趙慶敏，劉永琦，李佳蔚，李玲，李程豪，李研

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000；2. 湖北省武漢市武昌區(qū)積玉橋街社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，武漢 430000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000)

腫瘤微環(huán)境的組成除了腫瘤細(xì)胞外，還有大量免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和各種可溶性因子，在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞相互影響，前者通過各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)微環(huán)境中免疫細(xì)胞的組分及細(xì)胞因子的分泌，構(gòu)建適合自身生長的微環(huán)境。而T細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境中主要的免疫細(xì)胞，在腫瘤發(fā)展和臨床治療的各個(gè)階段發(fā)揮重要作用，是介導(dǎo)腫瘤適應(yīng)性免疫的重要組成部分，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。T細(xì)胞分類方式多樣，成熟T細(xì)胞可分為CD4+和CD8+T細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞也被稱為Th，通過MHC Ⅰ類分子與抗原直接結(jié)合；CD8+T細(xì)胞也被稱為CTL，通過MHC Ⅱ類分子與抗原直接結(jié)合，在腫瘤免疫中發(fā)揮不同作用。T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞體外共培養(yǎng)存在一定難度，各種培養(yǎng)方法缺乏統(tǒng)一性，也無共培養(yǎng)相關(guān)資料可參考。文章主要對CD4+和CD8+T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的應(yīng)用進(jìn)行歸納，也對其他淋巴細(xì)胞，如PBMC、CD3+T細(xì)胞和人急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)Jurkat T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的方法進(jìn)行了簡單總結(jié)，旨在為免疫治療和免疫機(jī)制的研究提供參考。

1 CD4+T細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)

1.1 腫瘤細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞的影響免疫微環(huán)境是多種細(xì)胞或因子參與的復(fù)雜環(huán)境，T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生細(xì)胞因子影響T細(xì)胞的分化類型，在免疫微環(huán)境中發(fā)揮作用。例如，原發(fā)性胃癌細(xì)胞和胃癌細(xì)胞系都可誘導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。Lu等[2]首先證實(shí)胃癌患者腫瘤部位Treg數(shù)量龐大，將CD4+T細(xì)胞與原發(fā)性胃癌細(xì)胞以1∶2比例在Transwell小室培養(yǎng)5 d，結(jié)果證明原發(fā)性胃癌細(xì)胞可通過TGF-β1誘導(dǎo)初始T細(xì)胞向Treg轉(zhuǎn)化。Yuan等[3]也做了類似研究，但使用CD4+T細(xì)胞與胃癌細(xì)胞上清液共培養(yǎng)，也發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞(MGC-803、SGC-7901)通過TGF-β1誘導(dǎo)CD4+CD25-初始T細(xì)胞向Treg轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)中CD4+T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子影響Treg的產(chǎn)生，并在胃癌微環(huán)境中發(fā)揮作用。

1.2 Treg對腫瘤細(xì)胞的影響Treg占CD4+T細(xì)胞的一小部分，是適應(yīng)性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)細(xì)胞，在維持自身抗原耐受中起重要作用，也提供了與腫瘤微環(huán)境相關(guān)的抑制作用。Foxp3是Treg的標(biāo)志性分子之一，對Treg的發(fā)育及功能發(fā)揮起關(guān)鍵作用[4-5]。Peng等[6]發(fā)現(xiàn)，Treg與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，微環(huán)境中Foxp3水平的增加可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，將健康人Treg與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 95D以2∶1比例于Transwell小室共培養(yǎng)14 d后發(fā)現(xiàn)，Treg中Foxp3表達(dá)量顯著增加，95D細(xì)胞中的基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)表達(dá)量上調(diào)，且95D細(xì)胞活力和侵襲能力增強(qiáng)，腫瘤生長得到促進(jìn)。Treg作為重要的免疫細(xì)胞類型，有關(guān)其標(biāo)志性分子Foxp3在微環(huán)境中發(fā)揮作用的機(jī)制還有待探討。劉瑞敏等[7]將健康人CD4+T細(xì)胞與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染高表達(dá)Foxp3的肺癌細(xì)胞株(NCIH-hFoxp3細(xì)胞)以1∶1比例于Transwell小室共培養(yǎng)72 h，發(fā)現(xiàn)活化CD4+T細(xì)胞的增殖水平和活性降低，高表達(dá)Foxp3的腫瘤細(xì)胞可能通過這種方式逃避機(jī)體免疫監(jiān)視，和Treg的調(diào)節(jié)作用相似。研究將Treg和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，以及CD4+T細(xì)胞與高表達(dá)Treg標(biāo)志性分子的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，共同探討了Treg及其標(biāo)志性分子Foxp3在肺癌微環(huán)境中的作用及機(jī)制。

