李泓町，高麗萍

(1. 重慶市中醫(yī)院 肝病科，重慶 400021；2.重慶市中醫(yī)院 腫瘤科，重慶 400021)

肝癌是發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，包括原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌2種，較常見的是原發(fā)性肝癌。接受手術(shù)治療的肝癌患者通常具有高復(fù)發(fā)率，這可能是導(dǎo)致患者五年總體生存率較低的原因之一[1]。因此，需要充分了解肝癌發(fā)生和進(jìn)展的分子機制，以找到新的靶點來改善肝癌的臨床治療效果。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在肝癌發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[2-3]，這為肝癌的治療提供了新的見解。一些研究發(fā)現(xiàn)，miR-30e-5p在許多人類腫瘤中表達(dá)下調(diào)，包括結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌等[4-6]。一項研究對與原發(fā)性肝癌早期診斷相關(guān)的miRNA進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)miR-30e-5p在肝癌中呈低表達(dá)[7]。然而，miR-30e-5p在人類肝癌中的生物學(xué)作用及機制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中自噬相關(guān)基因5(autophagy-related gene 5，ATG5)的表達(dá)水平明顯升高，與肝癌的發(fā)病及進(jìn)展密切相關(guān)[8-9]。本研究前期通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-30e-5p與ATG5基因3＇非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)存在靶向結(jié)合位點，提示miR-30e-5p可能通過調(diào)控ATG5基因的表達(dá)影響細(xì)胞生物學(xué)行為。因此，本研究探討miR-30e-5p對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的影響及其可能的分子機制，以期為肝癌的診斷和治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人正常肝細(xì)胞HL-7702及人肝癌細(xì)胞MHCC97H、Huh7、HCCLM3購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；FBS、脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購于Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)液購于Hyclone公司；青霉素-鏈霉素雙抗購于北京雷根生物技術(shù)有限公司；MTT購于Sigma公司；miR-30e-5p mimics及對照mimics-NC購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒、SYBR Premix Ex Taq檢測試劑盒購于武漢優(yōu)博生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于Promega公司；含野生型ATG5基因3＇UTR序列和突變型ATG5基因3＇UTR序列的pCHECK2-ATG5-3＇UTR-Wt(ATG5-Wt)以及pCHECK2-ATG5-3＇UTR-Mut(ATG5-Mut)的熒光素酶報告基因表達(dá)載體構(gòu)建由生工生物工程(上海)有限公司完成；試驗所用引物由華大基因科技有限公司合成；Annexin Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于BD公司；除抗體外的Western blotting檢測所需試劑均購于碧云天生物技術(shù)研究所；ATG5、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3， LC3)、Ras相關(guān)結(jié)合蛋白7(Ras-associated binding protein 7, RAB7)、p62抗體及二抗均購于CST公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人正常肝細(xì)胞HL-7702及人肝癌細(xì)胞MHCC97H、Huh7、HCCLM3常規(guī)復(fù)蘇后，培養(yǎng)在含10%FBS及1%青霉素-鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)液中，放置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，及時觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，2 d更換1次新鮮培養(yǎng)液，2～3 d傳代1次，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)試驗。

1.2.2 細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 將處于對數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞MHCC97H隨機分為3組：對照組、miR-30e-5p轉(zhuǎn)染(miR-30e-5p)組和轉(zhuǎn)染對照(mimics-NC)組。將各組MHCC97H細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前1 d以2×103個/孔接種到6孔板中，放置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長、匯合度達(dá)50%左右時，參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書中的步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將miR-30e-5p組MHCC97H細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30e-5p mimics，mimics-NC組MHCC97H細(xì)胞轉(zhuǎn)染對照mimics-NC，對照組MHCC97H細(xì)胞不做轉(zhuǎn)染處理。轉(zhuǎn)染6 h后將各組MHCC97H細(xì)胞培養(yǎng)液更換成正常培養(yǎng)液，于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h后分別收集各組細(xì)胞，進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測。

