楊詩云，楊金月，陸 荃，和培春，李廣裕，梁季鴻

尿酸是嘌呤代謝的最終產(chǎn)物，正常情況下，機(jī)體內(nèi)的尿酸處于一種動(dòng)態(tài)的平衡狀態(tài)，對機(jī)體起抗氧化的作用，當(dāng)尿酸生成增多和(或)排泄減少時(shí)，這種動(dòng)態(tài)平衡就會(huì)被打破，機(jī)體內(nèi)血尿酸水平升高[1]，形成高尿酸血癥。勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)是由多種因素引起的男科常見疾病，近年來發(fā)病率逐步上升。影響陰莖勃起的因素涉及神經(jīng)、心理、血管功能、陰莖海綿體組織等方面[2]。一氧化氮(nitric oxide,NO)是陰莖勃起中主要的神經(jīng)遞質(zhì)，NO的減少可能導(dǎo)致ED的發(fā)生。此外，雄激素可通過增強(qiáng)性欲、性喚起等促進(jìn)陰莖勃起，在維持陰莖勃起組織結(jié)構(gòu)方面起重要作用，雄激素水平低下也可導(dǎo)致ED的發(fā)生[3]。研究[4-5]發(fā)現(xiàn)高尿酸可誘發(fā)男性ED，降低睪酮等性激素水平，導(dǎo)致男性性功能減退。本實(shí)驗(yàn)通過建立高尿酸血癥小鼠模型，探討高尿酸對小鼠陰莖勃起功能、血清睪酮、陰莖組織NO濃度等的影響，并探討其可能的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級昆明(KM)小鼠36只，鼠齡10周，體重36～45 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[許可證號:SCXK桂2020-0003]。自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25 ℃。光照條件：白天光照12 h/夜晚避光12 h，交替進(jìn)行。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)前經(jīng)交配實(shí)驗(yàn)證實(shí)小鼠均有正常的性功能，即在昏暗的燈光照明條件下，將雄鼠與發(fā)情雌鼠(由生殖方向?qū)嶒?yàn)課題組提供)合籠，雄性小鼠出現(xiàn)騎跨、插入、抖動(dòng)等動(dòng)作，并觀察到陰莖頭及陰莖體露出則認(rèn)為有正常的性功能。

1.2試劑及儀器 氧嗪酸鉀(美侖生物)，阿樸嗎啡(Sigma公司)，尿酸試劑盒(南京建成)，小鼠睪酮(T)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(武漢華美)，NO測定試劑盒(南京建成)，紫外分光光度計(jì)(上海元析)，微孔板恒溫振蕩器，Thermo酶標(biāo)儀，Nikon Eclipse Ci-L顯微鏡等。

1.3高尿酸動(dòng)物模型的構(gòu)建 將小鼠稱重后采用配對設(shè)計(jì)方法隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組18只。參考楊桂梅等[6]的研究方法建立高尿酸模型。實(shí)驗(yàn)組給予氧嗪酸鉀(1.5 g/kg)，溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，按0.1 ml/10 g灌胃，1次/d，共30 d。對照組給予0.9%生理鹽水(0.1 ml/10 g)灌胃，1次/d，共30 d。每組動(dòng)物自由飲水、普通飲食。實(shí)驗(yàn)過程中兩組各有1只小鼠死亡。

1.4陰莖勃起功能測定 于藥物干預(yù)30 d后參考Heaton等[7]的研究方法進(jìn)行陰莖勃起功能測定。將小鼠稱重后放入觀察籠，適應(yīng)環(huán)境10 min，保持室內(nèi)安靜，燈光調(diào)暗至僅夠觀察即可。阿樸嗎啡10 mg+維生素C 50 mg加入到250 ml生理鹽水中，阿樸嗎啡終濃度為40 μg/ml，按100 μg/kg于小鼠頸部皮膚松軟處行皮下注射，注射完畢后立即將小鼠放入觀察籠中觀察30 min，記錄陰莖勃起次數(shù)。以陰莖頭充血及末端陰莖體出現(xiàn)記為陰莖勃起1次。勃起率=有勃起小鼠只數(shù)/總小鼠只數(shù)×100%。