1.3 靶點(diǎn)抑制劑對Treg和腫瘤細(xì)胞的影響組織蛋白酶S(cathepsin S，CatS)是一種在多種疾病過程中發(fā)揮重要作用的半胱氨酸蛋白酶，尤其與腫瘤的關(guān)系是近年來研究的熱點(diǎn)。Yan等[8]發(fā)現(xiàn)CatS抑制劑具有降低 Treg免疫抑制活性的作用，進(jìn)一步的研究揭示了CatS抑制劑在腫瘤細(xì)胞存在時(shí)對T細(xì)胞的影響：將CatS抑制劑處理的Treg與鼠膀胱癌細(xì)胞MB49或脾臟細(xì)胞以1∶1比例共培養(yǎng)24 h，與PBS處理的Treg相比，抑制劑處理的Treg與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后，Treg增殖減少，凋亡增多；抑制劑處理的Treg與脾臟細(xì)胞共培養(yǎng)后，B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞增殖水平明顯降低；但在脾臟細(xì)胞中加入腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)液后，B細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞增殖能力變化不顯著，但CD8+T細(xì)胞增殖增多，凋亡減少。以上表明CatS抑制劑在正常條件下抑制Treg并降低總體T細(xì)胞免疫，在腫瘤細(xì)胞存在條件下增強(qiáng)了CD8+T細(xì)胞免疫。研究將Treg和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，探討靶點(diǎn)抑制劑對Treg和膀胱癌細(xì)胞的影響，也揭示其影響膀胱癌微環(huán)境中免疫功能的可能機(jī)制。

1.4 其他免疫細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的影響免疫微環(huán)境是多種細(xì)胞或因子等參與的復(fù)雜環(huán)境，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(lymphatic endothelial cell，LEC)是淋巴管內(nèi)皮的主要成分，在宿主固有免疫應(yīng)答的啟動中發(fā)揮重要作用。LEC不僅可以發(fā)揮抗原提呈作用，還分泌促炎細(xì)胞因子和趨化因子以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[9-10]。Tokumoto 等[11]將分選的CD4+T細(xì)胞、胃癌患者來源的LEC和胃癌細(xì)胞OCUM12以1∶3∶30比例共培養(yǎng)3 d，觀察到在腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥條件下，LEC與CD4+T細(xì)胞相互作用，抑制后者產(chǎn)生細(xì)胞因子，從而抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答。將CD4+T細(xì)胞、LEC和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)為探討其他類型免疫細(xì)胞對T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的影響及可能機(jī)制提供了參考。

1.5 免疫檢查點(diǎn)對CD4+T細(xì)胞的影響近年來免疫檢查點(diǎn)再次受到研究者的關(guān)注，其對于很多腫瘤，尤其是惡性且化療耐受的腫瘤患者有著顯著效果。PD-1和CTLA-4在調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，但部分患者不能從中獲益。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3(T-cell immunoglobulin mucin 3， TIM-3)以及淋巴細(xì)胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3，LAG-3)分子是熱門的免疫檢查點(diǎn)分子，雖屬同一類共抑制受體，但其發(fā)揮功能的機(jī)制并不相同。Ozkazanc等[12]將CD4+T細(xì)胞與5種不同髓系白血病細(xì)胞分別以1∶0.25、1∶2和1∶4比例共培養(yǎng)96 h，不同比例和時(shí)間條件下TIM-3和LAG3受體變化趨勢不同，但持續(xù)共刺激96 h后，CD4+T細(xì)胞表面PD-1、CTLA-4、TIM-3和LAG3的表達(dá)均上調(diào)，除了T細(xì)胞活化抗體的影響，白血病細(xì)胞信號在其中不僅刺激了T細(xì)胞反應(yīng)，而且誘導(dǎo)了共抑制受體的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)將CD4+T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)研究了T細(xì)胞共抑制受體對T細(xì)胞及相關(guān)因子的影響，也為闡明共抑制信號對T細(xì)胞影響機(jī)制提供了幫助。

1.6 嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)-T細(xì)胞過繼免疫療法的應(yīng)用近年來腫瘤免疫治療方法之一的過繼性免疫治療成為熱門，其以多種形式通過調(diào)節(jié)自身免疫系統(tǒng)以治療腫瘤，例如CAR-T細(xì)胞治療即CAR-T療法，通過對T細(xì)胞進(jìn)行修飾，體外擴(kuò)增后回輸至患者體內(nèi)，改造T細(xì)胞獲得特異性識別腫瘤細(xì)胞的能力。CAR-T細(xì)胞過繼免疫療法也在外周T細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)揮作用，擴(kuò)展了腫瘤患者的治療可能。例如，Pinz等[13]轉(zhuǎn)染了來自CD4+T細(xì)胞的CAR-T細(xì)胞與表達(dá)CD4的間變性大細(xì)胞淋巴瘤KARPAS 299細(xì)胞，分別以2∶1、 5∶1和10∶1比例共培養(yǎng)24 h。CD4+CAR-T細(xì)胞在擴(kuò)增后產(chǎn)生大量CD8+T細(xì)胞并清除了腫瘤細(xì)胞，表明其在CD4+的間變性大細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中有效，可用作移植或獨(dú)立治療外周T細(xì)胞淋巴瘤。實(shí)驗(yàn)將CD4+CAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)淋巴瘤細(xì)胞明顯減少，這擴(kuò)展了外周T細(xì)胞淋巴瘤的治療范圍，為有效的臨床治療提供了可能。

