陳曉雯，黃碧玲，黃少華＃，趙玉芬,2,3*

1. 寧波大學 新藥技術研究院，浙江 寧波 315211；2. 廈門大學 化學化工學院，福建省化學生物學重點實驗室，福建 廈門 361005；3. 清華大學 化學系，生命有機磷化學與化學生物學重點實驗室，北京 100084

引 言

蛋白質和核酸是組成生命體的重要生物大分子，它們各自具有結構特征和特定功能，二者間的相互作用構成了諸如生長、繁殖、運動、遺傳和代謝等生命現(xiàn)象的基礎，在整個基因組表達調控的過程中發(fā)揮著重要作用.作為一種重要的動態(tài)生物調節(jié)過程，蛋白質磷酸化是生物體內最普遍、最重要的一種蛋白質翻譯后修飾方式，具有非常重要的生物學意義[1].

磷酸化修飾可以改變蛋白質的構象、活性以及蛋白-蛋白間相互作用等，從而對信號傳導、基因表達、細胞分裂等生物學過程發(fā)揮重要的調控功能[2].目前，構成天然蛋白質的 20種氨基酸中有 9種氨基酸的側鏈可以發(fā)生磷酸化修飾，主要分為以下四種類型：O-磷酸化（以P-O鍵連接的磷酸化絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸）、N-磷酸化（以P-N鍵連接的磷酸化組氨酸、精氨酸和賴氨酸）、COO-磷酸化（以P-(CO)O鍵連接的磷酸化天冬氨酸或谷氨酸），以及S-磷酸化（以P-S鍵連接的磷酸化半胱氨酸）[3].由于O-磷酸化比較穩(wěn)定，易于檢測、分析，因此當前對于蛋白質磷酸化的研究主要集中于O-磷酸化[4].近年來，O-磷酸化蛋白激酶作為藥物靶點已被廣泛研究，基于這些研究，目前已經有30多種新藥被開發(fā)并成功上市[5].雖然相比于 O-磷酸化，N-磷酸化的研究才剛剛起步，但有研究[4]表明 N-磷酸化在生命過程中可能發(fā)揮著重要作用，因此亟需我們從多方面開展相關基礎研究，從而為后續(xù)新藥研發(fā)提供新的思路.

2009年，Clausen等[6]報道了枯草芽孢桿菌中的第一個也是目前唯一一個精氨酸激酶McsB.他們發(fā)現(xiàn)，當細菌響應熱刺激時，McsB磷酸化轉錄因子CtsR蛋白中結合clpC操縱子區(qū)域的Arg62（R）位點，導致CtsR與clpC操縱子發(fā)生解離，從而啟動clpC相關基因的轉錄.將R突變?yōu)樘於彼峄蚬劝彼岷?，突變體CtsR蛋白則不能結合clpC操縱子.由此說明位于CtsRβ轉角的R位點是調控相關基因轉錄的關鍵殘基.此外，他們解析了CtsR與clpC操縱子的復合物晶體結構，發(fā)現(xiàn)R側鏈結合于clpC操縱子的小溝.蛋白質精氨酸磷酸化不僅在調控相關基因轉錄過程中具有重要意義，而且作為被ClpCP蛋白酶降解的標簽，在蛋白質量控制中起關鍵作用[7].2012年，YwlE蛋白被鑒定為精氨酸磷酸酶，同時它也是McsB的互補調節(jié)蛋白[8]；2014年，Clausen等在敲除ywlE基因的枯草芽孢桿菌中鑒定出包含217個精氨酸磷酸化位點的134個蛋白，這些蛋白可能在細菌蛋白質量控制、基因轉錄調控、核酸修飾、核糖體功能等方面發(fā)揮重要作用[9]；2015年和2016年，鼠抗和兔抗的精氨酸磷酸化多克隆抗體相繼被開發(fā)[10,11]，盡管目前沒有應用的相關案例，但是可以預見抗體的開發(fā)將會給精氨酸磷酸化的生理功能研究帶來極大的便利[12].

