張志武，楊 菊，聶澤鋒，葉尚祥，董 旭，唐 淳

1. 中國(guó)科學(xué)院生物磁共振分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，波譜與原子分子物理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國(guó)科學(xué)院 精密測(cè)量科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新研究院），湖北 武漢 430071；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 華中科技大學(xué)武漢光電國(guó)家研究中心，湖北 武漢 430074；4. 北京分子科學(xué)國(guó)家研究中心，北京大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京大學(xué)，北京 100871

引 言

溫度是所有生命活動(dòng)的關(guān)鍵調(diào)控因素之一，它能夠影響基因表達(dá)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)之間相互作用等[1-5].因此，準(zhǔn)確測(cè)定生物體內(nèi)外的溫度，對(duì)于生物分子化學(xué)特性和功能的研究具有重要的意義.細(xì)胞作為生命有機(jī)體的基礎(chǔ)，由多個(gè)不同功能的單元組成，而正因?yàn)椴煌瑔卧墓δ芨鳟?，因此?xì)胞中不同區(qū)域的溫度也存在差異[2,3,6].例如，全身性炎癥通常伴有體溫變化，表現(xiàn)為發(fā)燒或體溫過(guò)低.這種體溫變化會(huì)直接影響細(xì)胞內(nèi)生物分子的活性[7,8].ATP在線粒體內(nèi)通過(guò)氧化還原呼吸鏈生成，而在此過(guò)程中產(chǎn)生的能量約有1/3以熱量方式消耗，因此線粒體的內(nèi)部溫度能夠超過(guò)50 ℃[9-11].目前，主流的分子溫度傳感器的開(kāi)發(fā)主要依托于溫度敏感的熒光蛋白質(zhì)和人工化合物，通過(guò)光學(xué)檢測(cè)來(lái)反推溫度[12,13].而在基于核磁共振（NMR）檢測(cè)的溫度傳感器方面，主要以RNA為檢測(cè)對(duì)象來(lái)進(jìn)行溫度測(cè)定[14].由此可見(jiàn)，分子溫度傳感器還存在較大的發(fā)展空間，而開(kāi)發(fā)能夠精確檢測(cè)生物樣品內(nèi)外溫度的傳感器有助于加深對(duì)細(xì)胞功能本質(zhì)的認(rèn)識(shí).

泛素（Ub）是一種廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)蛋白，它由5段β-片層與1段α-螺旋組成，具有穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)[15,16].Ser65被激酶PINK1磷酸化之后的泛素（pUb），在溶液中呈現(xiàn)兩個(gè)慢交換的穩(wěn)定構(gòu)象—伸展態(tài)和收縮態(tài)[17-22].舒展態(tài)pUb與未磷酸化Ub具有高度相似的空間結(jié)構(gòu).與舒展態(tài)pUb相比，收縮態(tài)pUb碳端的β-片層向氮端收縮了兩個(gè)氨基酸.更重要的是，除了構(gòu)象數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變化以外，Ser65磷酸化還增強(qiáng)了泛素對(duì)溶液pH的敏感性，因此pUb的兩種構(gòu)象比例會(huì)隨著溶液pH變化而變化[17,19,21].而我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)pUb兩種構(gòu)象的比例還受到溫度的調(diào)控，該特性能夠被用于溫度傳感器的開(kāi)發(fā).基于pUb對(duì)溫度的敏感性，我們開(kāi)發(fā)了一套19F化學(xué)標(biāo)記pUb的溫度傳感器，利用19F NMR檢測(cè)系統(tǒng)中pUb兩種構(gòu)象的比例，能夠快速精確地測(cè)定生物樣品的溫度.該系統(tǒng)不僅能夠用于檢測(cè)生物樣品的體外溫度，還有望延伸用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的溫度.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、還原型谷胱甘肽（L-glutathione reduced）購(gòu)自廣州賽國(guó)生物科技有限公司；D-glucose、氯化鈉（NaCl）、氯化鎂（MgCl2）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、葡萄糖購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母粉（Yeast extract）、胰蛋白胨（Tryptone）購(gòu)自O(shè)xoid公司；二硫蘇糖醇（DTT）購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；腺苷-5'-三磷酸二鈉鹽水合物（ATP·Na2·xH2O，配置為ATP母液）、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；15N標(biāo)記的氯化銨（15NH4Cl）購(gòu)自Sigma-Aldrich；3-溴-1,1,1-三氟丙酮（BFA）購(gòu)自北京百靈威科技有限公司.