2 CD8+T細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)

2.1 趨化因子對腫瘤細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的影響腫瘤微環(huán)境中存在大量各種類型的趨化因子，趨化因子是細(xì)胞遷移和細(xì)胞間相互作用的必不可少的調(diào)節(jié)因子，了解趨化因子與腫瘤細(xì)胞之間的相互影響以及它們對免疫反應(yīng)和腫瘤轉(zhuǎn)移的影響，對腫瘤的發(fā)展至關(guān)重要[14]。Sugasawa等[15]將PBMC、CD4+T細(xì)胞、CD4-T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞與胃癌細(xì)胞以2∶1比例共培養(yǎng)48 h，發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生大量趨化因子配體5(C-C chemokine ligand 5，CCL5)促進(jìn)胃癌細(xì)胞(MKN45、KATOⅢ)增殖，CCL5處理的胃癌細(xì)胞通過Fas/FasL途徑誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞凋亡，證明胃癌細(xì)胞可通過誘導(dǎo)CCL5的表達(dá)獲得增殖及病情進(jìn)展。此研究方法中T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)為研究趨化因子在胃癌微環(huán)境中的影響提供了合適模型，也為了解胃癌發(fā)展機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

2.2 免疫檢查點(diǎn)對CD8+T細(xì)胞的影響免疫檢查點(diǎn)被證明在多種腫瘤中效果顯著。PD-1和CTLA-4是目前研究最多的檢查點(diǎn)分子，在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞表達(dá)免疫檢查點(diǎn)配體PD-L1與T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸。針對其途徑的抑制能夠有效解除T細(xì)胞的抑制狀態(tài)，對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。Huang等[16]將健康供體來源的CTL與過表達(dá)PD-L1的肝細(xì)胞癌細(xì)胞以10∶1比例共培養(yǎng)48 h，發(fā)現(xiàn)CD8+CTL通過HLAⅠ類分子顯著上調(diào)肝癌細(xì)胞(Bel7402、HepG2)PD-L1的表達(dá)，其過表達(dá)又影響CD8+CTL中IFN-γ的分泌，表明PD-L1表達(dá)與CD8+CTL體外抗腫瘤反應(yīng)有關(guān)。免疫檢查點(diǎn)PD-1除了配體PD-L1，還有另一個(gè)配體PD-L2，其在調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用。Leng 等[17]將CD8+T細(xì)胞與轉(zhuǎn)染的過表達(dá)PD-L1和PD-L2的人食管癌細(xì)胞Ec109以5∶1比例培養(yǎng)48 h，發(fā)現(xiàn)PD-L1組CD8+T細(xì)胞增殖，PD-L2組CD8+T細(xì)胞減少，阻斷信號通路都可以抑制其作用。以上表明PD-L1和PD-L2發(fā)揮的免疫作用可能不同，但有關(guān)PD-L2的研究較少，PD-L2可能還有除PD-1外的其他受體[18]，其確切作用和分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。該模型的建立也為闡明免疫檢查點(diǎn)其他配體的作用和可能機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

除了最常見的免疫檢查點(diǎn)分子PD-1外，還有一些新型的免疫檢查點(diǎn)在腫瘤中也發(fā)揮重要作用。T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域蛋白(T cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT)是一種抑制T細(xì)胞反應(yīng)的免疫檢查點(diǎn)分子，它與配體CD155以高親和力結(jié)合并與配體CD112低親和力結(jié)合，在體內(nèi)CD226與它競爭結(jié)合2個(gè)配體，是復(fù)雜配受體網(wǎng)絡(luò)的一部分[19]。He等[20]將健康人來源的CD8+T細(xì)胞和CD8+TIGIT+T細(xì)胞與胃癌細(xì)胞SGC7901以5∶1比例共培養(yǎng)，證明胃癌細(xì)胞可以誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞表面TIGIT表達(dá)。TIGIT與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的配體CD155結(jié)合抑制CD8+T細(xì)胞代謝和效應(yīng)功能，這些作用可以被葡萄糖或TIGIT阻斷中和，支持CD155/TIGIT可作為胃癌潛在的治療靶點(diǎn)。表達(dá)TIGIT的CD8+T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)為闡明腫瘤微環(huán)境中TIGIT及其配體的作用機(jī)制提供了參考，也為胃癌提供了更多可能的治療靶點(diǎn)。

