劉佳程，胡晨曦，李玥，姜偉，劉偉，2

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，石家莊 050051；2. 河北省重大疾病的免疫機(jī)制及干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050017)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的惡性腫瘤，50%～60%的患者在診斷時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移。化療是CRC患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但該方法具有選擇性低、腫瘤部位藥物濃度低、全身毒副作用明顯等局限。目前，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)包括西妥昔單抗、帕尼單抗、瑞戈非尼單抗、阿柏西普單抗、雷莫蘆單抗及貝伐單抗在內(nèi)的6種治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(metastatic colorectal cancer，mCRC)的靶向藥物，提高了患者總生存率[1]。

2018年中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)發(fā)布的CRC診斷指南，增加了錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair，MMR)蛋白和微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)檢測結(jié)果的判斷原則和兩者之間相關(guān)性的解釋，即錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)缺失型(deficient mismatch repair，dMMR)表現(xiàn)為高頻度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability-high，MSI-H)， 錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)正常型(proficient mismatch repair, pMMR)表現(xiàn)為低頻度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability-low，MSI-L)或微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite-stable，MSS)，分子標(biāo)志物檢測使得對(duì)患者的治療從規(guī)范化逐步邁向精準(zhǔn)化。dMMR/MSI-H mCRC患者是一個(gè)獨(dú)特的生物標(biāo)志定義人群，約占CRC患者總數(shù)的4%[2]，具有突變負(fù)荷高、抗原新表位數(shù)量多、CTL浸潤不足及免疫檢查點(diǎn)表達(dá)水平高等特點(diǎn)，患者從傳統(tǒng)治療中獲益少[3-4]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑抗PD-1抗體可增強(qiáng)腫瘤抗原特異性CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤活性，這與dMMR/MSI-H mCRC患者中腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)高度持久和安全可控相關(guān)[5]。臨床和動(dòng)物試驗(yàn)顯示，將PD-1/PD-L1抑制劑與其他治療手段聯(lián)合可進(jìn)一步增強(qiáng)CRC療效。

1 PD-1/PD-L1單抗治療

1.1 PD-1/PD-L1通路T細(xì)胞表面的PD-1與腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的PD-L1結(jié)合，可抑制T細(xì)胞增殖活化，使腫瘤細(xì)胞逃脫免疫檢查。TCR與APC表面的MHC分子結(jié)合傳遞活化信號(hào)，可使T細(xì)胞釋放IFN-γ，IFN-γ與腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合后通過JAK-STAT信號(hào)通路啟動(dòng)干擾素應(yīng)答基因的表達(dá)，如IRF-1，它與PD-L1啟動(dòng)子結(jié)合，致使腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)PD-L1[6]。PD-1與PD-L1結(jié)合后，PD-1中ITSM結(jié)構(gòu)域發(fā)生磷酸化并募集SHP-2，使下游的Syk和PI3K去極化，進(jìn)一步抑制T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生[7]。PD-1抑制劑可引起腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞和DC間的相互作用，促使IFN-γ(CD8+T細(xì)胞)和IL-12(DC)分泌增加，發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。

1.2 納武利尤單抗、帕博利珠單抗和阿特珠單抗治療2017年FDA批準(zhǔn)納武利尤和帕博利珠單抗用于治療dMMR/MSI-H mCRC。CRC患者的微衛(wèi)星狀態(tài)是免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效的重要預(yù)測指標(biāo)，MSI-H患者經(jīng)抗PD-1藥物治療的客觀緩解率(objective response rate，ORR)、無進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)明顯高于MSI-L/MSS患者。dMMR腫瘤細(xì)胞易發(fā)生體細(xì)胞突變及異常突變蛋白高表達(dá)，腫瘤組織中有較多淋巴細(xì)胞浸潤，同時(shí)腫瘤細(xì)胞更易表達(dá)PD-L1[9]。在MSI-H型CRC中，在低劑量IFN-γ的影響下，PD-L1表達(dá)顯著上調(diào)，并且MSI-H細(xì)胞系可通過JAK-STAT信號(hào)通路對(duì)IFN-γ表現(xiàn)出高反應(yīng)性[10]。這可能是MSI-H CRC患者應(yīng)用抗PD-1抗體治療預(yù)后好，抗體治療應(yīng)答率高的原因。