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建、蛋白表達(dá)和純化

將人源Ub克隆到pET11a載體，然后采用QuikChange方法[23]分別引入D32C、K48C和Q62C突變（分別命名為D32C Ub、K48C Ub和Q62C Ub），大腸桿菌（BL21 star）細(xì)胞用于蛋白質(zhì)表達(dá)，首先將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（BL21 star）感受態(tài)細(xì)胞中，并采用稀釋涂布平板法涂布于細(xì)胞培養(yǎng)板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的10 mL Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、220 r/min搖床中培養(yǎng)，然后擴(kuò)大到1 L含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，待吸光光度值OD600=0.6~0.9時(shí)，加入0.5 mmol/L IPTG于37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h.表達(dá)穩(wěn)定同位素標(biāo)記的野生型Ub蛋白（15N-Ub）時(shí)，使用15NH4Cl和D-glucose作為大腸桿菌生長(zhǎng)的唯一氮源和碳源，并以M9培養(yǎng)基取代LB培養(yǎng)基.表達(dá)完成后收取菌液，使用Beckman離心機(jī)離心（5 000 rpm）10 min，收集沉淀.然后采用高壓勻質(zhì)儀高壓破碎重懸的菌液（20 mmol/L醋酸鈉，2 mmol/L DTT，pH 5.0），高速離心（20 000 rpm）20 min后取上清，先后采用SP-Sepharose Fast Flow陽(yáng)離子交換樹脂（GE Healthcare）和Sephacryl S100色譜柱（GE Healthcare）純化即可得到純化后的蛋白，液氮速凍后存于-80 ℃.

將磷酸化激酶PINK1克隆到pGEX-4T-1載體.大腸桿菌（BL21 star）細(xì)胞用于蛋白質(zhì)表達(dá)，采用200 μmol/L IPTG在20 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)16 h.PINK1蛋白的N端融合有GST（Glutathione S-transferase）標(biāo)簽，故采用Glutathione Sepharose 4B（GE Healthcare）初步純化，然后再經(jīng)過(guò)Sephacryl S100色譜柱（GE Healthcare）純化即可.PINK1蛋白的整個(gè)純化過(guò)程都在低溫條件下進(jìn)行，以保證酶的活性.

1.3 磷酸化蛋白的制備

將PINK1、15N-Ub（或D32C Ub、K48C Ub、Q62C Ub）、MgCl2和ATP以1:100:5 000:5 000的摩爾比在20 mmol/L Tris緩沖液（pH 8.0，含1 mmol/L DTT）中混合，于25 ℃水浴反應(yīng)12 h.然后使用Source Q柱（GE Healthcare）純化產(chǎn)物（磷酸化之后的蛋白質(zhì)樣品），并使用ESI-Q-TOF-MS（Agilent6530）測(cè)定精確分子量來(lái)確認(rèn).

1.4 19F化學(xué)標(biāo)記蛋白制備

配置含有5 mol/L BFA的DMSO溶液.通過(guò)脫鹽（Hi-Prep 26/10 Desalting柱，GE Healthcare）除去pUb半胱氨酸突變體緩沖液中（20 mmol/L醋酸鈉，100 mmol/L NaCl，2 mmol/L DTT，pH 5.0）的DTT.然后在20 mmol/L HEPES緩沖液（pH 7.4）中以1:10的摩爾比混合泛素和探針，在室溫25 ℃條件下反應(yīng)2 h.然后使用脫鹽（HiPrep 26/10脫鹽柱，GE Healthcare）從反應(yīng)混合物中純化產(chǎn)物（19F標(biāo)記的蛋白質(zhì)），并利用電噴霧-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（ESI-Q-TOF-MS，Agilent6530）測(cè)定精確分子量來(lái)確認(rèn).