1.5血清尿酸及睪酮水平測定 灌胃2周后，斷尾取血進(jìn)行第1次尿酸水平測定。于陰莖勃起功能測定實(shí)驗(yàn)(方法1.4)結(jié)束2 d后，配制4%水合氯醛麻醉小鼠，摘眼球采血，采血后室溫靜置1 h，常溫離心10 min(3 000 r/min)，取上層血清，按試劑盒檢測方法檢測兩組小鼠血清睪酮及第2次血清尿酸水平。

1.6陰莖海綿體組織NO水平測定 摘眼球取血后，頸椎脫臼法處死小鼠，切開下腹部取出陰莖組織中后段保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明書配制相應(yīng)試劑，取適量陰莖組織(約10 mg)，加入冰上預(yù)冷的生理鹽水100 μl，手動(dòng)研磨。將組織勻漿離心10 min，取上清顯色，雙蒸水調(diào)零，在波長550 nm下測定各標(biāo)本的吸光度值。

1.7睪丸組織蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色 切開小鼠下腹部，順著精索用鑷子拉出一側(cè)睪丸，迅速置于4%多聚甲醛溶液中固定，后經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片行HE染色，光鏡下觀察小鼠睪丸組織。

2 結(jié)果

2.1兩組小鼠干預(yù)2周末血清尿酸水平比較 在藥物干預(yù)2周末，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清尿酸水平較對照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(253.52±20.56)mg/L vs(197.72±16.89)mg/L;t=8.647,P=0.000]，提示高尿酸小鼠模型構(gòu)建成功。

2.2兩組勃起功能比較 在注射阿樸嗎啡后，實(shí)驗(yàn)組小鼠的勃起次數(shù)少于對照組，且勃起率更低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組勃起功能比較[M(P25，P75)]

2.3兩組血清尿酸、睪酮及陰莖組織NO水平比較 在藥物干預(yù)30 d后，實(shí)驗(yàn)組血清尿酸水平高于對照組，血清睪酮和陰莖組織NO水平低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組血清尿酸、睪酮及陰莖組織NO水平比較

2.4兩組睪丸組織切片所見 光鏡下見對照組小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞成群分布，胞體大，呈梭型或多邊形，細(xì)胞核呈圓形，染色質(zhì)較淡，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量豐富。實(shí)驗(yàn)組小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞體積縮小，核固縮，染色質(zhì)濃集、深染，胞內(nèi)脂質(zhì)含量減少。見圖1～2。

圖1 對照組睪丸組織HE染色所見(×400)圖2 實(shí)驗(yàn)組睪丸組織HE染色所見(×400)

2.5血清尿酸水平與睪酮及勃起功能的相關(guān)性分析結(jié)果 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，兩組小鼠終末血清尿酸水平與睪酮、勃起功能(勃起次數(shù))呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 血清尿酸水平與睪酮及勃起功能的相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

3.1ED是指陰莖持續(xù)或反復(fù)不能達(dá)到或維持足夠的勃起以完成滿意的性生活。陰莖勃起是在神經(jīng)、內(nèi)分泌等多種因素調(diào)節(jié)下的一種復(fù)雜的活動(dòng)，該活動(dòng)需要陰莖海綿體、神經(jīng)、血管、內(nèi)分泌及心理等因素的密切協(xié)同[8]。NO是陰莖勃起過程中關(guān)鍵的神經(jīng)遞質(zhì)，當(dāng)性刺激出現(xiàn)時(shí)副交感神經(jīng)通路的激活促使海綿狀神經(jīng)和內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO[9]。NO可激活胞漿內(nèi)的可溶性鳥甘酸環(huán)化酶，活化后的鳥甘酸環(huán)化酶催化5-鳥苷三磷酸(guanosine triphosphate,GTP)轉(zhuǎn)化為環(huán)狀鳥苷單磷酸(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)，進(jìn)而激活蛋白激酶G，引起細(xì)胞膜上的鈣離子通道開放，鈣離子外流，胞內(nèi)鈣離子濃度降低，促使平滑肌以及陰莖海綿體平滑肌松弛，白膜下靜脈回流受阻，最終使陰莖勃起。任何引起陰莖海綿體中NO減少的因素都可能導(dǎo)致ED的發(fā)生。另一方面，在性欲的維持上，雄激素扮演著重要角色。雄激素可以誘導(dǎo)性欲和陰莖的自發(fā)勃起，能夠調(diào)節(jié)陰莖海綿體中的血液灌注及回流過程。有研究[10]表明，睪酮對維持陰莖勃起的生理和解剖基礎(chǔ)具有重要作用，而性腺功能減退和睪酮水平降低是導(dǎo)致ED發(fā)生的重要因素之一。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥與高血壓、腎臟疾病、糖尿病、心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，同時(shí)高尿酸血癥也與肥胖、血脂代謝等關(guān)系密切[11-12]，而ED已經(jīng)證實(shí)與心血管疾病、糖尿病、高脂血癥等的發(fā)生具有關(guān)聯(lián)。