1.2.3 qRT-PCR 采用RNA提取試劑盒提取處于對數(shù)生長期的HL-7702、MHCC97H、Huh7、HCCLM3細(xì)胞及轉(zhuǎn)染48 h后各組MHCC97H細(xì)胞的總RNA，使用微量紫外分光光度計測定總RNA的純度和豐度。取適量RNA反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq檢測試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，進(jìn)行40個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，檢測細(xì)胞中miR-30e-5p的相對表達(dá)量；以GAPDH為內(nèi)參，檢測細(xì)胞中ATG5 mRNA的相對表達(dá)量。計算方法采用相對定量2-△△Ct法。(表1)

表1 qRT-PCR引物

1.2.4 MTT試驗 用胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的MHCC97H細(xì)胞，將其以5×103個/孔接種至96孔板中，按照上述“1.2.2”中方法進(jìn)行分組和轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置3個復(fù)孔。48 h后向各孔細(xì)胞中加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，于37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)4 h。取出細(xì)胞，棄去上清液，再向細(xì)胞中加入150 μL二甲基亞砜，于搖床上低速振蕩10 min。使用全自動酶標(biāo)儀測定光密度[D(450 nm)]值，試驗重復(fù)3次。

1.2.5 克隆形成試驗 用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸處于對數(shù)生長期的MHCC97H細(xì)胞，將其以1×103個/孔接種至6孔板中，分組和轉(zhuǎn)染處理MHCC97H細(xì)胞，每組設(shè)置3個復(fù)孔。將各組MHCC97H細(xì)胞于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待各組出現(xiàn)明顯克隆球時終止培養(yǎng)。使用95%乙醇固定細(xì)胞，以4 g/L結(jié)晶紫對細(xì)胞進(jìn)行染色，隨后計數(shù)并拍照。試驗重復(fù)3次。

1.2.6 FACS 用胰蛋白酶消化各組轉(zhuǎn)染48 h的MHCC97H細(xì)胞，收集細(xì)胞，向細(xì)胞中加入適量的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，制成密度為1×106個/mL的單細(xì)胞懸液。取100 μL細(xì)胞懸液，分別向細(xì)胞懸液中加入Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶(propidium iodide, PI)染液各5 μL，混勻，于室溫下避光孵育15 min，隨即用流式細(xì)胞儀檢測各組MHCC97H細(xì)胞的凋亡情況。試驗重復(fù)3次。

1.2.7 Western blotting 將處于對數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞MHCC97H接種至6孔板中，接種密度為1×104個/mL，每孔接種1 mL，分組和轉(zhuǎn)染48 h后使用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，離心，加入細(xì)胞裂解液于冰上裂解30 min，離心后小心吸取上清液即總蛋白。用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒對總蛋白進(jìn)行定量檢測，待蛋白變性后取等量蛋白樣品上樣，行SDS-PAGE，待蛋白分離后采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將膜浸入含5%脫脂奶粉的封閉液中于室溫下封阻1.5 h，用TBST洗膜后加入相應(yīng)一抗(LC3、RAB7、p62和ATG5的稀釋比例分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶500)，4 ℃過夜孵育，次日以TBST洗膜，再加入稀釋比例為1∶3 000的二抗，于室溫下孵育1～2 h。TBST洗膜后，以ECL試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光、拍照，以GAPDH為內(nèi)參，使用Quantity one軟件分析各條帶灰度值，計算各組MHCC97H細(xì)胞中目的蛋白的相對表達(dá)水平。試驗重復(fù)3次。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因試驗 TargetScan等生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果顯示，miR-30e-5p與ATG5 3＇UTR存在特異性靶向結(jié)合位點，表明ATG5可能是miR-30e-5p的一個靶基因。將構(gòu)建好的ATG5-Wt和ATG5-Mut熒光素酶報告基因表達(dá)載體與miR-30e-5p mimic或mimics-NC共轉(zhuǎn)染至MHCC97H細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后使用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)分別檢測螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，計算各組細(xì)胞中相對熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 miR-30e-5p在人肝癌細(xì)胞中的表達(dá)qRT-PCR結(jié)果顯示，人正常肝細(xì)胞HL-7702及人肝癌細(xì)胞MHCC97H、Huh7、HCCLM3中miR-30e-5p的表達(dá)水平分別為1.00±0.11、0.13±0.01、0.32±0.03、0.44±0.05，與人正常肝細(xì)胞HL-7702相比，人肝癌細(xì)胞MHCC97H、Huh7、HCCLM3中miR-30e-5p的表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。人肝癌細(xì)胞MHCC97H中miR-30e-5p的表達(dá)水平最低，因此選取MHCC97H細(xì)胞用于后續(xù)試驗。