納武利尤單抗作為以PD-1為靶點(diǎn)的單抗藥物，被廣泛用于治療包括dMMR/MSI-H mCRC在內(nèi)的多種腫瘤。Ⅱ期臨床試驗(yàn)CheckMate 142招募了來自8個(gè)國家、31個(gè)地區(qū)被確診為dMMR/MSI-H型CRC的患者74名，其中40名曾接受過3次及以上其他治療，每2周給予患者3 mg/kg 納武利尤單抗治療(表1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在中位隨訪時(shí)間為12個(gè)月[四分位距(interquartile range，IQR)范圍8.6～18.0]時(shí)，23名患者(31.1%，95%CI20.8%～42.9%)達(dá)到了研究者評(píng)估的ORR，51名患者(68.9%，95%CI57.0%～79.0%)的疾病控制時(shí)間持續(xù)12周或更長，所有應(yīng)答者均存活，8名患者持續(xù)緩解12個(gè)月或更長時(shí)間?；颊卟涣挤磻?yīng)癥狀輕，最常見的3～4級(jí)與藥物相關(guān)的不良反應(yīng)是脂肪酶和淀粉酶濃度升高。以上表明納武利尤單抗為既往治療過的dMMR/MSI-H mCRC患者提供了持久的疾病緩解率和疾病控制[11,17-18]。

帕博利珠單抗是FDA于2017年5月批準(zhǔn)用于治療dMMR/MSI-H實(shí)體腫瘤患者的PD-1抑制劑。dMMR可使腫瘤對(duì)帕博利珠單抗高度敏感，患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷治療反應(yīng)良好且持久，毒副作用很小[19]。一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，靜脈給予41名CRC患者每2周10 mg/kg 帕博利珠單抗治療，其中患者先前至少接受了2次及以上其他治療(表1)。結(jié)果顯示，MSI-H mCRC患者的ORR為40%，PFS為20周的占78%；而MSS mCRC患者的ORR為0，PFS為20周的占11%，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞高突變負(fù)荷與PFS的延長相關(guān)(P=0.02)[4]。一項(xiàng)回顧性研究中，選取了3家醫(yī)院8名晚期MSI-H CRC患者，其中4名局部進(jìn)展，4名轉(zhuǎn)移。所有患者均接受了納武利尤單抗或帕博利珠單抗治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PD-1抗體可致晚期dMMR/MSI-H CRC患者腫瘤消退，有較好的療效和安全性[20]。Ⅱ期臨床試驗(yàn)KEYNOTE-164評(píng)估了帕博利珠單抗在已接受治療的dMMR/MSI-H CRC患者中的抗腫瘤活性，患者在長達(dá)2年內(nèi)每3周接受200 mg 帕博利珠單抗治療，其中患者接受過≥2種標(biāo)準(zhǔn)治療，包括氟嘧啶、奧沙利鉑和伊立替康(隊(duì)列A)，或有≥1個(gè)既往治療藥物(隊(duì)列B)(表1)。結(jié)果顯示，在招募的124名MSI-H/dMMR CRC患者(A組61例，B組63例)中，隊(duì)列A中位隨訪時(shí)間為31.3個(gè)月(IQR 0.2～35.6)，ORR為33%(95%CI，21.0%～46.0%)，PFS中位數(shù)為2.3個(gè)月(95%CI，2.1～8.1)；隊(duì)列B中位隨訪時(shí)間為24.2個(gè)月(IQR 0.1～27.1)，ORR為33%(95%CI，22.0%～46.0%)，PFS中位數(shù)為4.1個(gè)月(95%CI，2.1～18.9)。兩組患者均未達(dá)到中位反應(yīng)持續(xù)時(shí)間，與治療相關(guān)的3～4級(jí)不良反應(yīng)發(fā)生率在隊(duì)列A中為16%(n=10)，隊(duì)列B中為13%(n=8)，其中最常見的不良反應(yīng)(發(fā)生在≥2名患者中)包括胰腺炎、疲勞和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高[12]。這些研究表明，帕博利珠單抗對(duì)MSI-H/dMMR CRC患者有效，且安全性可控。

阿特珠單抗作為以PD-L1為靶點(diǎn)的藥物，治療CRC患者效果不佳。一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，研究者招募了175名晚期實(shí)體瘤患者，包括6名CRC患者，給予其3 次/周阿特珠單抗治療，給藥劑量范圍從0.01～20.00 mg/kg逐漸增加，治療耐受情況良好，CRC患者在48周時(shí)停止治療，結(jié)果顯示無明顯療效[13,21](表1)。

表1 免疫檢查點(diǎn)藥物治療CRC的臨床試驗(yàn)