2.3 CD8+Treg的轉(zhuǎn)化和免疫機(jī)制研究CD4+Treg和CD8+Treg是2個(gè)主要的Treg類型，與CD4+Treg相比，CD8+Treg研究得較少，它與組織損傷、自身免疫性疾病和腫瘤密切相關(guān)[21]，也可通過多種機(jī)制在實(shí)體器官移植以及移植物抗宿主病中發(fā)揮重要作用[22]。Zhang等[23]發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者中CD8+Treg亞群增加，Treg的標(biāo)志性分子表達(dá)增加，研究將CD8+T細(xì)胞與2種卵巢癌細(xì)胞以5∶1比例在Transwell小室中共培養(yǎng)5 d，發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞中Foxp3+、CTLA-4+和CD28+T細(xì)胞比例增加。通過對表型和細(xì)胞因子分泌的分析顯示，與卵巢癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，外周血CD8+T細(xì)胞誘導(dǎo)CD8+Treg的產(chǎn)生并抑制初始CD4+T細(xì)胞的增殖，對CD4+T細(xì)胞的抑制可能部分通過TGF-β1和IFN-γ介導(dǎo)。將CD8+T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)闡明了特殊類型CD8+T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互作用及其可能機(jī)制，也為研究免疫微環(huán)境中復(fù)雜的免疫機(jī)制提供了幫助。

2.4 CTL過繼免疫療法的應(yīng)用CTL過繼免疫療法通過分離特異性CTL，體外擴(kuò)增并輸注至患者體內(nèi)以殺傷腫瘤細(xì)胞，是主要的過繼免疫療法之一。IL-18是一種多效性細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，也可調(diào)節(jié)CTL和中性粒細(xì)胞活性，在其他細(xì)胞因子存在的條件下還能誘導(dǎo)NK細(xì)胞等的功能[24]。Kohyama等[25]使用腫瘤患者來源的CD8+CTL與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞TKB9、胃腺癌患者腹水來源的GT3TKB和腎癌細(xì)胞TUHR13TKB以10∶1比例共培養(yǎng)24 h，研究發(fā)現(xiàn)IL-18在體外直接激活CD8+CTL并增強(qiáng)其對體內(nèi)腫瘤的細(xì)胞毒活性，未加入IL-18的CD8+CTL無明顯的細(xì)胞毒活性，但與IL-18孵育7 d后也顯示出細(xì)胞毒活性，證明IL-18為CTL過繼免疫療法的優(yōu)化提供了新方案。將患者來源的CTL與多種腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胃腺癌、腎癌等提供了過繼免疫治療的可能，細(xì)胞因子的加入為優(yōu)化過繼免疫治療提供了有效支持。

3 各種T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)方法

T細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境中主要的免疫細(xì)胞，分類方式多樣，下表主要列舉了與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的PBMC、CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞以及永生化的Jurkat T細(xì)胞，將幾種類型T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)方法作一簡單總結(jié)，希望為免疫治療和免疫機(jī)制的研究提供參考(表1)。

表1 T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)方法概述

4 結(jié)語

近年來，腫瘤免疫治療表現(xiàn)出巨大的潛力，免疫檢查點(diǎn)和過繼免疫治療等通過改變T細(xì)胞的活性有效發(fā)揮抗腫瘤作用，T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的作用越來越不可忽視。文章將T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的具體方法作一總結(jié)，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的有關(guān)T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的文獻(xiàn)主要涉及在腫瘤微環(huán)境中，模擬腫瘤細(xì)胞、T細(xì)胞、其他免疫細(xì)胞、趨化因子和細(xì)胞因子等的相互作用，主要應(yīng)用于T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞間的相互作用，部分應(yīng)用于免疫檢查點(diǎn)和過繼免疫治療，還有一小部分應(yīng)用于靶點(diǎn)治療和新型療法，探討了T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞對T細(xì)胞，以及其他免疫相關(guān)因素等對T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的影響及機(jī)制。這仍是研究難點(diǎn)，例如T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)是否需要DC等APC的參與；免疫檢查點(diǎn)在體外的研究怎樣更好地模擬體內(nèi)微環(huán)境；抗PD-1和CTLA-4抗體在部分患者中應(yīng)答率不高，是否可以與其他共抑制受體，例如TIM-3和LAG3等聯(lián)合優(yōu)化免疫治療效果，仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)支持。文章綜述了各種T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)方法和應(yīng)用，期望對T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞以及T細(xì)胞、其他免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的研究提供參考，也為腫瘤的免疫機(jī)制和免疫治療探索提供幫助。