陳翠蘭，尹富強

卵巢癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤，是婦科病死率較高的惡性腫瘤之一[1]。據統計,2020年美國卵巢癌新增病例約21 750例，新增死亡病例約13 940例[2]，我國每年新增病例約52 100例，死亡病例約22 500例[3]。卵巢癌臨床治療通常是手術切除后采用一線化療藥物鉑類和紫杉醇進行化療，在初期通常能取得較好的效果。但隨著化療時間的延長，絕大多數卵巢癌患者會對化療藥物產生耐藥，導致患者死亡，這是卵巢癌治療失敗和生存率低下的主要原因。因此，探索和鑒定影響卵巢癌耐藥及預后的因子對于卵巢癌臨床化療方案的制定及臨床預后具有重要指導意義。lncRNA XIST是X染色體非活性特異性轉錄本長非編碼RNA[4]，已證明其在許多腫瘤中異常表達，影響腫瘤細胞增殖和分化，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及化療耐藥密切相關[5]，但目前其與卵巢癌耐藥及預后的相關研究仍較少。鑒此，本研究基于大數據挖掘分析和細胞實驗，旨在探討其與卵巢癌化療耐藥和預后的關聯性，為進一步深入研究其調控卵巢癌耐藥的機制和應用于臨床提供理論依據。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng) 人卵巢癌敏感細胞HeyA8和SKOV3為課題組實驗室保存?？ㄣK耐藥細胞HeyA8-CBP(HeyA8卡鉑耐藥細胞)和SKOV3-CBP(SKOV3卡鉑耐藥細胞)及紫杉醇耐藥細胞HeyA8-R和SKOV3-R由課題組實驗室構建[6]。細胞培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清、100 units/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RIMP 1640完全培養(yǎng)基，于5% CO2，37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每天觀察細胞生長情況以及狀態(tài)，待細胞匯合度達80%左右時采用0.05%胰酶進行消化傳代，3～4 d傳代一次。

1.2細胞總RNA提取及反轉錄 采用TRIzol法提取細胞總RNA，應用NanoDrop分光光度計測定RNA濃度和純度。隨后應用cDNA第一鏈合成試劑盒(Takara,R407A)將總RNA逆轉錄為cDNA，-20 ℃冰箱保存?zhèn)錂z，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測 應用RT-qPCR檢測試劑盒(Takara,R820A)檢測細胞lncRNA XIST的表達水平，以GAPDH作為內參，所用引物序列見表1。檢測結果采用2-ΔΔCt法進行計算分析。

表1 引物序列

1.4大數據挖掘和分析

1.4.1 卵巢癌組織和正常卵巢組織的lncRNA XIST表達水平比較分析 基于Oncomine數據庫[7](https://www.oncomine.org/resource/main.html)，選擇能檢測到lncRNA XIST表達的全部6組卵巢癌表達譜芯片，以P<0.01和fold>2為閾值，選擇漿液性(serous)卵巢癌樣本和正常卵巢組織樣本，最終納入3組芯片(Welsh表達譜芯片、Adib表達譜芯片、Bonome表達譜芯片)進行比較分析。

1.4.2 lncRNA XIST與卵巢癌患者預后及耐藥的相關性分析 基于整合了15組來自GEO和TCGA數據庫的獨立表達譜芯片(GSE23554、GSE63885、GSE3149、GSE15622、GSE14764、GSE27651、GSE65986、GSE51373、GSE18520、GSE26712、GSE9891、GSE19829、GSE26193、GSE30161和TCGA)，共包含1 815例卵巢癌樣本，采用Kaplan-Meier plotter和ROC plotter[8-9]分析lncRNA XIST表達與卵巢癌預后及耐藥的關聯性。在1 815例卵巢癌樣本中，不同的亞組所包括的樣本數不同，以實際分析納入的樣本數為準。Kaplan-Meier plotter預后分析中，lncRNA XIST的高表達和低表達以數據庫自動最佳閾值劃分；樣本選擇上不分層，包括了所有不同分期、分級、手術、化療的樣本，不限于某一亞組。ROC plotter耐藥相關性分析中，以化療后6個月是否復發(fā)作為敏感或耐藥的劃分依據[9]，無其他過濾和分層的限制?；熕幬锏姆纸M上，本研究納入了四組，即所有藥物(any drug)組、鉑類藥物(platin)組、紫杉醇(taxane)組及鉑類藥物+紫杉醇(platin+taxane)組。