2.2 過表達(dá)miR-30e-5p對MHCC97H細(xì)胞增殖能力的影響qRT-PCR結(jié)果顯示，與mimics-NC組相比，miR-30e-5p組MHCC97H細(xì)胞中miR-30e-5p的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)，對照組miR-30e-5p的表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)。MTT試驗結(jié)果顯示，與mimics-NC組相比，miR-30e-5p組MHCC97H細(xì)胞D值明顯下調(diào)(P<0.05)，對照組D值無明顯變化(P>0.05)。克隆形成試驗結(jié)果顯示，與mimics-NC組相比，miR-30e-5p組細(xì)胞克隆形成數(shù)明顯減少(P<0.05)，對照組細(xì)胞克隆形成數(shù)無明顯變化(P>0.05， 圖1)。(表2)

圖1 各組MHCC97H細(xì)胞克隆形成能力的檢測

表2 各組MHCC97H細(xì)胞中miR-30e-5p 表達(dá)水平、D值及細(xì)胞克隆形成數(shù)的比較

2.3 過表達(dá)miR-30e-5p對MHCC97H細(xì)胞凋亡的影響FACS結(jié)果顯示，對照組、mimics-NC組和miR-30e-5p組MHCC97H細(xì)胞凋亡率分別為(4.51±1.04)%、(5.14±1.22)%和(21.75±3.65)%，與mimics-NC組相比，miR-30e-5p組MHCC97H細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，對照組MHCC97H細(xì)胞凋亡率無明顯變化(P>0.05)。(圖2)

圖2 各組MHCC97H細(xì)胞凋亡率的檢測

2.4 過表達(dá)miR-30e-5p對MHCC97H細(xì)胞自噬的影響Western blotting結(jié)果顯示，與mimics-NC組相比，miR-30e-5p組MHCC97H細(xì)胞中自噬相關(guān)標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ、RAB7、p62的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯降低(P<0.05)，對照組中LC3Ⅱ、RAB7、p62的表達(dá)水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值無明顯變化(P>0.05)。(圖3、表3)

圖3 Western blotting檢測各組MHCC97H細(xì)胞中自噬相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)

表3 各組MHCC97H細(xì)胞中LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、RAB7、p62表達(dá)水平的比較

2.5 miR-30e-5p對ATG5靶向調(diào)控關(guān)系的驗證TargetScan等生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果顯示，miR-30e-5p與ATG5基因3＇UTR之間存在互補配對堿基。雙熒光素酶報告基因試驗結(jié)果顯示，miR-30e-5p能夠顯著抑制ATG5-Wt的相對熒光素酶活性(P<0.05)，而對ATG5-Mut的相對熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)。qRT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示，與mimics-NC組相比，miR-30e-5p組MHCC97H細(xì)胞中ATG5 mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，對照組中ATG5 mRNA和蛋白表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)。(圖4)

注：A.miR-30e-5p與ATG5基因3＇UTR的靶向結(jié)合位點；B.雙熒光素酶報告基因試驗檢測miR-30e-5p與ATG5的靶向關(guān)系；C.qRT-PCR和Western blotting檢測ATG5 mRNA和蛋白表達(dá)。與mimics-NC組比較，*P<0.05。圖4 miR-30e-5p靶向ATG5關(guān)系的驗證