1.5 NMR實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)處理

將所有用于NMR實(shí)驗(yàn)的蛋白樣品（15N-pUb、19F-D32C pUb、19F-K48C pUb和19F-Q62C pUb）溶于20 mmol/L HEPES緩沖液（pH 7.4，含150 mmol/L NaCl，5% D2O）.

1H-15N HSQC實(shí)驗(yàn)在配備了低溫探頭的Bruker 600型NMR譜儀上進(jìn)行.譜寬直接維F2為16 ppm，間接維F1為 25 ppm，采樣點(diǎn)數(shù)為t2×t1=2 048×256，1H-15N HSQC 數(shù)據(jù)采用 NMRPipe（version 2010.160.15.01）和CcpNmr（version 2.4.2）處理.

19F NMR實(shí)驗(yàn)均在配備了多通道低溫探頭的Bruker 600型NMR譜儀上進(jìn)行，通過(guò)溫度控制單元控制溫度梯度.19F共振頻率為564.39 MHz，譜寬為10 ppm，采樣點(diǎn)數(shù)為8 k.pUb的19F NMR譜圖中有兩個(gè)峰，分別對(duì)應(yīng)于兩個(gè)構(gòu)象狀態(tài)——松弛狀態(tài)和收縮狀態(tài).通過(guò)Bruker TopSpin 3.6.1對(duì)19F NMR的譜峰面積進(jìn)行積分.

測(cè)定19F核的T1采用的脈沖序列為t1ir，采樣次數(shù)為8，采樣點(diǎn)數(shù)為64 k，譜寬為20 ppm；測(cè)定T2采用的脈沖序列為cpmg，采樣次數(shù)為8，采樣點(diǎn)數(shù)為64 k，譜寬為20 ppm，其中D20為0.000 16 s.數(shù)據(jù)處理均在Bruker TopSpin 3.6.1上完成.

2 結(jié)果與討論

2.1 pUb的兩種構(gòu)象比例隨溫度的變化

我們首先采集了不同溫度下的15N-pUb的1H-15N HSQC譜圖.在10 ℃和25 ℃時(shí)，其HSQC譜圖[圖1(a)和1(b)]中的信號(hào)峰均超過(guò)120個(gè)，通過(guò)與已知文獻(xiàn)[22]進(jìn)行比對(duì)，將這些信號(hào)分別歸屬pUb的舒展態(tài)和收縮態(tài).但值得注意的是，不同溫度下兩種構(gòu)象的信號(hào)強(qiáng)度發(fā)生了變化：隨著溫度升高，收縮態(tài)比例升高，舒展態(tài)比例降低.這個(gè)現(xiàn)象說(shuō)明pUb兩種構(gòu)象比例受到溫度調(diào)控.1H-15N HSQC譜中氨基酸信號(hào)的譜峰強(qiáng)度與蛋白質(zhì)局部的弛豫特征息息相關(guān)，因此，當(dāng)使用信號(hào)面積進(jìn)行定量分析時(shí)往往會(huì)引入較大誤差.為了準(zhǔn)確定量，需要優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件.

圖1 15N-pUb樣品在(a) 10 ℃和(b) 25℃溫度下的1H-15N HSQC譜圖：當(dāng)溫度升高，舒展態(tài)（縮寫為rl）的信號(hào)強(qiáng)度降低，收縮態(tài)（縮寫為rt）的信號(hào)強(qiáng)度升高Fig. 1 1H-15N HSQC spectra of 15N-pUb sample at (a) 10 ℃ and (b) 25 ℃: When the temperature increases, the signal intensity of the relaxed state (rl) decreases, while the signal intensity of the retracted state (rt) increases