蛋白質精氨酸磷酸化改變了精氨酸側鏈的電荷性質，即精氨酸側鏈由于共價連接了帶有負電荷的磷酸從而由正電荷轉變?yōu)樨撾姾?；同時磷酸化改變了蛋白構象，進而影響蛋白質與 DNA的相互作用，從而發(fā)揮調控基因轉錄的功能.然而，精氨酸磷酸化如何影響多肽或蛋白構象仍然未知，且精氨酸磷酸化調控CtsR中clpC操縱子結合區(qū)域（KRGGGG）與clpC操縱子相互作用的機制尚未完全清楚.目前研究蛋白質磷酸化主要使用質譜技術，而質譜需要對樣品進行酸化處理，這對于高能且不耐酸的P-N修飾是極其不利的，極易導致N-磷酸化的丟失.而用于核磁共振（NMR）檢測的樣品可保持在接近生理pH條件下，這對于不耐酸的精氨酸磷酸化的研究極為有利，而且 NMR技術可以研究動態(tài)過程，如磷酸化與去磷酸化過程等.

本文以轉錄因子CtsR中結合clpC操縱子的區(qū)域（KRGGGG）為研究對象（圖1），通過1H NMR、1H-1H COSY、1H-1H TOCSY、1H-15N HSQC以及1H-13C HSQC譜圖對該片段進行化學位移歸屬（化學位移的指認均對應圖1中的原子編號），以期通過獲得的NMR數(shù)據從原子水平為精氨酸磷酸化調控相關基因轉錄機制的研究提供可靠基礎.

圖1 KRGGGG肽段的結構Fig. 1 The structure of KRGGGG

1 實驗部分

1.1 試劑

含有內標物四甲基硅烷（TMS）的氘代水（D2O，氘代率為99.9%）購于青島騰龍微波科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（pH=6.33）由本課題組配制，分別稱量0.06 g的KH2PO4、0.36 g的Na2HPO4·2H2O、2 g的NaCl和0.05 g的KCl，將其溶解在200 mL去離子水中.

1.2 肽段和DNA片段樣品制備

KRGGGG肽段樣品委托上海生工生物工程有限公司合成并純化，溶于磷酸鹽緩沖液中，用于后續(xù)實驗.

clpC操縱子中與KRGGGG肽段結合的DNA片段委托上海生工生物工程有限公司合成，兩條互補單鏈DNA序列分別為5′-ATTAAGGTCAAA-3′和5′-TTTGACCTTAAT-3′，兩條單鏈DNA分別溶于去離子水，取相同體積混合至一起，在95 ℃的溫度下變性5 min后，再在室溫下退火2 h獲得雙鏈DNA（dsDNA）溶液，保存于-20 ℃?zhèn)溆?

1.3 電子圓二色譜（ECD）滴定實驗

使用JASCO-1700型ECD譜儀.將190 μL濃度為63.44 μmol/L DNA溶液置于1 mm比色皿中，以濃度為3 mmol/L KRGGGG溶液滴定DNA溶液.每次向DNA溶液中滴加2μL KRGGGG溶液，直至ECD信號不再變化，即滴定達到飽和.掃描波長范圍為200~320 nm，掃描速率為50 nm/min.