2 結果

2.1卵巢癌組織和正常卵巢組織的lncRNA XIST表達水平比較 基于Oncomine數據庫的3個獨立卵巢癌表達譜芯片結果顯示，與正常卵巢組織相比，卵巢癌組織的lncRNA XIST表達水平下調2倍以上。與正常卵巢組織比較，在Welsh表達譜芯片中卵巢癌組織的lncRNA XIST表達水平下調10.653倍(t=5.545,P=0.000)，在Adib表達譜芯片中下調2.041倍(t=3.147,P=0.008)，在Bonome表達譜芯片中下調2.565倍(t=7.055,P=0.000)。見圖1。

圖1 三組獨立卵巢癌表達譜芯片(Welsh、Adib及Bonome)中卵巢癌組織和正常卵巢組織的lncRNA XIST表達水平比較圖

2.2卵巢癌lncRNA XIST表達水平與患者預后的關聯性分析結果 通過Kaplan-Meier plotter分析卵巢癌lncRNA XIST表達水平與患者預后的關聯性，結果顯示，與lncRNA XIST高表達組相比，lncRNA XIST低表達組在總生存期(overall survival，OS)、無進展生存期(progression-free survival，PFS)和進展后生存期(post-progression survival，PPS)方面的預后更差(P<0.05)。見圖2。

圖2 Kaplan-Meier plotter分析結果圖

2.3卵巢癌敏感細胞與耐藥細胞的lncRNA XIST表達水平比較 RT-qPCR檢測結果顯示，與卵巢癌親本細胞HeyA8及SKOV3相比，lncRNA XIST在紫杉醇耐藥細胞HeyA8-R和SKOV3-R及卡鉑耐藥細胞HeyA8-CBP和SKOV3-CBP中均顯著下調(下調倍數>26，P<0.001)。見圖3。

H：HeyA8細胞；H-R：紫杉醇耐藥細胞HeyA8-R；H-C：卡鉑耐藥細胞HeyA8-CBP；S：SKOV3細胞；S-R：紫杉醇耐藥細胞SKOV3-R；S-C：卡鉑耐藥細胞SKOV3-CBP。H vs H-R(t=131.065,P=0.000)，H vs H-C(t=163.410，P=0.000)，S vs S-R(t=30.475，P=0.000)和S vs S-C(t=26.907，P=0.000)

2.4lncRNA XIST預警卵巢癌化療耐藥分析結果 基于GEO和TCGA數據庫數據分析比較lncRNA XIST在卵巢癌耐藥組織(non-responder)和敏感組織(responder)中的表達水平，結果顯示，在對所有藥物、鉑類藥物、紫杉醇以及鉑類藥物+紫杉醇4個分組中，耐藥組織的lncRNA XIST表達水平均顯著低于敏感組織(P<0.05)。ROC plotter分析結果顯示，對于所有藥物耐藥，lncRNA XIST的預警截斷值為8 977；對于鉑類藥物耐藥，lncRNA XIST的預警截斷值為8 977；對于紫杉醇耐藥，lncRNA XIST的預警截斷值為8 245；對于鉑類藥物+紫杉醇耐藥，lncRNA XIST的預警截斷值為8 245。見圖4。

