石 武，任毅杰，趙夢潔，呂東良，劉衛(wèi)東，胡建宏,*

(1 .西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100；2. 陜西省安康市農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法支隊)

殼聚糖是生命體中重要的堿性多糖，又被稱為幾丁聚糖、甲殼胺、甲殼素等，其結(jié)構(gòu)類似于纖維素等大分子，且自身的游離氨基酸具有還原性，因此殼聚糖具有調(diào)節(jié)免疫力、改善胃腸道和降血脂等功能，并逐漸用于醫(yī)藥、食品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的研究。苗志國等研究發(fā)現(xiàn)，向育肥豬飼糧中添加0.02%的膨化殼聚糖微粒能夠顯著改善育肥豬的屠宰性能、提高育肥豬背最長肌營養(yǎng)成分和肌肉中氨基酸含量，并通過影響肌肉中風(fēng)味氨基酸和不飽和脂肪酸的組成與含量來改善豬肉品質(zhì)和豬肉的風(fēng)味。謝東淇研究發(fā)現(xiàn)，將0.1 g/L殼聚糖添加于豬精液常溫保存稀釋液并保存6 d后的精子活率為61.56%，顯著提高了精子的質(zhì)膜、頂體完整率和T-AOC活性，同時精液中的MDA含量和細(xì)菌含量顯著降低。許國林通過向公豬精液稀釋液中添加慶大霉素發(fā)現(xiàn)，試驗組的精子存活時間和頂體完整率顯著高于對照組，且輸精后試驗組母豬的受胎率為91.05%，顯著高于對照組母豬的受胎率82.11%，證明慶大霉素在豬精液保存稀釋液中作為添加劑具有一定的應(yīng)用價值。黃俻華的研究發(fā)現(xiàn)，在豬精液稀釋液中添加300 μg/mL的維生素C能夠顯著提高凍后精子的體外存活時間以及CAT酶活；添加600 μg/mL的維生素C可以顯著提高解凍精子的活力、線粒體活性、質(zhì)膜和頂體完整性、存活時間以及抗氧化物酶的活性，同時明顯降低精子畸形。本研究旨在通過向豬精液常溫保存稀釋液中添加適當(dāng)濃度的殼聚糖、慶大霉素和維生素C來探究其對精液品質(zhì)的影響，并對其保存效果進(jìn)行比較分析，以期發(fā)現(xiàn)能夠替代抗生素且具有良好抗氧化性能的新型添加劑。

我國是養(yǎng)豬大國，豬肉在我國居民飲食消費(fèi)中占據(jù)重要的地位。隨著畜牧業(yè)的不斷發(fā)展，豬人工授精技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生豬養(yǎng)殖，并使生豬養(yǎng)殖企業(yè)的生產(chǎn)效益得以提升。精液保存是豬人工授精技術(shù)的核心環(huán)節(jié)，目前在生產(chǎn)實踐中已經(jīng)取得了重大進(jìn)展。然而，隨著精液保存時間的延長，精子會由于自身代謝而產(chǎn)生ROS，大量的ROS堆積會引起精子質(zhì)膜脂質(zhì)過氧化，使其通透性發(fā)生改變，嚴(yán)重時發(fā)生破損，進(jìn)而導(dǎo)致精子結(jié)構(gòu)完整性被破壞和運(yùn)動性能降低。同時，豬精液中營養(yǎng)物質(zhì)豐富、pH適宜等特點使其成為微生物繁殖的良好環(huán)境，而細(xì)菌污染導(dǎo)致精液保存時間縮短和品質(zhì)下降。因此，氧化應(yīng)激和細(xì)菌污染是公豬精液常溫保存所面臨的兩大重要障礙，故而如何保障與進(jìn)一步提升在常溫條件下保存的精液品質(zhì)仍是大型豬場亟需解決的重要問題。基于此現(xiàn)狀，本研究將0.1 g/L殼聚糖添加到豬精液常溫保存配方中，并與0.25 g/L慶大霉素、0.068 g/L維生素C添加到精液中的保存效果進(jìn)行對比，通過檢測豬精液常溫保存第1～6 d的豬精子活力、質(zhì)膜完整率、頂體完整率和凋亡水平來確定最適濃度的殼聚糖是否可以取代傳統(tǒng)抗生素對精液保存的效果，以期為新型、長效豬精液常溫保存配方的研發(fā)提供一定的試驗支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與精液采集