2.2 19F化學(xué)標(biāo)記對(duì)泛素結(jié)構(gòu)的影響

19F核的旋磁比與1H核相近，并且不存在于天然的生物大分子中，因此，利用19F NMR檢測(cè)19F化學(xué)標(biāo)記的蛋白質(zhì)，能夠采集到信噪比和分辨率均較高的19F NMR譜圖，并用于分析目標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)特征[24-27].為了完成19F的定點(diǎn)標(biāo)記，我們選取pUb的D32、K48和Q62位點(diǎn)分別進(jìn)行半胱氨酸突變，用于連接BFA探針[26][圖2(a)和2(b)].質(zhì)譜結(jié)果顯示pUb連接BFA探針后，19F-K48C pUb分子量為8 747.46 [圖2(c)]，與理論分子量加上一個(gè)水分子（8 729.86+18.02）一致，表明19F探針成功連接于指定位點(diǎn).通過(guò)比較BFA連接前后的pUb的1H NMR譜圖，可以發(fā)現(xiàn)19F化學(xué)標(biāo)記未影響pUb譜圖的輪廓[圖2(d)]，說(shuō)明連接BFA探針的pUb保持了天然形態(tài)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu).由此可以推斷，連接了BFA探針沒(méi)有改變pUb的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，連接BFA探針后的pUb的伸展態(tài)和收縮態(tài)的構(gòu)象比例仍然受到溫度的調(diào)控.

2.3 19F化學(xué)標(biāo)記位點(diǎn)的優(yōu)化

圖2 (a) pUb 舒展態(tài)和收縮態(tài)的示意圖，用于連接BFA探針的半胱氨酸突變位點(diǎn)（D32C、K48C、Q62C）使用球棍模型顯示，每次實(shí)驗(yàn)只突變其中一個(gè)；(b) BFA探針連接pUb突變體的示意圖，BFA通過(guò)取代反應(yīng)連接于pUb表面的半胱氨酸突變位點(diǎn)；(c)利用高分辨質(zhì)譜測(cè)得的19F-K48C pUb的分子量為8 747.46，與理論分子量與一個(gè)水分子的分子量之和一致；(d) 19F化學(xué)標(biāo)記K48C pUb前后的氨基氫的1H NMR譜，反應(yīng)前后其輪廓未發(fā)生明顯變化（25 ℃）Fig. 2 (a) pUbs in the relaxed state and retracted state are shown. The cysteine mutation sites (D32C, K48C, Q62C) for attachment of the BFA probe are displayed as ball and stick model, one mutation at each time; (b) Scheme of BFA reaction with pUb, BFA is connected to the cysteine mutation site on the surface of pUb through substitution reaction; (c) Mass spectrometry is used to confirm the reaction between BFA probe and K48C pUb, the result showed that the molecular weight of the protein after the reaction was 8 747.46, which was consistent with the sum of the theoretical molecular weight plus a water molecule; (d) The amino regions of 1H NMR spectra of K48C pUb before and after 19F chemical labeling, indicating no obvious change of the spectrum profile (25 ℃)

圖3 (a) 19F-D32C pUb、(b) 19F-K48C pUb和(c) 19F-Q62C pUb在25 ℃條件下的19F NMR譜圖Fig. 3 19F NMR spectra of (a) 19F-D32C pUb, (b) 19F-K48C pUb and (c) 19F-Q62C pUb at 25 ℃