1.4 NMR實驗

向KRGGGG溶液中加入10%（V/V）D2O，最終配制成濃度為8.38 mmol/L的肽段溶液，轉移至外徑為2.5 mm的微量NMR樣品管中，全部NMR實驗均在配備了5 mmZ梯度場反向四共振超低溫探頭的Bruker Ascend 600 MHz譜儀上完成，實驗溫度恒定在298 K，由Bruker VT-200溫控器控制，控溫精度為 ±0.1 K.1H、13C和15N核的工作頻率分別為600.38、150.96和60.83 MHz，1H NMR譜寬為11 904.8 Hz.二維NMR實驗均采用Bruker標準脈沖序列，用zgwegp脈沖序列壓制溶劑水峰.其中1H-1H COSY譜脈沖序列選擇為cosydfesgpph，采樣數(shù)據點陣t2×t1=2 048×256，累加32次；1H-1H TOCSY譜脈沖序列選擇為mlevesgpph，采樣數(shù)據點陣t2×t1=2 048×256，累加32次；1H-15N HSQC譜脈沖序列選擇為hsqcfpf3gpphwg，采樣數(shù)據點陣t2×t1=2 048×256，累加32次；1H-13C HSQC譜脈沖序列選擇為hsqcfpf3gpphwg，采樣數(shù)據點陣t2×t1= 2 048×256，累加32次.對各自由感應衰減（FID）信號進行傅里葉變換，隨后對1H-1H COSY和1H-1H TOCSY譜圖使用窗函數(shù)QSINE進行處理；對1H-15N HSQC和1H-13C HSQC譜圖使用窗函數(shù)SINE進行處理.

1.5 NMR滴定實驗

向KRGGGG溶液中加入10% (V/V)的D2O，最終配置成濃度為1.07 mmol/L的肽段溶液，將200 μL KRGGGG溶液置于外徑為2.5 mm的微量NMR樣品管中，以濃度為5.35 mmol/L的DNA溶液在298 K溫度下滴定.每次向KRGGGG溶液中滴加2 μL DNA溶液，直至信號不再變化，即滴定達到飽和.

2 結果與討論

2.1 ECD實驗

雙鏈DNA具有特征性的CD信號，即存在206 nm和248 nm處的兩個負峰以及218 nm和274 nm處的兩個正峰，因此DNA的信號變化可用于表征DNA是否與其它分子存在相互作用.如圖2所示，隨著向DNA體系中不斷加入KRGGGG，位于206 nm處CD信號逐漸減弱；而位于248 nm處的CD信號則逐漸增強，表明KRGGGG的加入導致DNA的CD信號發(fā)生變化，說明兩者之間存在相互作用（后文將討論基于NMR數(shù)據分析所得到的二者相互作用信息）.因此，本文所研究的KRGGGG肽段與DNA相互作用，可作為研究轉錄因子與DNA相互作用模型肽.

圖2 KRGGGG滴定DNA的ECD光譜Fig. 2 ECD spectra of KRGGGG titration to DNA

2.2 1H核的歸屬

綜合分析該片段（KRGGGG）的1H NMR譜（圖3）和1H-1H TOCSY譜（圖4），可知δH8.83歸屬為R2-NHα.在1H-1H TOCSY譜中：δH1.83和4.38均與R2-NHα相關，由化學位移規(guī)律，δH1.83可歸屬為R2-Hβ，δH4.38可歸屬為R2-Hα；δH1.69、δH3.22與R2-Hα相關，可歸屬為R2-Hγ、Hδ；δH7.18與R2-Hδ相關，可歸屬出R2-NHε.1H-1H COSY譜（圖5）中，δH1.69與δH3.22的相關，以及δH1.83與δH1.69的相關，驗證了上述歸屬.

圖3 KRGGGG溶液的1H NMR譜Fig. 3 1H NMR spectrum of KRGGGG solution

圖4 KRGGGG溶液的1H-1H TOCSY譜Fig. 4 1H-1H TOCSY spectrum of KRGGGG solution

圖5 KRGGGG溶液的1H-1H COSY譜Fig. 5 1H-1H COSY spectrum of KRGGGG solution

由于G4與G5化學環(huán)境相同，δH8.37/8.38可歸屬為G4-NHα/G5-NHα；在1H-1H TOCSY譜中：δH4.01/4.02與G4-NHα，G5-NHα相關，可分別歸屬為G4-Hα/G5-Hα；同時G3，G4與G5的Hα也處于相似化學環(huán)境，因此G3-Hα應與G4-Hα/G5-Hα有相近的化學位移，于是δH3.98可歸屬為G3-Hα，在1H-1H TOCSY譜中，δH8.66與G3-Hα相關，可歸屬為G3-NHα；此外也獲得了δH3.83與δH8.08的相關信號，于是可以將δH3.83與δH8.08分別歸屬為G6-Hα和G6-NHα.