本試驗所采用的試驗動物均為西北農(nóng)林科技大學(xué)畜牧站種豬養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的10頭成年的健康的且營養(yǎng)狀況良好的大白公豬。每次的采精時間固定在上午9：30至10：30之間，間隔時間為兩天采集1次，一周之內(nèi)采精不超過3次。采精過程均由試驗站工作人員采集，方法為手握刺激法，采精結(jié)束后用專用濾紙進(jìn)行過濾，濾去精皮及其他雜質(zhì)，確保精液干凈無污染。采精過程結(jié)束后將精液簡易處理迅速前往實驗室進(jìn)行下一步的試驗。

1.2 精液處理與保存

對采集的精液進(jìn)行評估，包括顏色、氣味等，一般剛采集的原精為帶有腥臭味的乳白色液體。使用血細(xì)胞計數(shù)版對精子密度進(jìn)行評估并計算精子密度。利用精子自動分析儀對精子的活力進(jìn)行檢測，檢測合格后方可進(jìn)行下一步試驗研究。將配制好的Modena緩沖液和殼聚糖溶液放在37 ℃的恒溫水浴加熱5 min，取4支滅菌后的5 mL試管并依次編號，分別加入不同種類的抗氧化劑溶液共2.5 mL，使抗氧化劑的濃度分別是0、殼聚糖(0.1 g/L)、慶大霉素(0.25 g/L)、維生素C(0.068 g/L)。再將精液分裝到4個干凈的5 mL試管中，每管添加新鮮精液2.5 mL，將之前配置的不同種類的抗氧化劑溶液沿著試管壁緩緩倒入精液中，對精液進(jìn)行1∶1同等體積的稀釋。將做好標(biāo)記的試管用透氣干凈的毛巾包裹4～5層，放于17 ℃恒溫保存箱中保存，每隔10～12 h緩慢翻滾一次精液，使沉淀精子混合均勻。

1.3 豬精液精子活力的檢測

取出150 μL精液于200 μL的小試管中，將精液置于37 ℃水浴鍋中加熱5 min，向提前預(yù)熱好的潔凈的載玻片上滴加10～20 μL的精液，緩慢蓋上蓋玻片，置于37 ℃的恒溫加熱板上，調(diào)節(jié)顯微鏡的焦距，對準(zhǔn)精子視野用CASA系統(tǒng)進(jìn)行精子活力的檢測，每支精液樣品隨機(jī)選擇5個視野，每個視野中的精子數(shù)在200個以上，結(jié)果取其平均值。

1.4 豬精液質(zhì)膜完整率的檢測

采用SYBR-14/PI熒光染色法對豬精液常溫保存第1～6 d的精子質(zhì)膜完整率進(jìn)行檢測。

1.5 豬精液頂體完整率的檢測

采用FITC-PNA熒光染色法對豬精液常溫保存第1～6 d的精子頂體完整率進(jìn)行檢測。

1.6 豬精子凋亡水平的檢測

利用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒對豬精液常溫保存第1～6 d精子凋亡水平進(jìn)行檢測。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，利用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)單因素方差分析(One-way ANOVA)，并利用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，最終數(shù)據(jù)以Mean ± SD表示。P< 0.05表示差異顯著，P> 0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖、慶大霉素及維生素C對豬精子活力的影響