3.2尿酸是機(jī)體嘌呤代謝的產(chǎn)物，生理濃度下，尿酸是一種抗氧化劑，能清除自由基，抑制活性氧簇引發(fā)的氧化應(yīng)激損傷，有抗氧化、抗DNA損傷的作用，而高濃度的尿酸則表現(xiàn)為促氧化特性。高尿酸對機(jī)體NO的表達(dá)水平有著重要的影響。Gersch等[13]研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥時(shí)體內(nèi)氧自由基增多，促進(jìn)氧自由基與NO反應(yīng)增強(qiáng)，從而消耗了大量的NO，導(dǎo)致NO含量下降。高尿酸血癥亦能抑制血管內(nèi)皮舒張和NO的釋放[14]。夏莉等[15]的研究也發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥可以抑制大鼠陰莖海綿體NO的水平。本研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組小鼠陰莖組織中NO水平較對照組顯著降低。這說明高尿酸血癥能影響機(jī)體NO的表達(dá)，降低小鼠陰莖海綿體組織中NO的含量。

3.3高尿酸與血清睪酮之間也存在著密切關(guān)聯(lián)。徐靜嫻[16]通過對比發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥組血清總睪酮水平低于正常尿酸組，且尿酸與總睪酮水平呈負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比對照組，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清睪酮水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。另外，尿酸與睪酮、勃起功能(勃起次數(shù))均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。提示高尿酸可引起睪酮水平降低，陰莖勃起功能下降。

3.4睪丸是合成和分泌雄激素的主要組織，睪丸間質(zhì)細(xì)胞是睪丸組織中合成雄激素的主要細(xì)胞[17]，人體超過90%的血漿睪酮是由間質(zhì)細(xì)胞貯存和合成的膽固醇生成的[18]。雄激素睪酮可以促進(jìn)精子的發(fā)生和雄性生殖器官的發(fā)育和成熟，并維持其正常生理功能[19]。本實(shí)驗(yàn)睪丸組織經(jīng)HE染色在光鏡下可見，對照組小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞成群分布，胞體大，呈梭型或多邊形，細(xì)胞核呈圓形，染色質(zhì)較淡，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量豐富；而實(shí)驗(yàn)組小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞體積縮小，核固縮，染色質(zhì)濃集、深染，胞內(nèi)脂質(zhì)含量減少。這與陳錫文[20]和趙茜[21]等在糖尿病對大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和功能變化的研究中，糖尿病組睪丸間質(zhì)細(xì)胞的病理改變相似。而這些改變通過電鏡下觀察糖尿病大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞得到證實(shí)，間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)線粒體腫脹、變形及滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量的減少，提示間質(zhì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能的損傷。這說明高尿酸血癥和糖尿病都可以通過某些機(jī)制影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)線粒體等細(xì)胞器合成和分泌睪酮的能力受損。此外，高尿酸對于內(nèi)分泌垂體性腺軸的影響有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，血清尿酸對陰莖勃起功能及睪酮水平有著重要影響。高尿酸通過降低陰莖組織NO水平及血清睪酮含量影響陰莖的勃起功能，而血清睪酮的水平降低可能與高尿酸導(dǎo)致的睪丸間質(zhì)細(xì)胞損傷相關(guān)。