我們分別對(duì)連接了BFA探針的pUb突變體，包括19F-D32C pUb、19F-K48C pUb和19F-Q62C pUb進(jìn)行了19F NMR實(shí)驗(yàn).一維19F NMR譜圖顯示19F-D32C pUb的信號(hào)為重疊的雙峰[圖3(a)]，說(shuō)明利用19F NMR能夠捕獲到pUb的兩種構(gòu)象，但是不同構(gòu)象的信號(hào)高度重疊，這可能與19F標(biāo)記位點(diǎn)距離磷酸化位點(diǎn)較遠(yuǎn)有關(guān).重疊的NMR信號(hào)為快速準(zhǔn)確地定量分析帶來(lái)嚴(yán)重干擾.與19F-D32C pUb相比，19F-K48C pUb和19F-Q62C pUb的信號(hào)均為兩個(gè)高分辨率的單峰[圖3(b)和3(c)].通過(guò)積分，獲得19F-K48C pUb和19F-Q62C pUb中兩種構(gòu)象的比例（舒展態(tài):收縮態(tài)）分別約為 50%:50%和60%:40%.19F-K48C pUb和19F-Q62C pUb之間構(gòu)象比例的差別可能與標(biāo)記位點(diǎn)有關(guān)：Q62C距離磷酸化位點(diǎn)較近，19F探針可能與磷酸根相互作用，進(jìn)而影響了其NMR特征，最終造成峰強(qiáng)上的區(qū)別.已發(fā)表文獻(xiàn)[19,21,22]指出在與本文相同溶液條件下pUb兩種狀態(tài)的比例約為5:5，因此19F-K48C pUb更能真實(shí)的反映出溶液中pUb構(gòu)象的比例，因此在接下來(lái)的研究中我們以19F-K48C pUb為模型開(kāi)發(fā)了溫度傳感器.本文還測(cè)定了19F-K48C pUb中舒展態(tài)T1為（327.73±1.35）ms，T2為（56.64±1.12）ms；收縮態(tài)T1為（331.61±2.18）ms，T2為（40.81±3.18）ms（圖 4，實(shí)驗(yàn)溫度為 25 ℃）.

圖4 (a) 19F-K48C pUb舒展態(tài)T1擬合；(b) 19F-K48C pUb收縮態(tài)T1擬合；(c) 19F-K48C pUb舒展態(tài)T2擬合；(d) 19F-K48C pUb收縮態(tài)T2擬合Fig. 4 (a) T1 fit for relaxed state of 19F-K48C pUb; (b) T1 fit for retracted state of 19F-K48C pUb; (c) T2 fit for relaxed state of 19F-K48C pUb; (d) T2 fit for retraced state of 19F-K48C pUb

2.4 19F-K48C pUb兩種構(gòu)象的比例隨溫度變化的19F NMR檢測(cè)

我們利用19F NMR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了不同溫度下19F-K48C pUb兩種構(gòu)象的比例.隨著溫度降低，低場(chǎng)區(qū)的信號(hào)強(qiáng)度逐漸升高[圖5(a)].該構(gòu)象轉(zhuǎn)換的現(xiàn)象與圖 1中所觀察到的現(xiàn)象一致，同時(shí)說(shuō)明低場(chǎng)區(qū)的信號(hào)來(lái)自于舒展態(tài)，高場(chǎng)區(qū)的信號(hào)則來(lái)自于收縮態(tài).通過(guò)對(duì)溫度梯度下不同信號(hào)的面積進(jìn)行積分[圖5(b)]，得知收縮態(tài)的構(gòu)象比例在5 ℃到35 ℃溫度區(qū)間由~40%上升至~60%，而舒展態(tài)的構(gòu)象比例則呈現(xiàn)出相應(yīng)的下降趨勢(shì).在變溫實(shí)驗(yàn)中，我們使用的pH 7.4的HEPES緩沖液.HEPES的pKa與溫度的關(guān)系（ΔpKa/℃）為-0.014[28]，因此當(dāng)溫度從5 ℃升高至35 ℃時(shí)，HEPES緩沖液的pH將從~7.7降至~7.3.已發(fā)表的文獻(xiàn)指出降低pH能夠增加舒展態(tài)比例，而升高pH則能夠增加收縮態(tài)比例[21].但是本文結(jié)果顯示：溫度升高（pH降低）時(shí)，收縮態(tài)的比例上升；而溫度降低（pH升高）時(shí)，舒展態(tài)比例上升.這種趨勢(shì)與上述文獻(xiàn)報(bào)道的相反，說(shuō)明本研究中溫度梯度中，19F-K48C pUb兩種構(gòu)象的比例變化反映的是溫度的影響.