通過CASA系統(tǒng)分析精子活率，如表1所示，三組精子活力在保存6 d后均高于對照組。但在殼聚糖和慶大霉素組中，精子運(yùn)動性能強(qiáng)于維生素C組和對照組，稀釋液中添加0.1 g/L的殼聚糖組精子活動力僅次于慶大霉素組。在保存6 d后，0.25 g/L慶大霉素組的精子活力(62.17%)和0.1 g/L的殼聚糖組(61.67%)顯著高于其他組(P<0.05)，表明加入0.1 g/L的殼聚糖可以保護(hù)精子質(zhì)量，減緩精子活力下降。

表1 不同種類的添加劑對豬精子活力的影響 %

2.2 殼聚糖、慶大霉素及維生素C對豬精子質(zhì)膜完整率的影響

殼聚糖對豬精子質(zhì)膜完整率的影響如表2所示，稀釋液中添加0.1 g/L殼聚糖、0.25 g/L慶大霉素的精子質(zhì)膜完整率顯著提高。常溫保存6 d后，稀釋液中添加0.1 g/L殼聚糖組精子質(zhì)膜完整率為68.67%，僅次于慶大霉素組，顯著高于對照組(P< 0.05)。表明添加0.1 g/L的殼聚糖可以在一定程度上替代慶大霉素，提高豬精子質(zhì)膜完整率。

表2 不同種類的添加劑對豬精子質(zhì)膜完整率的影響 %

2.3 殼聚糖、慶大霉素及維生素C對豬精子頂體完整率的影響

殼聚糖對精子頂體完整率的影響如表3所示。保存5 d后，與其他組相比，稀釋液中添加0.25 g/L的慶大霉素組與添加0.1 g/L殼聚糖組的精子頂體完整率顯著改善。保存6 d后，添加0.25 g/L的慶大霉素組精子頂體完整率為75.17%，顯著高于其他組(P< 0.05)。表明添加0.1 g/L的殼聚糖可以在一定程度上替代慶大霉素，提高豬精子頂體完整率。

表3 不同種類的添加劑對豬精子頂體完整率的影響 %

3 討論

精子活力、質(zhì)膜、頂體完整性對精子至關(guān)重要，影響人工授精的受精率。慶大霉素是較常用的抗生素之一。Schulze等研究表明，慶大霉素對精液內(nèi)細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用，其處理后的精子活力、頂體、質(zhì)膜完整性均高于對照組。維生素C是常用的抗氧化劑，瞿靜雯等等研究表明在山羊精液冷凍稀釋液中添加維生素C，可以提高精子活率、頂體完整率和存活時間。同樣在豬上也得到了相似的結(jié)論，任子利等研究發(fā)現(xiàn)，將5.0 g·L-1維生素C添加到改良的豬精液稀釋液中能夠顯著提高精子活力、頂體完整率和質(zhì)膜完整率，并且明顯降低4 ℃保存時的精子畸形率和對藏豬精液精子全基因組DNA甲基化的影響。本試驗結(jié)果表明，在豬精液常溫保存稀釋液中添加殼聚糖可以有效提高豬精子活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率，且效果介于慶大霉素和維生素C之間。