2 聯(lián)合治療

2.1 聯(lián)合放療電離輻射和放射增敏劑維利帕尼可以通過潛在的互補(bǔ)作用機(jī)制增強(qiáng)CRC患者對(duì)抗PD-1/PD-L1抗體的反應(yīng)性。電離輻射可顯著增加CT26細(xì)胞系IFN-α和CXCL10的表達(dá)，維利帕尼以劑量依賴的方式增加MC38細(xì)胞系MHCⅠ和PD-L1表面定位。在兩種腫瘤模型中，同時(shí)給予維利帕尼和電離輻射治療可顯著促進(jìn)抗PD-1抗體介導(dǎo)的延遲體內(nèi)腫瘤生長作用，從而延長生存期。此外，電離輻射和維利帕尼增強(qiáng)抗PD-1/PD-L1抗體介導(dǎo)的腫瘤生長抑制會(huì)因CD8+T細(xì)胞耗竭而減弱[22]。

2.2 聯(lián)合化療奧沙利鉑(oxaliplatin，OxP)是CRC一線化療藥物，研究發(fā)現(xiàn)OxP在CT26-FL3小鼠中可誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡，與對(duì)照組相比，原位CT26-FL3腫瘤中CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和活化的DC數(shù)量增加，OxP治療的小鼠腫瘤組織中PD-L1表達(dá)升高。應(yīng)用OxP及OxP聯(lián)合抗PD-L1抗體治療時(shí)，聯(lián)用組有更顯著的腫瘤抑制效果，表明OxP與抗PD-L1抗體聯(lián)用具有協(xié)同效應(yīng)[23]。PD-L1抑制劑德瓦魯單抗可顯著改善CT26 CRC小鼠的存活率，通過與OxP聯(lián)用可進(jìn)一步增強(qiáng)PD-L1抑制劑的抗腫瘤活性，并使腫瘤內(nèi)HMGB1的釋放量增加[24]。PD-1/MS(MUC1和生存素)疫苗可將腫瘤抑制率從17.18%提高至30.96%，并使小鼠存活率從6.96%延長至19.44%，進(jìn)一步研究顯示，PD-1/MS疫苗與OxP聯(lián)用可將腫瘤抑制率提高至74.71%[25]。

腫瘤微環(huán)境內(nèi)，共表達(dá)PD-1和TIM-3的CD8+TIL被認(rèn)為是功能失調(diào)細(xì)胞，TIM-3-TCF-1hi表型的TIL被認(rèn)為是功能增強(qiáng)細(xì)胞。而FOLFOX處理的CRC小鼠模型中， CD8+TIL保持低水平的PD-1和TIM-3為特征的功能分化狀態(tài)和CD38loCD101loTIM-3-TCF-1hi細(xì)胞表型。抗PD-1抗體沒有增加腫瘤微環(huán)境內(nèi)具有TIM-3-TCF-1hi表型的TIL，從而使抗PD-1抗體聯(lián)合FOLFOX化療抗腫瘤療效更優(yōu)[26-27]。地西他濱誘導(dǎo)DNA低甲基化，可直接增加腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)，也可改造腫瘤免疫微環(huán)境的免疫原性并促進(jìn)淋巴細(xì)胞浸潤。聯(lián)合抗PD-L1抗體與OxP治療可發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，重塑腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤生長，為CRC患者提供潛在的臨床獲益[28]。

一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)將最初無法切除和先前未接受治療的201名mCRC患者(無論微衛(wèi)星狀態(tài)如何)以1∶2的比例隨機(jī)分配，患者單獨(dú)接受多達(dá)8個(gè)周期的一線聯(lián)合化療藥物(FOLFOXIRI)/VEGF拮抗劑(貝伐單抗)，在此基礎(chǔ)上聯(lián)合阿特珠單抗治療，直至疾病進(jìn)展，PFS為主要研究指標(biāo)，該試驗(yàn)正在進(jìn)行中[15](表1)。

2.3 聯(lián)合免疫療法

2.3.1 聯(lián)合CTLA-4抑制劑 CTLA-4作為重要的免疫檢查點(diǎn)，介導(dǎo)腫瘤負(fù)向免疫調(diào)控。它是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白，在TCR參與并通過CD28發(fā)出共刺激信號(hào)后，被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，與CD80/86結(jié)合后，在活化的B細(xì)胞和單核細(xì)胞上傳遞抑制性信號(hào)，同時(shí)介導(dǎo)抑制性信號(hào)傳入T細(xì)胞，抑制T細(xì)胞的增殖和活化。臨床上應(yīng)用伊匹單抗和曲美木單抗可阻斷CTLA-4的活化[6，19]。

聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)阻斷的免疫療法相較單一的免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療更有可能提高腫瘤患者的生存率。目前，納武利尤單抗聯(lián)合伊匹單抗已被批準(zhǔn)用于治療惡性黑色素瘤、小細(xì)胞肺癌等。臨床研究表明，伊匹單抗和納武利尤單抗均可提高患者的無復(fù)發(fā)生存率，且聯(lián)用比單一使用納武利尤單抗療效更優(yōu)，尤其在具有高突變負(fù)荷的腫瘤患者中，聯(lián)用的療效進(jìn)一步增強(qiáng)[29-30]。dMMR/MSI-H mCRC具有突變負(fù)荷高、抗原新表位數(shù)量多、免疫檢查點(diǎn)表達(dá)上調(diào)等特點(diǎn)，臨床上采用聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)阻斷的療法可使患者獲得更多益處。CheckMate 142Ⅱ期臨床試驗(yàn)納入了119名CRC患者，分別給予納武利尤單抗(3 mg/kg)與伊匹單抗(1 mg/kg)，每3周給藥1次，連續(xù)4次，隨后接受納武利尤單抗(3 mg/kg)，每2周給藥1次，直至腫瘤進(jìn)展、患者死亡或出現(xiàn)不可接受的毒副作用(表1)。在中位隨訪時(shí)間為13.4個(gè)月時(shí)，研究者評(píng)估的ORR為55% (95%CI， 45.2%～63.8%)，12周疾病控制率為80%，PFS分別為76%(9個(gè)月)和71%(12個(gè)月)，總體生存率分別為87%和85%。相較單一的納武利尤單抗治療，這一研究結(jié)果顯示納武利尤單抗與伊匹單抗聯(lián)合治療dMMR/MSI-H mCRC具有較好的安全性和顯著的臨床療效[14]。

后續(xù)深入研究顯示，在納入的119名患者中，25%、23%、19%、5%、5%和29%的患者分別經(jīng)歷內(nèi)分泌、胃腸道、肝臟、肺、腎臟和皮膚相關(guān)的不良反應(yīng)，大多數(shù)人(57%)是1或2級(jí)不良反應(yīng)，癥狀發(fā)生在早期[中位數(shù)發(fā)病時(shí)間(time to onset，TTO)5.2～12.6周]。非內(nèi)分泌相關(guān)不良反應(yīng)在大多數(shù)(>71%)患者中消退[中位數(shù)解決時(shí)間(time to resolution，TTR)1.5～9.0周]，使用免疫調(diào)節(jié)藥物(immune-modulating medication，IMM)改善了22%～56%患者的治療相關(guān)不良反應(yīng)[31]。

2.3.2 聯(lián)合共刺激分子抑制劑 采用MC38 CRC小鼠模型進(jìn)行活體成像技術(shù)和單細(xì)胞測序分析，發(fā)現(xiàn)CD40抑制劑可通過激活NF-κB通路使腫瘤對(duì)抗PD-1抗體治療增敏，并發(fā)現(xiàn)只有聯(lián)合治療的方案能取得顯著而持續(xù)的抗腫瘤作用[8]。采用CT26 CRC小鼠模型發(fā)現(xiàn)，抗4-1BB mIgG2a與去糖基化的抗PD-1抗體結(jié)合，治愈率達(dá)80%，而單一療法的治愈率僅為20%～25%，表明聯(lián)合治療或許可提高CRC的免疫治療效果[32]。

2.3.3 聯(lián)合溶瘤病毒 溶瘤病毒療法是使用一類具有復(fù)制能力的腫瘤殺傷型病毒，通過其連續(xù)復(fù)制最終殺滅腫瘤細(xì)胞的療法。有研究使用一種可表達(dá)CXCL11的牛痘病毒作為溶瘤病毒，發(fā)現(xiàn)在CRC小鼠中，相較單一使用抗PD-L1抗體，聯(lián)合療法可顯著增強(qiáng)療效，減輕腫瘤負(fù)荷并提高小鼠生存率[33]。研究發(fā)現(xiàn)，具有IL-15-IL-15Rα融合蛋白的溶瘤病毒與抗PD-1抗體的聯(lián)合使用可顯著消退CRC小鼠腫瘤，提高其存活率[34]。CSF-1R抑制劑(PLX3397)、溶瘤病毒和抗PD-1抗體的三聯(lián)組合可將免疫抑制性腫瘤微環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)槔诳鼓[瘤免疫的微環(huán)境，顯著控制小鼠腫瘤的生長，提高小鼠存活率[35]。溶瘤病毒VSV-IFN-β(表達(dá)IFN-β的溶瘤性水皰性口炎病毒)與抗PD-L1抗體聯(lián)用可延長CT26腫瘤小鼠的PFS[36]。以上動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果提示，抗PD-1/PD-L1抗體聯(lián)合溶瘤病毒是有前景的CRC療法。