3 討論

肝細(xì)胞癌屬于原發(fā)性肝癌，占肝癌的85%以上，是世界范圍內(nèi)常見的腫瘤。在中國，肝細(xì)胞癌的發(fā)病率占所有惡性腫瘤病例的50%以上，嚴(yán)重影響人們的健康[10]。在肝細(xì)胞癌發(fā)病及進(jìn)展中，miRNA已被充分研究并顯示出其致癌或抑癌功能[11]。miRNA是一類小的內(nèi)源性非編碼RNA，其通過與靶基因的3＇UTR結(jié)合而與幾個關(guān)鍵的腫瘤生物過程相關(guān)聯(lián)，包括腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡和自噬等[12]。先前的研究已經(jīng)證明，miR-30e-5p是一種新型腫瘤抑制因子，在人類多種類型的惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用[4，13]。一項研究表明，在原發(fā)性腫瘤中高水平表達(dá)的miR-30e-5p與乳腺癌的良好預(yù)后相關(guān)[14]。另一項研究顯示，miR-30e在肝細(xì)胞癌患者血清中的表達(dá)水平顯著低于健康志愿者，表明血清miR-30e是一種新的肝細(xì)胞癌非侵襲性生物標(biāo)志物[15]。研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染可通過靶向MAP4K4信號通路的miR-30e-5p抑制活化T細(xì)胞核因子5的表達(dá)， 從而促進(jìn)肝癌發(fā)生[16]。后續(xù)研究證實了miR-30e-5p在肝癌患者血清中呈低表達(dá)[17]。因此，本研究在以往研究的基礎(chǔ)上采用qRT-PCR檢測人正常肝細(xì)胞和不同株人肝癌細(xì)胞中miR-30e-5p的表達(dá)水平，結(jié)果顯示miR-30e-5p在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯低于正常肝細(xì)胞。這提示miR-30e-5p在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中可能作為抑癌基因發(fā)揮作用。

為探究miR-30e-5p對肝癌細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的影響，本研究選擇miR-30e-5p基礎(chǔ)表達(dá)水平最低的人肝癌細(xì)胞MHCC97H為研究對象，通過轉(zhuǎn)染miR-30e-5p mimics過表達(dá)miR-30e-5p，且通過qRT-PCR驗證了轉(zhuǎn)染效果。進(jìn)一步的MTT和克隆形成試驗結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-30e-5p可明顯抑制MHCC97H細(xì)胞的增殖和克隆形成。此外，F(xiàn)ACS結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-30e-5p能夠促進(jìn)MHCC97H細(xì)胞凋亡。這與Feng等[18]在肝癌細(xì)胞中、Egan等[19]在前列腺癌中的研究相一致。LC3是研究最廣泛的自噬標(biāo)志蛋白，包括LC3 Ⅱ和LC3Ⅰ 2種蛋白，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的大小可在一定程度上反映細(xì)胞自噬水平的高低[20]。RAB7參與細(xì)胞自噬小體的形成及成熟過程，其含量可決定自噬通量，參與自噬的重要環(huán)節(jié)[21]。p62是自噬流下游的標(biāo)志蛋白，參與自噬小體-溶酶體蛋白的降解過程[22]。本研究Western blotting檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-30e-5p后MHCC97H細(xì)胞中LC3、RAB7和p62蛋白表達(dá)水平有不同程度的下調(diào)，這表明miR-30e-5p可抑制MHCC97H細(xì)胞自噬的發(fā)生。眾所周知，miRNA通常通過調(diào)控靶基因的表達(dá)實現(xiàn)對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。ATG5基因參與自噬體的形成，在自噬過程中起關(guān)鍵作用[23]。研究發(fā)現(xiàn)，ATG5基因在肝癌組織中呈高表達(dá)，提示肝癌的惡性進(jìn)展可能與ATG5基因介導(dǎo)的自噬密切相關(guān)[24]。前期通過生物信息學(xué)手段預(yù)測發(fā)現(xiàn)，ATG5基因可能是miR-30e-5p的一個直接靶基因。因此，本研究采用雙熒光素酶報告基因試驗和Western blotting進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示miR-30e-5p能夠靶向負(fù)調(diào)控ATG5基因的表達(dá)。

綜上所述，過表達(dá)miR-30e-5p能夠顯著抑制人肝癌細(xì)胞MHCC97H的增殖和自噬，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機制可能與miR-30e-5p靶向調(diào)控ATG5基因表達(dá)有關(guān)。本研究只是初步研究miR-30e-5p對肝癌細(xì)胞的影響及機制，其具體分子機制仍不十分明確，并且本研究只采用單一細(xì)胞株進(jìn)行試驗，尚顯不足，后續(xù)試驗將對此進(jìn)行深入探究。