圖5 (a)不同溫度下19F-K48C pUb的19F NMR譜圖；(b)兩種構(gòu)象的比例變化和溫度梯度之間呈線性Fig. 5 (a) The 19F NMR spectra of 19F-K48C pUb at different temperature; (b) The linear relationship between the ratio change of the two conformations and the temperature gradient

通過(guò)對(duì)溫度和構(gòu)象比例進(jìn)行擬合，我們發(fā)現(xiàn)pUb構(gòu)象比例變化與溫度梯度之間為線性關(guān)系，測(cè)定pUb構(gòu)象比例之后可以根據(jù)相關(guān)方程（收縮態(tài)：y=0.007x+0.342 6；舒展態(tài)y=-0.007x+0.657 4.y為構(gòu)象比例，x為溫度）計(jì)算對(duì)應(yīng)的溫度.從熱力學(xué)平衡的角度來(lái)看，從舒展態(tài)轉(zhuǎn)化到收縮態(tài)應(yīng)該是一個(gè)吸熱的一元反應(yīng)，因此平衡常數(shù)隨著溫度的變化而變化.

我們進(jìn)一步對(duì)該方程進(jìn)行了驗(yàn)證，測(cè)定了293.15 K下19F-K48C pUb的19F NMR譜圖（圖6），由圖中積分面積可計(jì)算出，此時(shí)收縮態(tài)比例為0.482 1，舒展態(tài)比例為0.517 8，分別代入舒展態(tài)和收縮態(tài)線性方程，計(jì)算得出此時(shí)溫度為19.93 ℃（293.08 K），與理論值的誤差為0.07 ℃，說(shuō)明該溫度傳感器在其可觀測(cè)范圍內(nèi)準(zhǔn)確性較高.

圖6 293.15 K下19F-K48C pUb的19F NMR譜Fig. 6 19F NMR spectrum of 19F-K48C pUb at 293.15 K

細(xì)胞內(nèi)NMR作為目前為數(shù)不多的蛋白質(zhì)原位檢測(cè)手段，能夠檢測(cè)反應(yīng)生物分子在天然環(huán)境中的結(jié)構(gòu)特征，而蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征與其所處環(huán)境溫度息息相關(guān).目前已發(fā)表的利用NMR檢測(cè)的溫度傳感器主要依托于RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)特定溫度的敏感性，但只能提供有限的溫度量程.而pUb具有較好的耐熱性，它的空間結(jié)構(gòu)的熔點(diǎn)約為70 ℃[22]，因此能夠用于檢測(cè)較大范圍的溫度變化.而且采用19F NMR檢測(cè)19F-pUb構(gòu)象比例的變化，并利用構(gòu)象比例的變化與溫度之間的關(guān)系（溫度每升高1 ℃，舒展態(tài)或者收縮態(tài)的比例將會(huì)下降或者升高~0.7%）可以直接反饋樣品溫度的變化，因此可作為一種基于NMR檢測(cè)的溫度傳感器.并且這種溫度傳感器不僅僅可以用于體外實(shí)驗(yàn)，還有望延伸至細(xì)胞內(nèi)的溫敏檢測(cè)，例如將19F-pUb轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)部，利用原位NMR檢測(cè)技術(shù)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)部溫度，助力揭示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系.

3 結(jié)論

本研究首先發(fā)現(xiàn)pUb的兩種構(gòu)象比例受到溫度影響而變化.基于該特征，本文開(kāi)發(fā)了一套基于NMR檢測(cè)的溫度傳感器.我們對(duì)pUb進(jìn)行了19F化學(xué)標(biāo)記，并利用19F NMR技術(shù)表征了不同溫度下pUb兩種構(gòu)象的比例，建立了構(gòu)象比例變化與溫度之間的關(guān)系，利用這一關(guān)系能夠很好的檢測(cè)溫度的變化.這溫度傳感器不僅可適用于基于NMR的體外溫度檢測(cè)，而且有望用于細(xì)胞內(nèi)溫度檢測(cè).

致謝

感謝國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃的支持（2017YFA0505400，2018YFA0507700）

利益沖突

無(wú)