2.3.4 聯(lián)合CAR-T療法 目前，抗PD-1抗體和CAR-T等療法均未在CRC中取得理想療效，且不同免疫抑制途徑的存在可能會(huì)阻礙CAR-T細(xì)胞療法，因而，聯(lián)合治療成為一種新的思路。在一項(xiàng)表達(dá)抗Her-2 CAR的原代小鼠T細(xì)胞研究中，阻斷PD-1可通過增加CAR-T細(xì)胞中的重要功能參數(shù)，增強(qiáng)CAR-T療效[37]。另一項(xiàng)研究中，研究者設(shè)計(jì)了可分泌抗PD-1抗體的CAR-T組成型細(xì)胞，觀察到連續(xù)分泌抗PD-1抗體對(duì)PD-1的阻斷作用在體內(nèi)外均減弱了抑制性T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，增強(qiáng)了T細(xì)胞的增殖和效應(yīng)功能，表明了二者聯(lián)合治療具有更好的效果[38]。此外，有研究表明，癌胚抗原CEA可作為CAR-T細(xì)胞治療CRC的一個(gè)良好靶點(diǎn)，一項(xiàng)針對(duì)CEA+CRC患者的Ⅰ期臨床試驗(yàn)觀察到，即使在高劑量作用下，癌細(xì)胞在接受細(xì)胞療法的CEA+CRC患者中也具有良好的應(yīng)答率，在大多數(shù)接受治療的患者中都觀察到較好的療效，這預(yù)示了這一靶點(diǎn)在治療CRC中的潛在作用，與其他類型的CAR-T細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)療效[39]。

2.4 聯(lián)合其他潛在治療手段

2.4.1 聯(lián)合靶向藥物 抗PD-1抗體納武利尤和帕博利珠的免疫治療以腫瘤微環(huán)境為目標(biāo)，聯(lián)合VEGF抑制劑貝伐單抗可提高mCRC患者生存率[40]。在CRC光化學(xué)療法中，EGFR抑制劑聯(lián)合抗PD-L1抗體免疫治療具有協(xié)同作用，一定程度上防止腫瘤復(fù)發(fā)[41]。

2.4.2 聯(lián)合m6A治療 研究發(fā)現(xiàn)YTHDF1缺陷型小鼠與WT小鼠相比，CD8+T細(xì)胞抗腫瘤反應(yīng)增強(qiáng)，CD8+T細(xì)胞中PD-L1表達(dá)上調(diào)。未經(jīng)治療的YTHDF1缺陷型小鼠和應(yīng)用抗PD-L1抗體治療的WT小鼠腫瘤消退程度僅為40%，抗PD-L1抗體處理的YTHDF1缺陷型小鼠的腫瘤消退程度可達(dá)100%。此外，腫瘤間質(zhì)中低表達(dá)YTHDF1的CRC患者腫瘤活檢組織中CD8+T細(xì)胞數(shù)量常高于YTHDF1高表達(dá)的患者，提示聯(lián)合使用調(diào)控m6A相關(guān)蛋白水平的藥物和抗PD-1/PD-L1藥物或許能夠提高CRC患者腫瘤消退程度[42]。

3 結(jié)語

PD-1/PD-L1免疫療法是極具前景的腫瘤免疫療法，通過阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路可使腫瘤細(xì)胞死亡，改善腫瘤患者預(yù)后。單一或聯(lián)合使用抗PD-1/PD-L1抗體都只對(duì)大部分dMMR/MSI-H mCRC患者顯示出較優(yōu)療效，而對(duì)MSS型CRC患者，效果均不佳。針對(duì)該“無效人群”的有效治療離不開腫瘤免疫研究的發(fā)展，如何進(jìn)一步通過聯(lián)合免疫療法提高CRC患者的療效并減少其副作用是未來研究的重要方向。