優(yōu)良的豬精液保存效果是在生產(chǎn)實踐中推廣人工授精技術(shù)的關(guān)鍵，然而豬精液中營養(yǎng)物質(zhì)豐富、pH適宜等特點使其成為微生物繁殖的良好環(huán)境。因此，在豬精液保存稀釋液中加入適宜濃度的抗菌物質(zhì)能夠抑制精液中微生物的生長和繁殖，進(jìn)而延長精液的保存時間，并改善精液的保存效果。本研究表明殼聚糖添加組和慶大霉素添加組最能提高精子活力，且兩者在保存2 d內(nèi)差異不顯著，說明殼聚糖可能通過抗菌途徑來提高精液保存質(zhì)量。殼聚糖組合慶大霉素組的質(zhì)膜完整率和頂體完整率均高于對照組和維生素C添加組，而且在保存過程中維生素C添加組和對照組之間也是差異顯著的。與本研究結(jié)果相似，Chang-Bum等發(fā)現(xiàn)殼聚糖能夠在一定程度上保護(hù)被H2O2損傷的肝細(xì)胞，這是因為殼聚糖作為天然堿性多糖能夠在生物體內(nèi)外通過激活Nrf2通路來誘導(dǎo)相關(guān)抗氧化酶基因表達(dá)，進(jìn)而在一定程度上抵抗細(xì)胞的氧化損傷。高晶晶等的研究發(fā)現(xiàn)，從蝦蟹殼中提取的殼聚糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力，能夠清除生物體細(xì)胞內(nèi)的二苯基苦基苯肼自由基和羥自由基，這與本試驗結(jié)果不同。本試驗結(jié)果表明，維生素C清除羥自由基和二苯基苦基苯肼自由基的能力強(qiáng)于殼聚糖，這可能由于殼聚糖分子量不同導(dǎo)致。Kyung等分別采用DPPH自由基清除能力法及硫代巴比妥酸法評價了殼聚糖分子質(zhì)量分別為3×104、9×104、12×104U的抗氧化性能，發(fā)現(xiàn)3×104U的殼聚糖抑制脂質(zhì)過氧化的效果更強(qiáng)。同樣，Hisao等分別研究了7種不同分子質(zhì)量的殼聚糖在細(xì)胞內(nèi)和體外兩種環(huán)境下的抗氧化性，發(fā)現(xiàn)高分子質(zhì)量殼聚糖處理組的抗氧化性能效果不佳，而低分子質(zhì)量殼聚糖處理后的血漿蛋白發(fā)生過氧化的程度明顯降低，在對ABTS自由基和DPPH自由基的測試中，也表現(xiàn)出了同樣的規(guī)律。在本研究中，殼聚糖能夠提高豬精子活力的原因可能是因為其作為一種抗氧化劑，能較好地去除精液保存過程中的超氧陰離子，維持細(xì)胞表面雙分子層的穩(wěn)定性，從而減少精子保存過程中所遭受的氧化損傷，提高了精子質(zhì)膜的完整性，從而改善精液質(zhì)量。

生物體內(nèi)的氧化性因素能夠直接作用于精子細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度迅速升高，引起ATP的嚴(yán)重不足，導(dǎo)致NADH、GSH、脂類等相關(guān)物質(zhì)發(fā)生氧化以產(chǎn)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而誘導(dǎo)精子細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，而ROS作為氧化應(yīng)激的標(biāo)志物處于精子凋亡過程的中心信號位置。目前的研究表明，抗氧化劑能夠有效的調(diào)節(jié)動物機(jī)體氧化還原平衡，減緩或抑制細(xì)胞內(nèi)自由基的生成而減少氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，進(jìn)而減少了因氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡。殼聚糖的抗氧化性可能是由于分子鏈上的活性氨基和羥基，而低分子質(zhì)量殼聚糖與高分子質(zhì)量殼聚糖相比具有更好的溶解性，使得活性官能團(tuán)易于與自由基作用，且殼聚糖內(nèi)含有大量氫鍵，高分子殼聚糖內(nèi)氫鍵結(jié)合將對緊密，降低了氨基基團(tuán)和羥基基團(tuán)與外界反應(yīng)的活性，而低分子質(zhì)量殼聚糖結(jié)構(gòu)相對松散，分子內(nèi)氫鍵相對較弱。殼聚糖可能通過MAPK途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)，c-Jun氨基末端激酶和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，抑制了激活蛋白，減緩機(jī)體抗氧化應(yīng)激。這是因為殼聚糖增強(qiáng)體內(nèi)清除多余自由基的能力，以維持自由基產(chǎn)生和清除的平衡，減少自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而使MDA含量降低，起到保護(hù)豬精子的作用。然而，本試驗中殼聚糖如何提升精液常溫保存質(zhì)量仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

稀釋液中添加0.1 g/L殼聚糖組保存6 d后豬精子活力為61.67%，質(zhì)膜完整率為68.67%，頂體完整率為72.67%，表明殼聚糖可以在一定程度上提高常溫保存條件下的豬精液質(zhì)量。