由于K1-Hα與K1-Hβ、Hγ、Hδ相關，從1H-1H TOCSY譜的局部圖可將δH4.07歸屬為K1-Hα.在1H-1H COSY譜中：δH1.92與K1-Hα相關，歸屬為K1-Hβ；δH1.45與K1-Hβ相關，歸屬為K1-Hγ；δH1.70與K1-Hγ相關，歸屬為K1-Hδ；δH3.01與K1-Hδ相關，歸屬為K1-Hε.

2.3 15N核的歸屬

在1H-15N HSQC（圖6）譜中：δN124.60與R2-NHα相關，歸屬為R2-NαH；δN111.72與G3-NHα相關，歸屬為G3-NαH；δN109.16/108.91與G4-NHα，G5-NHα相關信號，歸屬為G4-NαH，G5-NαH；δN114.16與G6-NHα相關，歸屬為G6-NαH；δN84.72與R2-NHε相關，歸屬為R2-NεH.

2.4 13C核的歸屬

在1H-13C HSQC譜（圖 7）中：δC42.54與 G4-Hα、G5-Hα、G3-Hα相關，歸屬為G4-Cα、G5-Cα、G3-Cα；δC43.00與G6-Hα相關，歸屬為G6-Cα；δC30.65與K1-Hδ相關，歸屬為K1-Cβ；δC21.04與K1-Hγ相關，歸屬為K1-Cγ；δC26.47與K1-Hδ相關，歸屬為K1-Cδ；δC39.35與K1-Hε相關，歸屬為 K1-Cε；δC28.12與R2-Hδ相關，歸屬為R2-Cβ；δC24.43與R2-Hγ相關，歸屬為 R2-Cγ；δC40.64與R2-Hδ相關，歸屬為R2-Cδ；δC52.90與K1-Hα相關，歸屬為K1-Cα（由于信號較弱，譜圖要切很低才能看到）；由于R2-Hα信號在實驗過程中信號被部分壓制，因此未獲得R2-Cα信號.

圖6 KRGGGG溶液的1H-15N HSQC譜Fig. 6 1H-15N HSQC spectrum of KRGGGG solution

圖7 KRGGGG溶液的1H-13C HSQC譜Fig. 7 1H-13C HSQC spectrum of KRGGGG solution

通過對以上NMR數(shù)據進行綜合分析，完成了轉錄因子CtsR中與DNA相互作用區(qū)域KRGGGG片段的1H NMR、13C NMR以及15N NMR信號歸屬，其詳細化學位移列于表1.

表1 KRGGGG片段的1H、13C以及15N化學位移Table 1 1H, 13C and 15N chemical shifts of KRGGGG

2.5 DNA滴定KRGGGG

為了進一步證明KRGGGG與DNA相互作用，我們進行了DNA滴定KRGGGG的NMR實驗（圖8）.

圖8 DNA滴定KRGGGG的1H NMR譜圖Fig. 8 1H NMR spectra of DNA titration to KRGGGG

從圖中可以看出，隨著DNA的不斷滴加，多肽的1H NMR信號逐漸發(fā)生變化.主鏈R2-NHα、G3-NHα，G4-NHα、G5-NHα和側鏈的 R2-NHε向低場移動；G6-NHα和側鏈 G6-Hα向高場移動.說明這些原子的化學環(huán)境發(fā)生改變，而這些變化源于它們與DNA的相互作用.

3 結論

本文通過綜合分析一維NMR譜圖以及多種同核和異核相關二維NMR譜圖，歸屬了枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）轉錄因子CtsR中clpC操縱子結合區(qū)域KRGGGG的1H、13C和15N化學位移，獲得了該肽段溶液結構的較為完整的NMR數(shù)據，為精氨酸磷酸化的調控機制研究提供了可靠科學的數(shù)據基礎.

致謝

感謝國家自然科學基金資助項目（91856126）以及福建省化學生物學重點實驗室（廈門大學）開放基金資助項目（2021001）對本文的資助.

利益沖突

無