組小鼠的肝臟色澤紅潤，表面光滑，肝葉邊緣銳利，質(zhì)地柔軟。經(jīng)CCl4造模的小鼠肝臟色澤晦暗，表面粗糙，可見大小不等結(jié)節(jié)，肝葉邊緣粗鈍，提示CCl4腹腔注射4周成功建立肝硬化模型。處死時(shí)各組小鼠的體重和肝臟濕重均有顯著差異：A組的小鼠體質(zhì)量(22.86±0.97)g及肝臟濕重 (1.88±0.148)g低于C組的小鼠體質(zhì)量(27.54±1.71)g及肝臟濕重(2.38±0.13)g，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.661、5329，均P<0.01)；而B組的小鼠體質(zhì)量 (25.80±1.02)g及肝臟濕重 (2.16±0.114)g較A組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.347、4.668，P<0.01)。

三、3組小鼠肝組織光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)

第9周處死小鼠后解剖肝臟組織顯示，C組小鼠肝臟切片HE染色可見肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝竇無擴(kuò)張，肝細(xì)胞索規(guī)則，肝細(xì)胞形態(tài)正常(圖1A)；A組小鼠的肝臟失去肝小葉正常結(jié)構(gòu)，有多個(gè)大小不等的假小葉形成，肝竇擴(kuò)張，肝細(xì)胞索排列紊亂，部分細(xì)胞變性、壞死，可見較多炎性細(xì)胞浸潤(圖1B)；B組小鼠肝臟病理可見假小葉數(shù)量較A組減少，肝細(xì)胞排列紊亂明顯好轉(zhuǎn)，組織結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，且肝細(xì)胞變性、壞死有所減輕，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少(圖1C)。由此可見，SHED可部分緩解肝硬化小鼠的肝臟纖維化程度，同時(shí)減輕匯管區(qū)的炎癥反應(yīng)。

A.C組小鼠肝臟；B.A組小鼠的肝臟病理學(xué)表現(xiàn)；C.B組小鼠的肝臟病理學(xué)表現(xiàn)圖1 3組小鼠肝組織光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)(HE，低倍放大)

討 論

既往基礎(chǔ)研究與臨床試驗(yàn)已證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)能夠有效治療肝硬化[1]。健康雄性大鼠MSC可以植入肝臟匯管區(qū)、肝細(xì)胞索，植入細(xì)胞最早見于移植后約7 d，植入的MSC能夠部分代替肝細(xì)胞的功能。張衛(wèi)光等[2]將人胚胎臍帶血分離的MSC植入肝硬化的大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)移植大鼠的體質(zhì)量明顯增加，肝纖維化的程度顯著減輕。

牙髓是牙體組織的一部分，含有結(jié)締組織、間充質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)纖維、血管和淋巴等。人牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells，hDPSC)是一類存在于人牙髓組織(乳牙、恒牙)中具有較強(qiáng)的自我更新和多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞[3]。Gronthos等[4]收集了19～29歲患者的第三磨牙，取出牙髓組織，用酶消化法得到單細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可以自我增殖，其免疫表型與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal stem cells，BMSC)相似，在體外一定條件下可形成礦化結(jié)節(jié)；將細(xì)胞植于免疫缺陷的小鼠體內(nèi)，有牙本質(zhì)樣組織形成，證明其可分化為類成牙本質(zhì)細(xì)胞。牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞是牙髓未分化的外胚間充質(zhì)細(xì)胞，具有高度增殖和克隆能力，在不同誘導(dǎo)劑的作用下，可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)樣細(xì)胞等多種細(xì)胞[5]。Chen等[6]證明，從冷凍保存牙髓組織中提取的間充質(zhì)干細(xì)胞不僅有向肝細(xì)胞樣分化的性能，而且分化后的細(xì)胞具有正常的核型，其功能接近正常肝細(xì)胞。本研究采用SHED治療肝硬化小鼠模型。SHED是起源于神經(jīng)嵴外胚層的多能造血干細(xì)胞，是成體干細(xì)胞家族的重要成員之一，不僅能分化為典型的中胚層細(xì)胞系，如成骨、軟骨等，也能分化為外胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞系，如肝細(xì)胞、胰島素樣細(xì)胞等[7]。

SHED較MSC具有更高的增殖活性和端粒酶活性，以及較低的免疫原性、致瘤性、凋亡性和衰老性，在第10代仍可保持其梭形細(xì)胞形態(tài)，可用于自體干細(xì)胞庫的構(gòu)建[8-10]。除此以外，SHED具有介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)的功能[16],在細(xì)胞免疫及治療炎癥相關(guān)疾病方面有意義[11]。

本研究顯示，經(jīng)尾靜脈注射SHED治療的肝硬化小鼠的體質(zhì)量增長，肝臟濕重均較未治療組肝硬化小鼠有所恢復(fù)；同時(shí)，血清肝功能指標(biāo)及肝臟的纖維化程度及炎癥浸潤程度均有所改善，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了SHED對肝硬化具有一定的治療作用，能夠起到修復(fù)肝細(xì)胞的作用，減輕肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，并能進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)肝硬化小鼠的肝臟纖維化及炎癥程度。與此同時(shí)，本研究在小鼠體內(nèi)驗(yàn)證了SHED的安全性。

結(jié)合既往的SHED相關(guān)研究[12]，歸納了SHED移植療法存在以下優(yōu)點(diǎn)：①與原位移植治療相比，不受供體肝源短缺的限制，且免疫原性低，可有效避免免疫排斥反應(yīng)和免疫抑制劑的使用；②SHED來源豐富，可通過無創(chuàng)技術(shù)便捷取材；③治療效果明顯，可顯著改善肝功能、肝臟纖維化程度；④治療過程操作簡便，創(chuàng)傷小，患者能耐受治療過程。

對于SHED治療肝硬化的分子作用機(jī)制，仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。既往的機(jī)制研究包括：①SHED可分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞[13]，在肝臟損傷微環(huán)境的影響下，SHED在損傷部位進(jìn)行定植、增殖，并分化成為肝細(xì)胞樣細(xì)胞發(fā)揮作用，參與肝臟新生組織的形成；②SHED具備強(qiáng)大的分泌功能，可分泌細(xì)胞外基質(zhì)的有效成分及多種營養(yǎng)因子[14]，從而形成利于組織再生以及微環(huán)境的修復(fù)；③在肝損傷環(huán)境中SHED分泌不同水平的細(xì)胞因子，可能激活肝臟干細(xì)胞，促進(jìn)肝細(xì)胞再生；④SHED通過高表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶降解肝內(nèi)過量沉積的ECM，減輕肝纖維化，激活肝內(nèi)殘存肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞，在一定程度上啟動(dòng)內(nèi)源性肝細(xì)胞增殖過程和Kupffer細(xì)胞分泌MMP降解ECM等[15]；⑤SHED具有免疫調(diào)節(jié)功能，可使小膠質(zhì)細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的表型由促炎性M1型轉(zhuǎn)變成抗炎性M2型，抑制CD4+T淋巴細(xì)胞增殖及其促炎癥細(xì)胞因子的釋放[16]，從而改善肝臟的炎性病變。

本研究初步評估SHED治療小鼠肝硬化模型的安全性及有效性，為今后進(jìn)一步開展床牙髓干細(xì)胞治療肝硬化患者的臨床試驗(yàn)提供可靠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。