圖4 lncRNA XIST預警卵巢癌化療耐藥分析結果圖

3 討論

3.1lncRNA是一類長度>200 bp的非編碼RNA，具有豐度高、物種保守性低、組織表達特異和作用方式多樣等特點，被認為是生命活動中的重要調控因子，可通過直接或間接作用于靶基因、調節(jié)組蛋白進行修飾和染色質重塑，也可作為內源競爭性RNA等方式發(fā)揮作用[10]。進而通過調控藥物外排、DNA損傷修復、細胞凋亡、誘導藥物靶標突變等過程調節(jié)腫瘤耐藥并影響患者預后[11]。如lncRNA GAS5[12-13]、lncRNA TP73-AS1[14]、lncRNA CCAT1和lncRNA MALAT1[15]等，均已證明在卵巢癌進展及耐藥調控中發(fā)揮著重要作用，并對卵巢癌患者預后產生影響。lncRNA GAS5是細胞凋亡和生長抑制的關鍵因子，通常作為分子誘餌阻止糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor，GR)和糖皮質激素反應元件(glucocorticoid response element，GRE)結合，調控基因表達，進而影響細胞周期和凋亡[12]。lncRNA TP73-AS1能夠通過影響Zeste基因增強子同源物基因2(enhancer of Zeste homolog 2,EZH2)和組蛋白第27位氨基酸甲基化(H3K27me3)與P21啟動子區(qū)的結合，沉默P21基因的表達，促進上皮性卵巢癌細胞的增殖和遷移侵襲能力，抑制細胞凋亡，進而調控上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)的進展[16]。lncRNA CCAT1能夠靶向多個mircoRNA，通過CCAT1-miR-152/miR-130b/ADAM17/Wnt1/STAT1/ZEB1軸和CCAT1/miR-490-3p/TGFβR1軸對卵巢癌發(fā)揮調控作用[17]。lncRNA MALAT1在卵巢癌中上調表達可使PHF19沉默進而抑制細胞增殖，通過靶向mircoRNA-211來阻滯細胞周期增加細胞凋亡，進而抑制卵巢腫瘤細胞生長遷移，參與卵巢癌調控[18]。

3.2本研究結果顯示，lncRNA XIST與腫瘤進展及預后具有顯著關聯。Kobayashi等[19]研究顯示，lncRNA XIST的表達與接受鉑類藥物放化療的宮頸鱗狀細胞癌患者的OS相關，lncRNA XIST高表達預示更好的OS。在卵巢癌中，與卵巢上皮細胞相比，lncRNA XIST在50%的卵巢癌細胞中表達缺失[20],而其上調表達具有顯著的抗腫瘤活性，可能通過吸附miR-214-3p而發(fā)揮作用[21]。本研究通過表達譜芯片數據的挖掘與分析，結果顯示lncRNA XIST在卵巢癌組織中顯著下調表達，且lncRNA XIST低表達與卵巢癌患者不良預后顯著相關，提示卵巢癌lncRNA XIST低表達有作為預后標志物應用于臨床的潛在價值。

3.3另外，本研究結果顯示lncRNA XIST與腫瘤耐藥相關。在直腸癌中，與高表達組相比，lncRNA XIST低表達組患者對5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)化療的耐藥率更高[22]，提示lncRNA XIST低表達可能與腫瘤耐藥調控相關。而與原發(fā)性卵巢癌相比，lncRNA XIST在復發(fā)性腫瘤中下調至少6.7倍以上，lncRNA XIST低表達與紫杉醇耐藥正相關[23]。與上述研究結果相似，本研究結果顯示，lncRNA XIST在紫杉醇耐藥細胞HeyA8-R和SKOV3-R及卡鉑耐藥細胞HeyA8-CBP和SKOV3-CBP中均顯著下調，且基于卵巢癌的數據庫分析結果表明，lncRNA XIST在卵巢癌耐藥組織中顯著下調，且具有預警卵巢癌對鉑類、紫杉醇以及其他藥物耐藥發(fā)生的價值，對臨床治療用藥具有一定的指導價值。但值得注意的是，也有研究[24]表明，敲低lncRNA XIST表達能夠通過抑制細胞自噬來增強非小細胞肺癌細胞對化療藥物的敏感性，從而抑制細胞耐藥。上述兩種不同結論可能與不同的腫瘤類型有關，在不同的腫瘤中，lncRNA XIST扮演著癌基因或抑癌基因的不同角色[4]。

綜上所述，lncRNA XIST在卵巢癌卡鉑/紫杉醇耐藥細胞、耐藥卵巢癌組織及卵巢癌組織中均顯著下調，且其低表達具有預警鉑類和紫杉醇等化療藥物的耐藥，并與卵巢癌患者的不良預后顯著相關，具有較好的臨床潛在應用價值。